Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии

Резюме

Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.

Аннотация

Мокрота, широко используемая для изучения клеточного содержания и других микроокружающих особенностей для понимания здоровья легких, традиционно анализируется с использованием методологий, основанных на цитологии. Его полезность ограничена, потому что чтение слайдов отнимает много времени и требует узкоспециализированного персонала. Кроме того, обширный мусор и наличие слишком большого количества плоских эпителиальных клеток (STEC) или клеток щек часто делают образец неадекватным для диагностики. Напротив, проточная цитометрия позволяет осуществлять высокопроизводительное фенотипирование клеточных популяций, одновременно исключая мусор и СЭК.

Протокол, представленный здесь, описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одну клеточную суспензию, окрашивания антител и фиксации клеточных популяций, а также получения образцов на проточной цитометрической платформе. Здесь представлена стратегия гатинга, которая описывает исключение мусора, мертвых клеток (включая SEC) и дублетов клеток. Кроме того, эта работа также объясняет, как анализировать жизнеспособные одиночные клетки мокроты на основе кластера дифференцировки (CD) 45 положительных и отрицательных популяций для характеристики подмножеств кроветворной и эпителиальной линии. Мера контроля качества также обеспечивается путем идентификации специфических для легких макрофагов в качестве доказательства того, что образец получен из легкого и не является слюной. Наконец, было продемонстрировано, что этот метод может быть применен к различным цитометрическим платформам путем предоставления профилей мокроты от одного и того же пациента, проанализированных на трех проточных цитометрах; Navios EX, LSR II и Lyric. Кроме того, этот протокол может быть модифицирован для включения дополнительных клеточных маркеров, представляющих интерес. Здесь представлен метод анализа целого образца мокроты на проточной цитометрической платформе, что делает мокроту пригодной для разработки высокопроизводительной диагностики заболеваний легких.

Введение

Технические достижения в аппаратном и программном обеспечении проточных цитометров позволили идентифицировать множество различных клеточных популяций одновременно1,2,3,4. Например, использование проточного цитометра в исследованиях гемопоэтических клеток привело к гораздо лучшему пониманию иммунной ^{системы2} и клеточной иерархии кроветворной ^{системы5}, а также к диагностическому различию множества различных видов рака ^{крови6,7,8}

протокол

Все этапы обработки мокроты выполняются в шкафу биологической безопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

1. Подготовка реагентов перед началом диссоциации мокроты

1. Разморозьте 1% параформальдегида (PFA), 25 мл на образец на льду, и держите холодным до использования.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен при вдыхании и контакте с кожей. Приготовьте фиксатор в соответствии с инструкциями производителя и заморозьте при -20 °C в 25 мл аликвот до использования.
2. Приблизите массу образца и разморожите достаточно 0,1% дитиотрейтола (DTT) для шага 2,2 и доведите его до 37 °C. (Аликвоты DTT следует хранить при -20 °C пе....

Результаты

Этот протокол был разработан с учетом клинических лабораторных условий. При разработке протокола основное внимание уделялось простоте, эффективности и воспроизводимости. Было установлено, что самым трудоемким этапом в обработке мокроты был подсчет клеток. Поэтому протокол настроен ?.......

Обсуждение

Клеточное содержание мокроты включает в себя большое разнообразие обширных клеток, часто сопровождающихся большим количеством ^{мусора37}. Кроме того, анализ мокроты требует контроля качества, который подтверждает, что образец взят из легкого, а не из ротовой ^{полос?.......}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061