Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Summary

Questo protocollo descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula e la successiva caratterizzazione di sottoinsiemi cellulari su piattaforme citometriche a flusso standard.

Abstract

L'espettorato, ampiamente utilizzato per studiare il contenuto cellulare e altre caratteristiche microambientali per comprendere la salute del polmone, viene tradizionalmente analizzato utilizzando metodologie basate sulla citologia. La sua utilità è limitata perché la lettura delle diapositive richiede molto tempo e richiede personale altamente specializzato. Inoltre, detriti estesi e la presenza di troppe cellule epiteliali squamose (VEC), o cellule della guancia, spesso rendono un campione inadeguato per la diagnosi. Al contrario, la citometria a flusso consente la fenotipizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari escludendo contemporaneamente detriti e SEC.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo efficace per dissociare l'espettorato in una sospensione a singola cellula, colorare anticorpi e fissare popolazioni cellulari e acquisire campioni su una piattaforma citometrica a flusso. Una strategia di gating che descrive l'esclusione di detriti, cellule morte (compresi i SEC) e doppietti cellulari è presentata qui. Inoltre, questo lavoro spiega anche come analizzare le cellule vitali e singole dell'espettorato basate su un gruppo di differenziazione (CD)45 popolazioni positive e negative per caratterizzare i sottoinsiemi di lignaggio ematopoietico ed epiteliale. Una misura di controllo della qualità viene fornita anche identificando macrofagi polmonari specifici come prova che un campione è derivato dal polmone e non è saliva. Infine, è stato dimostrato che questo metodo può essere applicato a diverse piattaforme citometriche fornendo profili espettorati dello stesso paziente analizzati su tre citometri a flusso; Navios EX, LSR II e Lyric. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per includere ulteriori marcatori cellulari di interesse. Qui viene presentato un metodo per analizzare un intero campione di espettorato su una piattaforma citometrica a flusso che rende l'espettorato suscettibile di sviluppare diagnostica ad alto rendimento della malattia polmonare.

Introduction

I progressi tecnici nell'hardware e nel software dei citometri a flusso hanno permesso di identificare contemporaneamente molte popolazioni cellulari distinte1,2,3,4. L'utilizzo del citometro a flusso nella ricerca sulle cellule ematopoietiche, ad esempio, ha portato a una comprensione molto migliore del sistema ^immunitario2 e della gerarchia cellulare del sistema ematopoietico5, nonché alla distinzione diagnostica di una moltitudine di diversi tumori del ^sangue6,7,8

Protocol

Tutte le fasi della lavorazione dell'espettorato vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale.

1. Preparazione del reagente prima di iniziare la dissociazione dell'espettorato

1. Scongelare l'1% di paraformaldeide (PFA), 25 ml per campione su ghiaccio e mantenere freddo fino all'uso.
   ATTENZIONE: il PFA è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Preparare il fissativo secondo le istruzioni del produttore e congelare a.......

Discussion

Il contenuto cellulare dell'espettorato comprende una grande varietà di cellule ad ampio raggio, spesso accompagnate da molti ^detriti37. Inoltre, l'analisi dell'espettorato richiede un controllo di qualità che confermi che il campione viene raccolto dal polmone anziché dalla cavità ^orale38. Pertanto, non è così semplice analizzare l'espettorato mediante citometria a flusso come lo è per il sangue, ad esempio, che rilascia una sospensione cellulare molto più pulita e.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061