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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.
L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.
Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.
I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del sangue6,7,8. Sebbene la maggior parte delle cellule dell'espettorato siano di origine ematopoietica9,10,11, la citometria a flusso non è stata ampiamente applicata all'analisi dell'espettorato a fini diagnostici. Tuttavia, diversi studi suggeriscono che la valutazione delle popolazioni di cellule immunitarie nell'espettorato (il sottoinsieme più significativo di cellule) può essere di grande aiuto nella diagnosi e / o nel monitoraggio di malattie come l'asma e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)12,13,14,15. Inoltre, l'esistenza di marcatori epiteliali specifici che possono essere utilizzati nella citometria a flusso consente l'interrogazione del seguente sottoinsieme più significativo di cellule nell'espettorato, cellule epiteliali polmonari.
Oltre alla capacità di analizzare molte popolazioni cellulari distinte di diverse origini tissutali, un citometro a flusso può valutare un gran numero di cellule in un periodo relativamente breve. In confronto, i tipi di analisi citologiche basate su diapositive spesso richiedono personale e/o attrezzature altamente specializzati. Queste analisi possono essere laboriose, il che porta all'analisi solo di una parte del campione di espettorato16.
Tre criticità limitano l'uso diffuso dell'espettorato nella citometria a flusso. La prima questione riguarda la raccolta dell'espettorato. L'espettorato viene raccolto attraverso una tosse che espelle il muco dai polmoni nella cavità orale, sputando successivamente in una tazza di raccolta. Poiché il muco viaggia attraverso la cavità orale, c'è un'alta probabilità di contaminazione SEC. Questa contaminazione complica l'analisi del campione, ma il problema è facilmente risolvibile su una piattaforma citometrica a flusso, come mostrato in questo studio.
Non tutti possono produrre espettorato spontaneamente; pertanto, sono stati sviluppati diversi dispositivi per aiutare con la raccolta dell'espettorato in modo non invasivo17. Il nebulizzatore è uno di questi dispositivi e ha dimostrato di produrre campioni di espettorato affidabili18,19,20. Sebbene il nebulizzatore sia un modo molto efficace per raccogliere in modo non invasivo l'espettorato, il suo utilizzo richiede comunque un ambiente in una struttura medica con personale specializzato21. Al contrario, dispositivi portatili come il flauto polmonare22,23,24 e l'acapella16,25 possono essere utilizzati a casa poiché sono molto user-friendly. Questi dispositivi di assistenza sono sicuri ed economici.
Per noi, l'acapella ha dato risultati costantemente migliori rispetto al flauto polmonare16 e, pertanto, il dispositivo a cappella è stato scelto per le collezioni di espettorato. È stato deciso un campione di raccolta di 3 giorni perché lo scopo principale per l'utilizzo dell'espettorato è quello di sviluppare un test di rilevamento del cancro del polmone16. È stato dimostrato che un campione di 3 giorni aumenta la probabilità di rilevamento del cancro del polmone rispetto a un campione di 1 o 2 giorni26,27,28. Tuttavia, altri metodi di raccolta dell'espettorato possono essere preferibili per scopi diversi. Se si utilizza un metodo di raccolta dell'espettorato diverso da quello qui descritto, si raccomanda di titolare attentamente ogni anticorpo o colorante utilizzato per l'analisi citometrica a flusso; sono disponibili pochissimi dati su come i diversi metodi di raccolta dell'espettorato influenzano le proteine mirate per la citometria a flusso.
Il secondo problema che smorza l'entusiasmo per l'uso dell'espettorato per la diagnostica, principalmente legato alla citometria a flusso, è il numero di cellule. Il problema è la raccolta di cellule vitali sufficienti per un'analisi affidabile. Due studi hanno dimostrato che i campioni di espettorato raccolti con metodi non invasivi, con l'aiuto di un dispositivo di assistenza, contengono abbastanza cellule vitali che possono essere utilizzate nella diagnosi clinica o negli studi di ricerca16,24. Tuttavia, nessuno di questi studi ha affrontato il problema del numero di cellule per quanto riguarda la citometria a flusso.
Per gli studi che costituiscono la base di questo protocollo, sono stati raccolti campioni di espettorato da partecipanti ad alto rischio di sviluppare il cancro del polmone seguendo le linee guida istituzionali approvate per ciascun sito di studio. I partecipanti ad alto rischio sono stati definiti come tra 55-75 anni, avendo fumato 30 anni e non avendo smesso di fumare negli ultimi 15 anni. Ai pazienti è stato mostrato come utilizzare il dispositivo a cappella secondo le istruzioni del produttore29 e hanno raccolto l'espettorato per tre giorni consecutivi a casa. Il campione è stato conservato in frigorifero fino all'ultima raccolta. L'ultimo giorno di raccolta, il campione è stato spedito al laboratorio durante la notte con un pacco freddo congelato. I campioni sono stati elaborati in una sospensione a cella singola il giorno in cui sono stati ricevuti. Con questo metodo di raccolta dell'espettorato, si ottengono più che sufficienti cellule vitali per un'analisi citometrica a flusso affidabile.
Infine, e in relazione al precedente problema del numero di cellule, è la questione di come rilasciare le cellule dell'espettorato dal suo ambiente mucinoso. Come si possono mantenere vitali le cellule e creare una sospensione monocellulare che non ostruisca il citometro a flusso? Basato sul lavoro iniziale di Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, questo protocollo descrive un metodo semplice e affidabile per l'elaborazione dell'espettorato in una sospensione a singola cellula adatta per l'analisi citometrica a flusso. Questo metodo ha utilizzato linee guida consolidate nella citometria a flusso32,33,34 per sviluppare un'efficiente strategia di etichettatura degli anticorpi per identificare le cellule ematopoietiche ed epiteliali nell'espettorato e fornire impostazioni dello strumento, misure di controllo della qualità e linee guida di analisi che standardizzano l'analisi dell'espettorato su una piattaforma citometrica a flusso.
Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.
1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato
2. Dissociazione dell'espettorato
3. Colorazione di anticorpi e coloranti vitali
4. Fissazione con 1% Paraformaldeide (PFA)
5. Acquisizione dati sul citometro a flusso
Questo protocollo è stato sviluppato pensando a un ambiente di laboratorio clinico. Durante lo sviluppo del protocollo ci si è concentrati sulla semplicità, l'efficienza e la riproducibilità. Si è scoperto che la fase più dispendiosa in termini di tempo nell'elaborazione dell'espettorato era il conteggio delle cellule. Pertanto, il protocollo è impostato in modo tale che l'elaborazione dell'espettorato e l'etichettatura delle cellule possano essere eseguite indipendentemente dal conteggio delle cellule senza perdi...
Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e...
Tutti gli autori sono dipendenti passati o attuali di bioAffinity Technologies.
Vogliamo ringraziare David Rodriguez per la sua assistenza nella preparazione della figura. I campioni di espettorato sono stati eseguiti sul BD LSR II presso l'UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, supportati da UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (sovvenzione CTSA).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% Paraformaldehyde Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
50 mL conical falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype | BioLegend | 400129 | |
BV510 anti-human CD45 | BioLegend | 304036 | |
CD66b FITC isotype | BD Biosciences | 555748 | |
CompBead Plus Compensation Beads | BD Biosciences | 560497 | |
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
CS&T beads | BD Biosciences | 655051 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
FITC anti-human CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 564406 | |
FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NIST Beads, 05 μM | Polysciences | 64080 | |
NIST Beads, 20 μM | Polysciences | 64160 | |
NIST Beads, 30 μM | Polysciences | 64170 | |
PE anti-human CD45 | BioLegend | 304039 | |
PE-CF594 anti-human EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
PE-CR594 anti-human CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
Sodium citrate dihydrate | EMD | SX0445-1 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
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