In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

Zusammenfassung

Differenzierung und Reifung von Megakaryozyten erfolgen in enger Verbindung mit den zellulären und extrazellulären Komponenten des Knochenmarks. Diese Prozesse sind durch das allmähliche Auftreten essentieller Strukturen im Megakaryozytenzytoplasma wie einem polyploiden und polylobulierten Kern, einem internen Membrannetzwerk namens Demarkationsmembransystem (DMS) und den dichten und Alpha-Granula, die in zirkulierenden Blutplättchen gefunden werden, gekennzeichnet. In diesem Artikel beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für die in situ ultrastrukturelle Untersuchung von murinen Megakaryozyten mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), das die Identifizierung von Schlüsselmerkmalen ermöglicht, die ihr Reifestadium und ihre Zelldichte im Knochenmark definieren. Knochenmark wird gespült, fixiert, in Ethanol dehydriert, in Kunststoffharz eingebettet und zur Erzeugung von Querschnitten montiert. Halbdünne und dünne Schnitte werden für histologische bzw. TEM-Beobachtungen hergestellt. Diese Methode kann für jede Knochenmarkzelle in jeder EM-Einrichtung verwendet werden und hat den Vorteil, dass kleine Stichprobengrößen verwendet werden, die die Kombination mehrerer Bildgebungsansätze auf derselben Maus ermöglichen.

Einleitung

Megakaryozyten sind spezialisierte große polyploide Zellen, die im Knochenmark lokalisiert sind und für die Thrombozytenproduktion verantwortlich sind¹. Sie stammen aus hämatopoetischen Stammzellen durch einen komplizierten Reifungsprozess, bei dem Megakaryozytenvorläufer zunehmend an Größe zunehmen, während sie gleichzeitig umfangreiche morphologische Veränderungen im Zytoplasma und im Zellkern erfahren². Während der Reifung entwickeln Megakaryozyten eine Reihe von unterscheidbaren Strukturelementen, darunter: ein polylobulierter Kern, Einfärbungen der Oberflächenmembran, die das Demarkationsmembransystem (DMS) bilden, eine periphere Zone ohne Organellen, die vom Aktin-basierten Zytoskelettnetzwerk umgeben ist, und zahlreiche Organellen, darunter α-Granula, dichte Granula, Lysosomen und mehrere Golgi-Komplexe. Auf der ultrastrukturellen Ebene ist eine wesentliche Beobachtete Modifikation die zytoplasmatische Kompartimentierung in diskrete Regionen, die durch das DMS³begrenzt werden. Diese umfangreiche Versorgung mit Membranen wird die Verlängerung langer zytoplasmatischer Prozesse in der Anfangsphase der Thrombozytenproduktion vorantreiben, die sich dann im Kreislauf in Blutplättchen umwandeln. Jeder Defekt während der Megakaryozytendifferenzierung und -reifung kann die Thrombozytenproduktion in Bezug auf die Thrombozytenzahl und / oder die Thrombozytenfunktion beeinflussen.

Die Dünnschichttransmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist seit Jahrzehnten der bildgebende Ansatz der Wahl und bietet eine qualitativ hochwertige Ultrastruktur von Megakaryozyten, die unser Verständnis der Physiologie der Thrombopoese geprägt haben^4,5. Diese Arbeit konzentriert sich auf eine standardisierte TEM-Methode, die es ermöglicht, den Prozess der Thrombozytenbiogenese in situ innerhalb der nativen Knochenmark-Mikroumgebung zu erfassen, die auch als Grundlage für die Analyse eines beliebigen Knochenmarkzelltyps dienen könnte. Wir liefern ultrastrukturelle Beispiele für die Entwicklung von Megakaryozyten von unreif bis voll ausgereift, die zytoplasmatische Prozesse in die Mikrozirkulation von Sinusoiden ausdehnen⁶. Wir beschreiben auch ein einfaches Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Megakaryozyten-Reifungsstadien, das die Regenerations- und Thrombozytenproduktionskapazität des Knochenmarks anleitet.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt. Das Protokoll ist in Abbildung 1schematisch dargestellt.

1. Knochenmarkentnahme und -fixierung ( Abbildung 1A)

VORSICHT: Dieses Verfahren umfasst krebserzeugende, erbgutverändernde und/oder toxische Substanzen und wird unter einer chemischen Extraktionshaube durchgeführt. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen.

1. Die fixierende Lösung bestehend aus 2,5% Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer herstellen (siehe Ergänzungsdatei).
2. Knochenmarksammlung
   1. Verwenden Sie erwachsene C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 12 bis 18 Wochen. Euthanasierung der Mäuse durch CO2-Erstickung und zervikale Luxation.
   2. Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut um den Oberschenkel und schälen Sie die Haut mit einer Pinzette ab. Entfernen Sie die Extremität der Pfote und schneiden Sie dann zwischen Hüfte und Oberschenkel. Lösen Sie die Tibia vom Femur, indem Sie an der Knieartikulation schneiden und adhärentes Gewebe an Tibias und Femuren mit einem Skalpell entfernen.
   3. Entfernen Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge. Während Sie den Femur mit einer Pinzette halten, verwenden Sie eine 5 ml Spritze, die mit Cacodylatpuffer mit einer 21 G Nadel gefüllt ist, um das Knochenmark in ein 15 ml Röhrchen zu spülen, das mit 2 ml Cacodylatpuffer gefüllt ist. Führen Sie dazu die Abschrägung der Nadel in die Knochenmarköffnung ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, bis das Mark ausgestoßen ist.
3. Knochenmarkfixierung durch schnelles Eintauchen in Fixiermittel.
   1. Unmittelbar nach dem Spülen wird der Knochenmarkzylinder mit einer Kunststoffpipette für 60 min bei Raumtemperatur in 1 ml frische Glutaraldehyd-Fixierlösung (zuvor in 1.1 hergestellt) überführt.
      HINWEIS: Um das Gewebe zu erhalten, stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess, von der Knochendissektion bis zum Fixationsschritt, in weniger als 10 Minuten abgeschlossen ist. Stellen Sie für die Fixierung sicher, dass die Fixierlösung Raumtemperatur hat, um einen Hitzeschock zu vermeiden.

2. Einbetten von Knochenmark in Agarose

HINWEIS: Knochenmarkgewebe ist nicht ausreichend kohäsiv, um seine Integrität während der verschiedenen Waschschritte aufrechtzuerhalten, und Material kann leicht verloren gehen. Um dieses Problem zu überwinden, wird das Mark vor der Austrocknung mit einem Agargel bedeckt.

1. Bereiten Sie die Agaroselösung wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.
2. Waschen Sie das feste Mark aus Abschnitt 1.3 in Cacodylatpuffer und geben Sie es vorsichtig mit einer Kunststoffpipette auf einen Glasträger. Tragen Sie mit einer warmen Pipette schnell einen Tropfen 2% flüssiges Agar auf den Knochenmarkzylinder auf.
   HINWEIS: Das Agar erstarrt beim Abkühlen schnell. Um eine homogene Abdeckung des Knochenmarks zu gewährleisten, muss die Agarlösung warm gehalten werden, bis sie sich auf dem Objektträger ablagert.
3. Legen Sie die Rutsche schnell schnell auf Eis, bis sich das Agar erstarrt (1-2 min).
4. Verwenden Sie unter einem Mikroskop eine scharfe Rasierklinge, um die Extremitäten des Knochenmarkzylinders wegen der möglichen Gewebekompression in diesen Bereichen zu schneiden und zu verwerfen. Übertragen Sie die Markblöcke in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 1 ml Cacodylatpuffer enthalten.

3. Einbetten von Knochenmark in Harz

VORSICHT: Harzbestandteile sind giftig; einige sind krebserregend und müssen vorsichtig unter einer chemischen Absaugung gehandhabt werden. Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrillen. Osmiumtetroxid ist bei Raumtemperatur sehr flüchtig und seine Dämpfe sind sehr schädlich für Augen, Nase und Rachen. Vor der Entsorgung müssen 2% Osmiumtetroxid durch Zugabe des doppelten Volumens an Pflanzenöl neutralisiert werden.

1. Bereiten Sie das Epoxidharz wie in der Ergänzungsdateibeschrieben vor.
2. Harzeinbettung
   HINWEIS: Bewahren Sie die Proben während der Inkubationen in aufeinanderfolgenden Bädern von Osmium, Uranylacetat und Ethanol in denselben Mikrozentrifugenröhrchen auf. Aspirieren Sie die Überstände mit einer Pasteurpipette. Das Volumen der für jedes Bad verwendeten Lösung muss mindestens dem 10-fachen volumen der Probe entsprechen.
   1. Die Blöcke mit 1% Osmium im Cacodylatpuffer für 1 h bei 4 °C fixieren, einmal im Cacodylatpuffer und dann einmal in destilliertem Wasser waschen.
   2. Mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 1 h färben, zweimal in destilliertem Wasser waschen.
   3. Dehydrieren Sie durch eine abgestufte Reihe von Ethanol in destilliertem Wasser: 4 mal in 75% Ethanol für 5 min, gefolgt von 3 mal in 95% Ethanol für 20 min und dann 3 mal in 100% Ethanol für 20 min. Nehmen Sie bei diesem Schritt eine Spritze Epoxidharz aus dem Gefrierschrank.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in 100% Ethanol für 1 h pausiert werden.
   4. Um eine gleichmäßige Infiltration und Polymerisation von Epoxidharz im Mark zu erhalten, inkubieren Sie zuerst die Blöcke in 2 aufeinanderfolgenden Propylenoxidbädern für 15 min.
   5. Fügen Sie eine 1: 1-Mischung aus 100% Propylenoxid und Epoxidharz hinzu und inkubieren Sie für 1 h. Legen Sie die Proben auf einen langsamen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur.
   6. Fügen Sie 100% Epoxidharz hinzu und lassen Sie die Probe über Nacht unter Rühren inkubieren.
   7. Fügen Sie 100% Epoxidharz für 2 h Inkubation hinzu, noch unter Rühren.
   8. Legen Sie die Markblöcke unter einem Mikroskop in flache Silikonformen. Orientieren Sie die Proben so, dass eine anschließende Querschnittung des gesamten Knochenmarks möglich ist. Füllen Sie die Formen mit Epoxidharz und stellen Sie sie 48 h lang bei 60 °C ab.
      HINWEIS: Alle Lösungen (außer Ethanol und Propylenoxid) werden durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Um eine ausreichende Polymerisation des Harzes zu gewährleisten, vermeiden Sie Blasen beim Füllen der Formen.

4. Ultradünne Schnitte (Abbildung 1B)

HINWEIS: Die Transmissions-EM erfordert dünne Gewebeschnitte, durch die Elektronen hindurchgehen können, um ein Projektionsbild des Inneren von Zellen, der Struktur und Organisation der inneren Organellen (Granula, endoplasmatisches Retikulum, Golgi) und der Anordnung der intrazellulären Zellmembranen zu erzeugen.

1. Montieren Sie den Probenblock in einer Ultra-Mikrotomstütze. Legen Sie es auf den Probenhalter. Schneiden Sie die Proben auf 45° ab, um den Überschuss an Harz um das Gewebe mit einem rotierenden Diamant- oder Wolframfräser zu entfernen.
2. Montieren Sie die Proben auf dem Ultramikrotom mit einer Diamantmesserklinge, die mit einem Wassertank ausgestattet ist. Schneiden Sie Querschnitte von 500 nm bzw. 100 nm Dicke für histologische bzw. TEM-Analysen. Sammeln Sie schwimmende Abschnitte auf der Wasseroberfläche mit einer Schlaufe.
3. Legen Sie den 500 nm dicken Abschnitt auf einem Glasobjektträger und die 100 nm dicken Abschnitte auf 200-mesh-Dünnstab-Kupfergittern mit einem Papierfilter darunter ab. Bereiten Sie fünf Gitter für eine Bedingung vor: Färben Sie zuerst zwei Gitter und behalten Sie die drei verbleibenden Gitter bei Bedarf als Backup.

5. Toluidinblaufärbung für die Histologie

HINWEIS: Das Färben von Abschnitten für die Histologie ist aus drei Gründen wichtig: 1) um sicherzustellen, dass das Gewebe tatsächlich geschnitten wird und nicht das Harz, 2) um die Qualität des Einschlusses zu überprüfen, und 3) um die Knochenmarkprobe schnell zu bewerten. Wenn dies nicht korrekt ist, schneiden Sie tiefer in den Block.

1. Trocknen Sie die halbdünnen Schnitte auf einer Heizplatte (60 °C).
2. Filtriertes 1% Toluidinblau/1 % Natriumborat in destilliertem Wasser auf die Objektträger geben und auf einer Heizplatte (60 °C) für 1-2 min erhitzen. Waschen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser und lassen Sie sie auf der Wärmeplatte trocknen.
3. Befestigen Sie Abschnitte auf Deckgläsern mit einem Tropfen Poly(butylmethacrylat-co-methylmethacrylat) Montagemedium und untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop.

6. Schwermetallfärbung zur TEM-Beobachtung (Abbildung 1C)

HINWEIS: Für den Kontrast wird die Oberseite der Gitter auf 100 μL Tropfen jedes nachfolgenden Bades mit einer Schlaufe invertiert. Vor der Verwendung wird jede Lösung 0,22 μm gefiltert. Entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss zwischen den einzelnen Bädern, indem Sie vorsichtig die Gitterseite auf einem Filterpapier berühren.

1. Färbung mit 4% Uranylacetat in destilliertem Wasser für 5 min.
2. 3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.
3. 3 min mit Bleicitrat färben.
4. 3 mal in destilliertem Wasser für 5 min waschen.
5. Legen Sie die Gitter an der Unterseite in Kontakt mit dem Filterpapier ab, um sie trocknen zu lassen.
   HINWEIS: Schwermetalle reagieren in Gegenwart von Kohlendioxid. Um die Ausscheidungen zu minimieren, vermeiden Sie Luftverschiebungen während des Kontrasts, sprechen Sie nicht, halten Sie die Umgebung ruhig und schalten Sie die Klimaanlage aus.

7. TEM (Abbildung 1E)

HINWEIS: Die Schnitte werden in ein TEM-Mikroskop eingebracht und bei 120 kV untersucht.

1. Untersuchen Sie zunächst die Abschnitte bei geringer Vergrößerung (< 500x), um den allgemeinen Aspekt der Vorbereitung zu würdigen (Fehlen eines Lochs im Harz, Falten / Kompression in den Abschnitten, Ausscheidungen aufgrund von Flecken).
2. Untersuchen Sie dann die Abschnitte mit höherer Vergrößerung (~ 2000x, um das Reifestadium zu unterscheiden). Zählen Sie manuell die Megakaryozyten aus jedem Stadium der Reifung über ganze Transversalabschnitte (siehe Repräsentative Ergebnisse zur visuellen Identifizierung jedes Stadiums).
   HINWEIS: Jedes Quadrat der Gitter ist als untersuchungsbedürftiger Bereich definiert (was 16000 μm2 für 200 Mesh Kupfergitter entspricht).
3. Um die Anzahl der Megakaryozyten zu beurteilen, quantifizieren Sie nur die Quadrate, die vollständig mit einem Abschnitt bedeckt sind. Verwenden Sie dazu ein Modell, das auf dem Screening von Bereichen basiert. Beobachten Sie einen ersten Bereich von Quadraten von einem Ende des Abschnitts zu einem anderen, dann einen anderen Bereich auf die gleiche Weise usw. Mit diesem Verfahren sieben Sie den gesamten Querschnitt des Knochenmarks vollständig und systematisch Quadrat für Quadrat.
4. Bewerten Sie für jedes Quadrat die Anzahl der Megakaryozyten der Stufe I, II oder III.
   HINWEIS: Höhere Vergrößerungen sind erforderlich, um die Granula, die DMS-Organisation, die Größe der zytoplasmatischen Territorien und den polylobulierten Kern zu analysieren.

Ergebnisse

Histologie des Knochenmarks
Die Beobachtung der Knochenmark-Toluidin-Blau-Histologie unter einem Lichtmikroskop ist der Schlüssel zur schnellen Analyse der gesamten Gewebearchitektur in Bezug auf z.B. Gewebekompaktheit, Mikrogefäßkontinuität und die Größe und Form von Megakaryozyten (Abbildung 1D). Es wird vor ultradünnen Abschnitten durchgeführt, um die Notwendigkeit zu bestimmen, tiefer in den Knochenmarkblock zu schneiden. Aufgrund ihrer riesig...

Diskussion

Die direkte Untersuchung von Megakaryozyten in ihrer natürlichen Umgebung ist unerlässlich, um Megakaryopoese und Thrombozytenbildung zu verstehen. In diesem Manuskript stellen wir eine Transmissionselektronenmikroskopie-Methode zur Verfügung, die Knochenmarkspülung und Fixierung durch Eintauchen kombiniert und es ermöglicht, die morphologischen Eigenschaften des gesamten Prozesses der Megakaryozytenmorphogenese im Knochenmark in situ zu sezieren.

Die Spülung des Knochenmarks is...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620