Étudier le comportement migraineux à l’aide de l’aversion à la lumière chez la souris

Résumé

Les rongeurs ne sont pas en mesure de signaler les symptômes de la migraine. Ici, nous décrivons un paradigme de test gérable (tests clair/ sombre et champ ouvert) pour mesurer l’aversion à la lumière, l’un des symptômes les plus courants et les plus gênants chez les patients souffrant de migraines.

Résumé

La migraine est un trouble neurologique complexe caractérisé par des maux de tête et des anomalies sensorielles, telles que l’hypersensibilité à la lumière, observée sous forme de photophobie. Bien qu’il soit impossible de confirmer qu’une souris souffre de migraine, l’aversion à la lumière peut être utilisée comme substitut comportemental du symptôme migraineux de la photophobie. Pour tester l’aversion à la lumière, nous utilisons le test lumière/obscurité pour mesurer le temps que les souris choisissent librement de passer dans un environnement clair ou sombre. Le test a été affiné en introduisant deux modifications critiques: des pré-expositions à la chambre avant l’exécution de la procédure d’essai et un éclairage de chambre réglable, permettant l’utilisation d’une gamme d’intensités lumineuses allant de 55 lux à 27 000 lux. Parce que le choix de passer plus de temps dans l’obscurité est également révélateur d’anxiété, nous utilisons également un test d’anxiété indépendant de la lumière, le test en champ ouvert, pour distinguer l’anxiété du comportement aversif à la lumière. Ici, nous décrivons un paradigme de test modifié pour les tests en champ clair/sombre et ouvert. L’application de ces tests est décrite pour l’injection intrapéritonéale de peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) dans deux souches de souris et pour les études de stimulation cérébrale optogénétique.

Introduction

La migraine est une maladie neurologique répandue, touchant environ 17 % des ^Américains1 et est la deuxième cause d’invalidité dans le ^monde2,3. Les patients éprouvent des maux de tête qui durent de 4 à 72 heures accompagnés d’au moins un des symptômes suivants: nausées et / ou vomissements, ou photophobie et phonophobie4. Les progrès récents dans le développement d’anticorps peptidiques liés au gène de la calcitonine (CGRP) qui sont maintenant approuvés par la FDA ont commencé une nouvelle ère pour le traitement de la ^{migraine5,6,7}. Ces anticorps bloquent le CGRP ou son récepteur et préviennent les symptômes de la migraine chez environ 50 % des patients ^migraineux7. Au cours de la dernière année, deux antagonistes à petites molécules du récepteur CGRP ont également été approuvés par la FDA pour le traitement abortif de la migraine, et deux autres sont en cours de ^{développement8}. Malgré ces progrès thérapeutiques, les mécanismes par lesquels les crises de migraine se produisent restent encore insaisissables. Par exemple, les sites d’action CGRP ne sont pas connus. L’efficacité des anticorps thérapeutiques qui ne traversent pas sensiblement la barrière hémato-encéphalique suggère que le CGRP agit sur les sites périphériques, tels que les méninges et / ou les ganglions du trijumeau. Cependant, nous ne pouvons pas exclure des actions centrales au niveau des organes circumventriculaires, qui n’ont pas de barrière hémato-encéphalique9. Au moins pour la photophobie, nous pensons que cela est moins probable compte tenu de nos résultats avec l’aversion à la lumière en utilisant des souris transgéniques nestin/hRAMP1 chez lesquelles hRAMP1 est surexprimé dans le tissu ^nerveux10. Comprendre les mécanismes de la physiopathologie de la migraine fournira de nouvelles voies pour le développement de thérapies contre la migraine.

Les modèles animaux précliniques sont essentiels à la compréhension des mécanismes de la maladie et au développement de nouveaux médicaments. Cependant, l’évaluation de la migraine chez les animaux est difficile car les animaux ne peuvent pas signaler verbalement leurs sensations de douleur. Étant donné que 80 à 90% des patients migraineux présentent une ^{photophobie11}, l’aversion à la lumière est considérée comme un indicateur de migraine dans les modèles animaux. Cela a conduit à la nécessité de développer un test pour évaluer l’aversion à la lumière chez la souris.

Le test clair/foncé contient une zone claire et une zone sombre. Il est largement utilisé pour mesurer l’anxiété chez les souris en fonction de leur exploration spontanée de nouveaux environnements qui est contrée par leur aversion innée pour la ^lumière12. Certaines études définissent 1/3 de la chambre comme zone sombre, tandis que d’autres définissent 1/2 de la chambre comme zone sombre. Le premier paramètre est souvent utilisé pour détecter ^{l’anxiété13}. Bien que nous ayons initialement choisi des chambres claires / sombres de taille égale, nous n’avons pas comparé les deux tailles relatives. Nous pouvons faire remarquer que la taille globale des deux chambres n’est pas un facteur majeur puisque la boîte d’essai ^initiale14 était considérablement plus grande que l’appareil ^suivant15, mais les résultats étaient essentiellement les mêmes.

Deux modifications essentielles apportées à ce test lumière/obscurité pour évaluer l’aversion à la lumière étaient : la condition d’essai et l’intensité lumineuse (Figure 1). Tout d’abord, les souris sont préexposées à la chambre claire/sombre pour réduire l’entraînement ^{exploratoire16} (Figure 1A). La nécessité et les délais de pré-exposition dépendent des souches et des modèles de souris. Les souris Wildtype C57BL/6J nécessitent généralement deux ^{pré-expositions10}, tandis qu’une seule pré-exposition pour les souris CD1 est ^suffisante17. De cette manière, le comportement aversif à la lumière peut être démasqué dans ces deux souches de souris. Deuxièmement, l’éclairage de la chambre a été adapté pour inclure une plage réglable d’intensités lumineuses allant de faible (55 lux) à lumineux (27 000 lux) où 55 lux est comparable à une journée sombre et couverte, et 27 000 lux est comparable à une journée ensoleillée à ^l’ombre10. Nous avons constaté que l’intensité lumineuse requise varie en fonction de la souche et du modèle génétique. Pour cette raison, les individus devraient d’abord évaluer l’intensité lumineuse minimale pour leur paradigme expérimental.

Même avec ces modifications du test, qui peuvent révéler un phénotype aversif à la lumière, il est nécessaire de tester un comportement anxieux pour faire la distinction entre l’aversion à la lumière due à la lumière seule et l’anxiété. Le test en plein champ est un moyen traditionnel de mesurer l’anxiété basée sur l’exploration spontanée de nouveaux environnements. Il diffère du test lumière/obscurité en ce que l’entraînement exploratoire est contré par l’aversion innée pour les espaces ouverts non protégés. Le centre et les bords de la chambre sont à la lumière, de sorte que le test en champ ouvert est un test d’anxiété indépendant de la lumière. Ainsi, la combinaison des tests lumière/obscurité et champ ouvert nous permet de distinguer entre l’aversion à la lumière due à un évitement de la lumière et une augmentation globale de l’anxiété.

Le CGRP est un neuropeptide multifonctionnel qui régule la vasodilatation, la nociception et ^{l’inflammation18}. Il est largement exprimé dans les systèmes nerveux périphérique et central. Il joue un rôle important dans la physiopathologie de la ^migraine18. Cependant, le mécanisme sous-jacent à l’action du CGRP dans la migraine n’est pas clair. En utilisant les tests lumière/obscurité et champ ouvert avec ce paradigme de test modifié, nous avons pu identifier le comportement aversif de la lumière chez les souris suivant ^{l’administration} de CGRP ^{périphérique10,16} (Figure 2) et ^{centrale14,15,16,19}. En plus des neuropeptides, l’identification des régions du cerveau impliquées dans l’aversion à la lumière est également importante pour comprendre la physiopathologie de la migraine. Les noyaux thalamiques postérieurs sont une région intégrative du cerveau pour le traitement de la douleur et de la ^lumière19, et le thalamus est activé pendant la ^migraine20. Ainsi, nous avons ciblé les noyaux thalamiques postérieurs en injectant le virus adéno-associé (AAV) contenant de la channelrhodopsine-2 (ChR2) ou de l’eYFP dans cette région. En combinant cette approche optogénétique avec ces deux essais, nous avons démontré que la stimulation optique des neurones exprimant ChR2 dans les noyaux thalamiques postérieurs induisait une aversion à la ^lumière19 (Figure 3). Dans cette expérience, étant donné l’effet dramatique sur l’aversion à la lumière évoquée chez ces souris manipulées optogénétiquement, les pré-expositions à la chambre ont été ignorées.

Protocole

Les procédures animales ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa et effectuées conformément aux normes établies par les National Institutes of Health.

1. Essai clair/foncé

1. Installation d’un appareil à chambre claire/sombre (voir tableau des matériaux). Tout l’équipement de cette section est disponible dans le commerce.
   1. Sur une étagère, placez la cabine insonorisante (intérieur : 59,7 x 38 x 35,6 cm en L x H x P) contenant un tiroir coulissant pour un accès facile à la chambre et un insert sombre.
   2. Connectez l’alimentation CC et une alimentation régulée CC à la cabine d’atténuation acoustique.
   3. Placez la chambre à champ ouvert transparente sans soudure (27,31 x 27,31 x 20,32 cm en L x L x H) sur le tiroir coulissant de la cabine.
   4. Placez l’insert noir en plastique transparent infrarouge (IR) sombre (28,7 X 15 X 20,6 cm en L x L x H) dans la chambre à champ ouvert. Assurez-vous que la chambre est divisée en deux zones de taille égale : une zone sombre et une zone claire.
   5. Connectez trois ensembles de matrices IR à 16 faisceaux sur les axes X, Y et Z de la chambre de champ ouvert au contrôleur USB IR via des câbles.
   6. Connectez le contrôleur USB IR à un ordinateur.
   7. Installez le logiciel de suivi sur l’ordinateur qui peut enregistrer et collecter l’emplacement et l’activité de la souris.
   8. Pour la configuration du panneau lumineux, retirez d’abord le panneau lumineux à diode électroluminescente (LED) (27,70 x 27,70 cm en L x L; 360 LED, couleur équilibrée à la lumière du jour, 5600K, faisceau d’inondation à 60 °) de son boîtier d’origine.
   9. Assemblez le panneau lumineux avec le pilote LED, le dissipateur de chaleur et le bloc d’alimentation. Plusieurs panneaux lumineux LED peuvent être connectés à une alimentation, un dissipateur de chaleur et un pilote LED pour obtenir un contrôle uniforme du panneau lumineux.
   10. Construire une plate-forme acrylique personnalisée (29,77 x 27,70 x 8,10 cm en L x L x H) comprenant 7 étagères identiques à des intervalles de 0,53 cm (Figure 1B). Fixez en permanence l’étagère en acrylique personnalisée au plafond à l’intérieur de la cabine au-dessus de la chambre.
   11. Insérez le panneau lumineux LED dans la fente entre les deux étagères inférieures. Ajustez le panneau lumineux à différentes hauteurs (Figure 1B,C), si nécessaire (par exemple, si vous utilisez des souris optogénétiques. Les détails sont discutés à la section 3).
   12. Allumez le dissipateur de chaleur, le pilote LED et le bloc d’alimentation. Vérifiez que le pilote LED peut dicter l’intensité lumineuse led en mesurant l’intensité lumineuse sur le sol de la chambre et confirmez que le sol est éclairé uniformément.
2. Procédure de test comportemental
   REMARQUE: Les souris sont logées sur un cycle de lumière de 12 heures. Toutes les expériences comportementales sont effectuées pendant le cycle de lumière. Des souris, y compris des mâles et des femelles, âgées de 10 à 20 semaines, sont utilisées. Dans ce protocole, les souris naïves de type sauvage CD1 et C57BL/6J subissent deux pré-expositions à la chambre claire/sombre suivies d’une exposition avec traitement et d’une exposition post-traitement. Il y a un intervalle de trois jours entre chaque exposition pour permettre aux souris de se rétablir (jours 1, 4, 7 et 10 comme décrit ci-dessous et figure 1A). Cependant, les souris CD1 ne nécessitent pas la ^2ème pré-exposition et peuvent être testées dans la pénombre.
   1. Le jour 1 (prétraitement 1), allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 27 000 lux.
   2. Ouvrez le logiciel de suivi et configurez un nouveau protocole. Dans le paramètre Nouveau protocole , définissez la durée sur 30 min. Dans le paramètre Nouvelle analyse , définissez Les bacs de données par durée sur 300 s.
   3. Dans le paramètre Nouvelle zone , choisissez Zones prédéfinies. Choisissez 2 , puis Horizontal. Vérifiez si la chambre est divisée en deux zones de taille égale horizontalement pour l’enregistrement.
   4. Habituez les souris à la salle de test pendant 1 h avant le test. Pendant l’accoutumance, gardez la lumière de la pièce allumée pour ne pas perturber le rythme circadien de la souris. Assurez-vous que tout l’équipement pour le test clair/foncé est allumé, ce qui permet aux souris de s’acclimater complètement à l’environnement de la salle de test.
   5. Sélectionnez Acquérir des données. Entrez les ID de souris. Démarrez le protocole.
   6. Tirez le tiroir à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son pour accéder à la chambre de lumière / obscurité et à l’insert sombre. Prenez doucement la souris par la base de la queue, placez-la dans la zone de lumière de la chambre et poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine. Assurez-vous que le logiciel détecte immédiatement la souris et commence à enregistrer l’activité.
   7. Attendez que l’enregistrement s’arrête automatiquement après 30 minutes. Remettez la souris dans sa cage d’origine.
   8. Nettoyez la chambre et l’insert foncé à l’aide de lingettes jetables germicides à odeur d’alcool contenant 55,0 % d’alcool isopropylique, 0,25 % d’alkyle C12-18 diméthyl-éthylbenzylammonium et 0,25 % de chlorure d’alkyl C12-18 diméthylbenzymonium comme ingrédients actifs antimicrobiens pour éradiquer les signaux olfactifs laissés par la souris précédente.
   9. Le jour 4 (prétraitement 2), répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.8.
   10. Le jour 7 (le jour du traitement), répétez les étapes 1.2.1 et 1.2.4. Après l’accoutumance, administrer le CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en fonction du poids corporel de la souris, injection intrapéritonéale (i.p.)), incliner la tête de la souris vers l’avant et injecter dans le quadrant inférieur droit. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
   11. Après 30 minutes, démarrez le protocole et exécutez la souris dans la chambre claire/sombre comme mentionné aux étapes 1.2.5 à 1.2.7. Le temps de récupération dans les cages à domicile après les injections peut être raccourci ou allongé en fonction du ^traitement21.
   12. Nettoyez la chambre et l’insert sombre comme décrit à l’étape 1.2.8.
   13. Le jour 10 (jour post-traitement), répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.8. L’expérience peut être suspendue à l’étape 1.2.13 avant de commencer le test en champ ouvert.

2. Essai en champ ouvert

1. La configuration de l’appareil
   1. Configuration de la chambre de champ ouverte : Utilisez la même cabine d’atténuation du son et la même chambre à champ ouvert que celles utilisées dans le test clair/foncé, sans utiliser l’insert sombre.
   2. Configuration du panneau lumineux : utilisez la même configuration que celle utilisée dans le test clair/foncé. Assurez-vous que l’intensité lumineuse est la même que celle utilisée dans le test lumière/obscurité.
2. Procédure de test comportemental
   1. Allumez l’appareil. Réglez l’intensité lumineuse à 27 000 lux.
   2. Ouvrez le logiciel de suivi.
   3. Configurez un nouveau protocole, le même que celui utilisé dans le test clair/foncé, à l’exception des paramètres Nouvelle zone . Choisissez 1 suivi du Centre dans les paramètres Nouvelle zone . Définissez la périphérie à 3,97 cm du périmètre et le centre à 19,05 × 19,05 cm.
   4. Habituez les souris à la salle d’essai comme décrit à l’étape 1.2.4.
   5. Administrer le CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en fonction du poids corporel de la souris, i.p.), incliner la tête de la souris vers l’avant et injecter dans le quadrant inférieur droit. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
   6. Après 30 min, démarrez le protocole. Tirez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son et placez doucement la souris au milieu de la chambre de champ ouverte. Poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine.
   7. Suivez le comportement pendant 30 min. Ensuite, retournez les souris dans leurs cages d’origine.
   8. Nettoyez l’appareil comme décrit à l’étape 1.2.8.

3. Test clair/foncé modifié pour les souris optogénétiques

1. La configuration de l’appareil
   1. Apportez deux modifications à l’insert sombre.
      1. Modifiez l’ouverture de l’insert sombre à 5,08 x 5,08 cm (L x H) avec une petite fente de 0,95 x 10,16 cm (L X H) entre le haut et l’ouverture de l’insert sombre (Figure 1D en haut à gauche).
         REMARQUE: Cette modification permet à une souris d’aller dans la zone sombre sans difficulté lorsque la canule à fibre optique sur la tête de la souris est attachée au cordon de raccordement.
      2. Étendez le haut de l’insert sombre sur la zone claire comme un porche triangulaire (H = 6,5 cm) (Figure 1D en haut à droite et en bas à gauche). Coupez un trou circulaire (D = 1,7 cm) dans le porche et insérez un support dans le trou pour placer et stabiliser le joint rotatif, qui relie le laser et les cordons de raccordement à fibre optique (Figure 1D en haut à gauche et en bas à gauche).
         REMARQUE: Les modifications entraînent un léger changement dans l’intensité lumineuse atteignant le sol de la zone sombre (17 lux avec modifications contre 14 lux sans modifications, mesurée dans le coin arrière droit de la zone sombre sous 27 000 lux).
   2. Insérez le joint rotatif dans le support de l’insert sombre.
   3. Connectez le cordon de raccordement à fibre optique de 30,5 cm au joint rotatif. Vérifiez que le joint rotatif peut tourner en douceur afin que le cordon de raccordement puisse tourner sans difficulté lorsque la souris traverse la chambre.
   4. Pour le reste de l’installation, utilisez la même configuration d’appareil que celle utilisée dans la section 1 (essai clair/foncé).
2. Procédure de test comportemental
   REMARQUE: Contrairement aux souris de type sauvage, les souris optogénétiques ne reçoivent pas de pré-expositions (prétraitements 1 et 2).
   1. Le jour du test, insérez le panneau lumineux LED dans la deuxième fente la plus basse (28,23 cm du sol du carrossage) pour laisser de l’espace pour connecter le cordon de raccordement. Allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 55 lux.
   2. Utilisez la même configuration de protocole que celle des versions 1.2.2 et 1.2.3, sauf que Data Bins By Duration est défini sur 60 s dans le paramètre Nouvelle analyse pour être conforme au protocole de stimulation laser de l’étape 3.2.3.
   3. Allumez le bouton d’alimentation laser. Réglez le contrôleur d’impulsion laser pour stimuler pendant 1 min suivi de 1 min sans stimulation sur 30 min.
   4. Habituez les souris à la salle de test avec la lumière allumée pendant 1 h avant le test.
   5. Démarrez le protocole. Tirez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine d’atténuation du son pour accéder à la chambre de lumière / obscurité et à l’insert sombre.
   6. Retenez doucement la souris et couplez la canule en fibre optique de la tête de la souris au cordon de raccordement à fibre optique via un manchon d’accouplement (Figure 1D en bas à droite). Placez doucement la souris dans la zone de lumière et poussez le tiroir à l’intérieur de la cabine. Assurez-vous que le protocole commencera à enregistrer automatiquement le comportement de la souris.
   7. À 1 min, allumez le contrôleur d’impulsions, puis mettez la clé de sécurité intégrée sur ON. Assurez-vous que la stimulation laser de la région cérébrale ciblée se produit toutes les deux minutes.
   8. Après 30 minutes, lorsque le protocole s’arrête automatiquement, désactivez la clé de sécurité intégrée. Éteignez ensuite le contrôleur d’impulsions.
   9. Découplez la souris et le cordon de raccordement à fibre optique. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
   10. Nettoyez la chambre et l’insert sombre comme décrit à l’étape 1.2.8.

4. Test en champ ouvert modifié pour les souris optogénétiques

1. La configuration de l’appareil
   1. Stabilisez le joint rotatif au-dessus de la chambre à l’aide d’un support et d’une pince (Figure 1E).
   2. Connectez le cordon de raccordement à fibre optique d’une longueur de 50 cm au joint rotatif. Vérifiez si le joint rotatif peut tourner en douceur.
   3. Réglez le joint rotatif à la hauteur appropriée sur le support : assurez-vous que le cordon de raccordement à fibre optique ne peut atteindre que tous les coins de la chambre, ce qui aidera à éviter toute interférence avec le mouvement de la souris.
   4. Pour le reste de l’installation, utilisez la même configuration d’appareil que celle utilisée dans la section 1 (essai clair/foncé), mais sans l’insert sombre.
2. Procédure de test comportemental
   1. Allumez l’appareil de dosage lumière/obscurité et réglez l’intensité lumineuse à 55 lux.
   2. Utilisez la même configuration de protocole que celle du test clair/foncé modifié (section 3), à l’exception des paramètres Nouvelle zone . Choisissez 1 suivi par Centre dans les paramètres De nouvelle zone . Définissez la périphérie à 3,97 cm du périmètre et le centre à 19,05 × 19,05 cm.
   3. Allumez le bouton d’alimentation laser. Réglez le contrôleur d’impulsion laser pour stimuler pendant 1 min suivi de 1 min sans stimulation sur 30 min.
   4. Effectuer l’accoutumance et le reste de l’essai comme décrit aux étapes 3.2.4 à 3.2.10, à l’exception de deux modifications apportées à l’étape 3.2.6: placer doucement la souris au milieu de la chambre au lieu de la zone lumineuse; gardez le tiroir coulissant à l’extérieur de la cabine en raison du cordon de raccordement qui se connecte à la tête de la souris.

Résultats

Ce paradigme de test comportemental est conçu pour tester le comportement aversif de la lumière. Il peut être réalisé à la fois sur des souris naïves de type sauvage et des souris optogénétiques pour étudier l’aversion à la lumière en temps réel lors de la stimulation d’une population neuronale ciblée.

Cette procédure a été utilisée pour étudier l’effet du traitement CGRP périphérique chez les souris CD1 et C57BL/^6J10,16

Discussion

Le test clair/foncé est largement utilisé pour évaluer les comportements ^anxieux12. Le test repose sur l’aversion innée des souris pour la lumière et leur volonté d’explorer lorsqu’elles sont placées dans un nouvel environnement (zone lumineuse). Cependant, comme nous le signalons ici, ce test peut également être utilisé pour évaluer le comportement aversif de la lumière.

Il est essentiel de tenir compte du nombre et de la nécessité des pré-expositi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256