Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Резюме

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Аннотация

Мокрота, широко используемая для изучения клеточного содержания и других микроокружающих особенностей для понимания здоровья легких, традиционно анализируется с использованием методологий, основанных на цитологии. Его полезность ограничена, потому что чтение слайдов отнимает много времени и требует узкоспециализированного персонала. Кроме того, обширный мусор и наличие слишком большого количества плоских эпителиальных клеток (STEC) или клеток щек часто делают образец неадекватным для диагностики. Напротив, проточная цитометрия позволяет осуществлять высокопроизводительное фенотипирование клеточных популяций, одновременно исключая мусор и СЭК.

Протокол, представленный здесь, описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одну клеточную суспензию, окрашивания антител и фиксации клеточных популяций, а также получения образцов на проточной цитометрической платформе. Здесь представлена стратегия гатинга, которая описывает исключение мусора, мертвых клеток (включая SEC) и дублетов клеток. Кроме того, эта работа также объясняет, как анализировать жизнеспособные одиночные клетки мокроты на основе кластера дифференцировки (CD) 45 положительных и отрицательных популяций для характеристики подмножеств кроветворной и эпителиальной линии. Мера контроля качества также обеспечивается путем идентификации специфических для легких макрофагов в качестве доказательства того, что образец получен из легкого и не является слюной. Наконец, было продемонстрировано, что этот метод может быть применен к различным цитометрическим платформам путем предоставления профилей мокроты от одного и того же пациента, проанализированных на трех проточных цитометрах; Navios EX, LSR II и Lyric. Кроме того, этот протокол может быть модифицирован для включения дополнительных клеточных маркеров, представляющих интерес. Здесь представлен метод анализа целого образца мокроты на проточной цитометрической платформе, что делает мокроту пригодной для разработки высокопроизводительной диагностики заболеваний легких.

Введение

Технические достижения в аппаратном и программном обеспечении проточных цитометров позволили идентифицировать множество различных клеточных популяций одновременно1,2,3,4. Например, использование проточного цитометра в исследованиях гемопоэтических клеток привело к гораздо лучшему пониманию иммунной ^{системы2} и клеточной иерархии кроветворной ^{системы5}, а также к диагностическому различию множества различных видов рака ^{крови6,7,8}. Хотя большинство клеток мокроты имеют кроветворное происхождение9,10,11, проточная цитометрия не получила широкого применения для анализа мокроты в диагностических целях. Тем не менее, несколько исследований показывают, что оценка популяций иммунных клеток в мокроте (наиболее значительное подмножество клеток) может оказать большую помощь в диагностике и / или мониторинге таких заболеваний, как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) 12,13,14,15. Более того, наличие эпителиально-специфических маркеров, которые могут быть использованы в проточной цитометрии, позволяет опрашивать следующие наиболее значимые подмножества клеток в мокроте, эпителиальные клетки легких.

В дополнение к способности анализировать множество различных клеточных популяций различного происхождения тканей, проточный цитометр может оценивать большое количество клеток за относительно короткий период. Для сравнения, цитологические виды анализов на основе слайдов часто требуют узкоспециализированного персонала и/или оборудования. Эти анализы могут быть трудоемкими, что приводит к анализу только части образца ^{мокроты16}.

Три критических вопроса ограничивают широкое использование мокроты в проточной цитометрии. Первый вопрос касается сбора мокроты. Мокрота собирается через кашель, который выталкивает слизь из легких в ротовую полость, впоследствии плевая в чашку для сбора. Поскольку слизь проходит через ротовую полость, существует высокая вероятность загрязнения SEC. Это загрязнение усложняет анализ образцов, но проблема легко устраняется на проточной цитометрической платформе, как показано в этом исследовании.

Не каждый может производить мокроту спонтанно; поэтому было разработано несколько устройств для оказания помощи в сборе мокроты неинвазивным ^{способом17}. Небулайзер является одним из таких устройств и, как было показано, производит надежные образцы мокроты18,19,20. Хотя небулайзер является очень эффективным способом неинвазивного сбора мокроты, его использование все же требует установки в медицинском учреждении со специализированным ^{персоналом21}. Напротив, портативные устройства, такие как легочная флейта22,23,24 и acapella16,25, ^могут использоваться дома^, поскольку они очень удобны для пользователя. Эти вспомогательные устройства безопасны и экономичны.

Для нас акапелла давала стабильно лучшие результаты, чем легочная ^{флейта16}, и поэтому для сбора мокроты было выбрано устройство акапеллы. Было принято решение о 3-дневном сборе образца, поскольку основной целью использования мокроты является разработка теста на выявление рака ^{легких16}. Было показано, что 3-дневный образец увеличивает вероятность обнаружения рака легких по сравнению с 1- или 2-дневным образцом26,27,28. Однако другие методы сбора мокроты могут быть предпочтительнее для других целей. Если используется другой метод сбора мокроты, чем описанный здесь, рекомендуется тщательно титровать каждое антитело или краситель, используемый для проточного цитометрического анализа; имеется очень мало данных о том, как различные методы сбора мокроты влияют на целевые белки для проточной цитометрии.

Второй проблемой, ослабляющей энтузиазм по поводу использования мокроты для диагностики, в первую очередь связанной с проточной цитометрией, является количество клеток. Проблема заключается в сборе достаточного количества жизнеспособных клеток для достоверного анализа. Два исследования показали, что образцы мокроты, собранные неинвазивными методами с помощью вспомогательного устройства, содержат достаточно жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы в клинической диагностике или научных ^{исследованиях16,24}. Однако ни в одном из этих исследований не рассматривался вопрос о количестве клеток, касающихся проточной цитометрии.

Для исследований, которые составляют основу для этого протокола, образцы мокроты были собраны у участников с высоким риском развития рака легких в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами для каждого места исследования. Участники с высоким риском были определены как люди в возрасте от 55 до 75 лет, курившие 30 лет и не бросившие курить в течение последних 15 лет. Пациентам показывали, как использовать аппарат акапеллы согласно инструкции ^{производителя29} и собирали мокроту в течение трех дней подряд в домашних условиях. Образец хранился в холодильнике до последнего сбора. В последний день сбора образец был отправлен в лабораторию на ночь с замороженным холодным пакетом. Образцы были обработаны в одноклеточную суспензию в день их получения. При таком методе сбора мокроты получается более чем достаточно жизнеспособных клеток для надежного проточного цитометрического анализа.

Наконец, и в связи с предыдущей проблемой с номером клеток, является вопрос о том, как освободить клетки мокроты из муцинозной среды. Как сохранить жизнеспособность клеток и создать одноклеточную суспензию, которая не засоряет проточный цитометр? Основываясь на первоначальной работе Pizzichini et ^al.30 и Miller et ^al.31, этот протокол описывает простой и надежный метод обработки мокроты в одноклеточную суспензию, которая подходит для проточного цитометрического анализа. Этот метод использовал хорошо зарекомендовавшие себя руководящие принципы в проточной цитометрии32,33,34 для разработки эффективной стратегии маркировки антител для идентификации гемопоэтических и эпителиальных клеток в мокроте и предоставления настроек приборов, мер контроля качества и руководящих принципов анализа, стандартизирующих анализ мокроты на проточной цитометрической платформе.

протокол

Все этапы обработки мокроты выполняются в шкафу биологической безопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

1. Подготовка реагентов перед началом диссоциации мокроты

1. Разморозьте 1% параформальдегида (PFA), 25 мл на образец на льду, и держите холодным до использования.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен при вдыхании и контакте с кожей. Приготовьте фиксатор в соответствии с инструкциями производителя и заморозьте при -20 °C в 25 мл аликвот до использования.
2. Приблизите массу образца и разморожите достаточно 0,1% дитиотрейтола (DTT) для шага 2,2 и доведите его до 37 °C. (Аликвоты DTT следует хранить при -20 °C перед использованием.)
3. Доведите достаточное количество 0,5% N-ацетил-L-цистеина (NAC) до 37 °C для шага 2,2. (NAC следует делать свежим еженедельно и хранить при 4 °C перед использованием.)

2. Диссоциация мокроты

1. Взвесьте образец мокроты для определения объемов диссоциационных реагентов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образец считается небольшим, если первоначальный вес составляет ≤3 г, средним, если >3 г, но ≤8 г, большим, если >8, но ≤16 г, и очень большим, если образец весит >16 г. Показания малые, средние, большие и сверхбольшие будут использоваться на протяжении всего протокола. Количество реагентов, необходимых для диссоциации и маркировки, различается в зависимости от размера образца мокроты.
2. Перенесите небольшой образец в чистую коническую трубку объемом 50 мл, средний образец в чистую пластиковую одноразовую бутылку объемом 250 мл или большой и очень большой образец в чистую пластиковую одноразовую бутылку объемом 500 мл. Добавьте 1 мл/г массы образца 0,5% NAC и 4 мл/г массы образца 0,1% DTT.
3. Вихрь на максимальной скорости (в течение 15 с), а затем раскачка при комнатной температуре (на максимальной скорости) в течение 15 мин.
4. Разбавить образец четырьмя объемами сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) (на основе общего объема образца + реагентов) для нейтрализации NAC и DTT; быстро вихрь на максимальной скорости и камень при комнатной температуре в течение 5 мин на максимальной скорости.
5. Фильтруйте клеточную суспензию через сетчатый (сетчатые фильтры) нейлоновой сетки 100 мкм в одну или несколько конических центрифужных трубок (трубок) емкостью 50 мл для создания одноэлементной суспензии.
6. Центрифугирование клеток при 800 х г в течение 10 мин при 4 °C. Аспирировать супернатант, соединить все гранулы в одной конической трубке объемом 15 мл, а затем промыть гранулы HBSS, используя те же условия.
7. Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой образец повторно суспендируется в 250 мкл HBSS. Образец среды повторно суспендируется в 760 мкл HBSS. Большие и очень большие образцы повторно суспендируются в 1460 мкл HBSS.
8. Возьмите аликвоту клеточной суспензии для подсчета живых/мертвых клеток с помощью Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольшого образца используйте 5 мкл. Для среднего, большого или очень большого образца используйте 10 мкл. Разбавьте 1:10 HBSS.
   1. Смешайте 10 мкл разбавления мокроты с 30 мкл 0,4% трипанового синего для достижения окончательного разбавления образца 1:40. Загрузка в счетные камеры гемоцитометра для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться скорректировать окончательное разбавление, если количество ячеек слишком низкое или слишком высокое для достижения точного подсчета. Здесь настоятельно рекомендуется проконсультироваться с Guiot et ^al.20 для правильного различения клеток мокроты от STEC и мусора. Это важно для точного подсчета клеток.
9. Из очень большого образца удалите 50 x ¹⁰⁶ клеток из общего количества и добавьте в новую пробирку с достаточным количеством добавленного HBSS, чтобы создать общий объем 1700 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Считайте это большой выборкой для остальной части протокола. Оставшиеся образцы могут быть выброшены или использованы для других целей.

3. Окрашивание антителами и жизнеспособностью красителей

1. Выбор антител и окрашивающего красителя
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 показаны антитела и краситель жизнеспособности, которые используются в этом протоколе, и популяции клеток, которые они идентифицируют.
   1. Маркировка пробирок, содержащих клетки мокроты (этикетки см. в таблице 2 ).
   2. Используйте проточные цитометрические трубки объемом 5 мл (совместимые с используемым проточным цитометром) для пробоотборника с неокрашенными клетками и трубки с контролем изотипа. Используйте конические пробирки по 15 мл для образцов крови и эпителиальных пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы будут перенесены в проточные цитометрические трубки после окрашивания и фиксации антител.
2. Маркировка компенсационных трубок (табл. 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте проточные цитометрические трубки объемом 5 мл, совместимые с используемым проточным цитометром.
3. Добавьте количество HBSS, антитела и/или красителя к каждой из пробирок клеток мокроты и компенсационных пробирок, как указано в Таблице 2 и Таблице 3, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер (HBBS), антитела и краситель во все трубки перед добавлением клеток или компенсационных шариков, чтобы обеспечить согласованность времени окрашивания всех трубок.
4. Добавьте в пробирки количество клеток мокроты, указанное в таблице 2 .
5. Добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, перечисленным в таблице 3.
6. Высиживать все трубки (пробирные и компенсационные трубки) на льду, защищенном от света, в течение 35 мин. Затем заполните пробирки ледяным HBSS и центрифугой при 4 °C в течение 10 мин при 800 х г.
7. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить.
8. Добавьте 0,5 мл холодного HBSS в компенсационные трубки, храните их на льду при 4 °C и защищайте их от света до тех пор, пока это не понадобится для анализа проточной цитометрии.
9. Аспирировать супернатант из незапятнанных изотипов, крови и эпителиальных трубок после центрифугирования (этап 3.6 из секции окрашивания антител) и ослабить гранулы, щелкнув трубками.

4. Фиксация 1% параформальдегидом (PFA)

1. Добавьте холодный 1% PFA (который должен быть разморожен к настоящему времени) к неокрашенным, изотипным, кровяным и эпителиальным трубкам; 2 мл в неокрашенные и изотипные трубки и 10 мл в кровь и эпителиальные трубки.
2. Высиживать трубки на льду, защищенном от света в течение 1 ч. Вихрь быстро на максимальной скорости через 30 мин.
3. Наполните трубки ледяным HBSS. Затем центрифужные трубки при 4 °C в течение 10 мин при 1600 х г.
4. Аспирируйте как можно больше супернатанта, не нарушая клеточную гранулу, и проведите пальцами по трубке, чтобы ослабить клетки.
5. Добавьте 200 мкл холодного HBSS в неокрашенные и изотипные пробирки.
6. Рассчитайте объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ресуспенсии = 0,15 x [общее количество клеток (шаг 8 диссоциации мокроты) / ¹⁰⁶]. Используйте 50 x ¹⁰⁶ в качестве количества ячеек для очень большого образца.
7. Храните все пробы и компенсационные пробирки, защищенные от света на льду при 4 °C, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не тестировался для хранения более 24 часов.

5. Сбор данных по проточному цитометру

1. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола предполагает, что лицо, управляющее проточным цитометром, обучено использованию доступного ему прибора, особенно в отношении ежедневных процедур, включая проверку стабильности оптических и флюидических систем, методы стандартизации рассеяния света и интенсивности флуоресценции, а также расчет и применение правильной компенсационной матрицы.
2. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий (NIST), чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST, чтобы охватить весь участок, не размещая бусины слишком близко к осям.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы мусор размером менее 5 мкм мог быть устранен путем анализа после сбора. В зависимости от используемого проточного цитометра, имейте в виду, что мельчайшие шарики не исключаются с порогом (при использовании LSR II или Lyric) или с высоким дискриминатором (с использованием проточного цитометра Navios EX). Для Navios EX коэффициент усиления использовался для прямого и бокового рассеяния, напряжение 236 для прямого рассеяния и 250 для бокового рассеяния. Для LSR II использовалось напряжение прямого рассеяния 165 и напряжение бокового рассеяния 190.
3. Установите скорость потока на среднюю (LSR II) или высокую (Navios EX).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя или высокая скорость потока для большинства инструментов может быть использована для получения трубок мокроты. Важно отметить, что использование слишком медленного расхода или слишком разбавленного образца может привести к оседанию клеток, что приводит к увеличению вихрей, что нежелательно. Таким образом, соблюдение рассчитанного объема повторного суспензии на этапе 4.6 должно привести к клеточной плотности, которая может быть получена быстро, но не засоряет машину.
4. Отрегулируйте напряжения для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток на шкалу. Используйте цифры со стратегией захвата в качестве руководства о том, как соответствующим образом регулировать напряжение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все необходимые параметры выбраны в окне выбора параметров перед получением или что данные не будут получены.
5. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная суспензия слишком концентрирована, чтобы позволить проточному цитометру запускать образцы без засорения, образцы могут быть дополнительно разбавлены HBSS.

Результаты

Этот протокол был разработан с учетом клинических лабораторных условий. При разработке протокола основное внимание уделялось простоте, эффективности и воспроизводимости. Было установлено, что самым трудоемким этапом в обработке мокроты был подсчет клеток. Поэтому протокол настроен ?...

Обсуждение

Клеточное содержание мокроты включает в себя большое разнообразие обширных клеток, часто сопровождающихся большим количеством ^{мусора37}. Кроме того, анализ мокроты требует контроля качества, который подтверждает, что образец взят из легкого, а не из ротовой ^{полос?...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061