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要約

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。

要約

ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。

概要

ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。

脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ないため、困難な場合があります。したがって、ミクログリアに関するin vitro研究は、毒性7、8、9、神経保護戦略5、10、11、12、13、14、および共培養15、16、17、18、19、20、21に広く使用されています。.インビトロ研究では、ミクログリア細胞株、幹細胞由来のミクログリア、または初代ミクログリア培養のいずれかを使用できます。これらすべてのアプローチには長所と短所があり、選択は最初の生物学的問題によって異なります。初代ミクログリア培養を使用する利点は、均質な遺伝的背景、病原体のない履歴、および動物の死後にミクログリアが刺激される時間の制御です22。

長年にわたり、新生児と成人の両方のげっ歯類から一次ミクログリアを培養するためのさまざまな方法(フローサイトメトリー、振とう、または磁気標識)が開発されました23、24、25、26、27、28、29。本研究では、マウス新生児仔からのミクログリア単離を、マイクロビーズコーティング抗マウスCD11b25,27,29を用いた既述の磁気活性化細胞選別技術を用いて行う。CD11bは、ミクログリアを含む骨髄系細胞の表面に発現するインテグリン受容体です。脳内に炎症性の問題がない場合、ほとんどすべてのCD11b +細胞はミクログリア30です。以前に発表された他の方法23、24、25、26、27、28、29と比較して、本プロトコルは、即時のex vivoミクログリア活性化分析および一般的なin vitro初代ミクログリア培養のバランスをとる。したがって、ミクログリアは、(1)ミエリン除去なしで(P)8生後日に単離され、(2)血清なしで培養され、(3)脳単離後わずか48時間でsiRNA、miRNA、薬理学的化合物、および/または炎症刺激のいずれかに曝露されます。これらの3つの側面のそれぞれは、現在のプロトコルを関連性があり迅速なものにします。まず第一に、小児ミクログリアの使用は、インビトロでミクログリア反応性を潜在的に改変する可能性のある追加の脱髄ステップを必要とせずに、培養中の動的で反応性の生存細胞を得ることを可能にする。本プロトコルは、ミクログリアの生理学的環境にできるだけ近づけることを目的とする。実際、ミクログリアは血清に遭遇することはなく、このプロトコルも血清の使用を必要としません。さらに、培養後48時間という早い時期にミクログリアを曝露することで、ミクログリアが生理学的能力を失うことを防ぎます。

プロトコル

議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。

1.単離および細胞培養のための滅菌溶液の調製

  1. 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg2+(HBSS-/-)を含まない1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)50mLを調製します(材料の表を参照)。
  2. 市販の組織解離キット(材料の表を参照)を用いて、表1に提供される組成に従って解離混合物を調製する。
  3. 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg 2+(HBSS+/+)を含む1x HBSSを200 mL調製します。
  4. 200 mLの1x PBS + 0.5% BSA(セルソーティングバッファーと呼ばれる)を調製します。
  5. 表2に従ってCD11bマイクロビーズを調製する。
  6. 500 mLのマクロファージ無血清培養培地(SFM)+1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を調製します。50 mLチューブをアリコートし、4°Cで保存します。 これは、本文の後半でミクログリア培地と呼ばれます。
    注:すべての単離溶液は、実験日に無菌条件下で新たに調製し、氷上に保管する必要があります。ミクログリア細胞培養培地を調製し、50 mLチューブに分注し、将来の使用のために4°Cに保つことができます。ろ過は必要ありません。

2.脳解剖

  1. 以前の全身麻酔なしで大きなハサミを使用して子犬の頭を斬首します。
  2. 矢状縫合糸(15〜20 mm)に続いて、小さなハサミで首から鼻までの皮膚を切り取ります(図1A-C)。
  3. 頭蓋骨に平行な大孔内に小さなはさみの先端を挿入します。両側から目まで慎重にカットします(図1D、E)。
  4. 小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します(図1F)。
  5. 2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球に近づけ、下にある脳を傷つけないように注意しながら頭蓋骨を慎重に引き裂きます(図1G-I)。
  6. かみそりの刃で小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります(図1J)。
  7. 脳片を30〜40 mLのHBSS-/- を含むペトリ皿に入れます(図1K)。

3. 脳解離と磁気ミクログリア分離

注:すべての細胞操作および再懸濁は、1,000 μLピペットを使用して細心の注意を払って実行する必要があります。高い機械的作用を適用すると、ミクログリア細胞を活性化または死滅させる可能性があります。

  1. 表1に従って解離混合物を含む解離チューブあたり12個の脳片(~1.2 g)を移します。24匹の子犬には、4本のCチューブが必要でした(図2A-B)。
  2. Cチューブを解離器に置きます(加熱モードを使用)。製造元の指示に従って、機器で最適化されたNTDKプログラムを開始します(図2D)。
  3. 300 x g で20秒間(4°Cで)遠心分離し、すべての細胞を回収します。1,000 μLのピペットで上下に3回ピペッティングすることにより、機械的解離を完了します(図2E)。
  4. 細胞を4本の15 mLチューブ+ストレーナーに移します。ストレーナーを10 mLのHBSS+/+ ですすいでください(図2F)。
  5. 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLのHBSS+/+ で慎重に再懸濁します(図2G)。
  6. 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(ステップ1.4)(図2H)。
  7. 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。チューブあたり200 μLのCD11bマイクロビーズ溶液(ステップ1.5)を加え、慎重に再懸濁します(図2I)。
  8. チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートします。 ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2I-J)。
  9. 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを8 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2K)。
  10. セパレータのPOSSELプログラム( 材料表を参照)に従って、8つの列を準備します。細胞を1 mLずつカラムに移します。すべての細胞が通過するのを待ってから、別のmLを追加します。CD11b+細胞を滅菌溶出プレート上で1 mLのソーティングバッファーで溶出します(図2L)。
  11. CD11b+細胞を新しい50 mLチューブにプールします(図2M)。
  12. 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLの冷たいミクログリア培地で注意深く再懸濁します(ステップ1.6)(図2N)。
  13. CD11b +細胞をカウントします。P8では、脳あたり~650,000個の細胞が得られるはずです。
    注:本プロトコルでは、細胞は自動セルカウンターを使用してカウントされました( 材料の表を参照)。
  14. 細胞を低温ミクログリア培地に最終濃度650,000〜700,000細胞/ mLまで再懸濁し、細胞培養プレートに分注します。
    注:6ウェルプレートはウェスタンブロット用です(ウェルあたり2 mL)。12ウェルプレートはRT-qPCR分析用(ウェルあたり1 mL)、96ウェルプレートは食作用アッセイ用(ウェルあたり250 μL)用です。3つすべてがこの作業に使用されました。ただし、この原稿では、ウェスタンブロット分析の結果は示されていませんが、このプロトコルで実行することは可能です。
  15. プレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。予熱したミクログリア培地を入れた1,000 μLピペットで培地を慎重に交換します。
  16. 刺激の前にプレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。
    注:36匹以上の子犬からミクログリアを分離し、P9以降はお勧めしません。これにより、ミクログリアを活性化するための細胞破片の汚染と蓄積のリスクが高まります。

4.細胞刺激

  1. 市販の試薬を用いて表 3 に従って刺激試薬を調製する( 材料の表参照)。
  2. 刺激された各ウェルに適切な量を追加します。
    注:適切な容量は、刺激の濃度とウェルのサイズによって異なります。
  3. プレートを37°C、5%CO2で6時間、24時間、または48時間の刺激が終了するまで置きます。
  4. ウェスタンブロット分析では、上清を吸引し、50 μLのタンパク質溶解バッファー( 材料表を参照)をピペットで加えます。チップを使用してプレートの底を引っ掻き、溶解した細胞を剥離し、1.5 mLチューブに移します。-80°Cで保存してください。
    注:培養プレートは、上清が正しく吸引されていれば、-80°Cで何年も保存できます。
  5. RT-qPCR分析6,31の場合、上清を吸引し、mRNA抽出まで培養プレートを-80°Cで直接保存します(ステップ5)。
  6. 食作用アッセイについては、ステップ6を参照してください。

5. mRNA抽出とRT-qPCR分析

  1. 製造元のプロトコルに従って、RNA抽出、RT-PCR、およびRT-qPCRを実行します(材料表を参照)。プライマー配列5、6、31については表4を参照されたい。
  2. 以前に公開されたレポートに従ってRT-qPCR分析を実行します5.

6.貪食アッセイ

  1. 細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に食作用アッセイを実行します。例えば、6時間の刺激の場合、3時間の刺激後に食作用アッセイを開始する。12時間の刺激の場合、刺激開始後9時間で貪食アッセイを開始する。
  2. 比率を考慮して準備に必要なビーズの数を計算します(1セル:50ビーズ)。96ウェルプレートの1ウェルには、8.1 x 106 ビーズが必要です。 表5に従ってビーズ混合物を調製する。
    注意: PBS / FBS混合物に加える前に、ビーズストックバイアルを注意深くボルテックスします。
  3. 37°Cの水浴中で1時間インキュベートします。 10分ごとに渦を流します。
  4. 各ウェルに追加する溶液量を計算します。溶液を加え、3時間インキュベートする。
  5. 1x PBSでウェルを3回すすぎます。550 nm(Cy3発光波長)の蛍光発光を読み取ります。

7. 純度の品質管理

  1. フローサイトメトリー(FACS)によるCD11b磁気単離の純度(細胞選別前後)を評価し、RT-qPCRを実行します。
    1. 細胞をカウントし、FACSバッファー(PBS + 2 mMのEDTA + 0.5%ウシ血清アルブミン)に再懸濁して、ステップ3.5およびステップ3.14の後に10 x 106 細胞/mLの希釈液を取得します。
    2. 従来のFcブロッキング32,33を15分間行った後、マウスCD45、CD11b、CX3CR1、ACSA-2、O4またはそれらに対応するコントロールアイソタイプ32,33に対する生存率プローブ(FVS780)および蛍光色素標識抗体を用いて、細胞をメーカーが推奨する濃度で15分間インキュベートします(材料の表を参照)。
    3. 細胞をFACSバッファーで洗浄し、固定し、市販の透過処理キットで透過処理します(材料の表を参照)。
    4. 透過処理した細胞で再度Fcブロッキングを行い、NeuN( 材料の表を参照)またはそのコントロールアイソタイプに対する蛍光色素標識抗体とともに15分間インキュベートします。
    5. FACSバッファーで洗浄した後、FACS分析を実行します。
    6. 形態学的パラメータおよびFVS780染色に基づいてダブレットおよび死細胞をそれぞれ除外した後、陽性細胞の割合の分析のために、CX3CR1(ミクログリア)、ACSA-2(星状細胞)、O4(希突起膠細胞)、およびNeuN(ニューロン)の細胞内存在の表面発現のためのゲーティング戦略を選択します。
  2. ステップ5に続いて、mRNAを抽出し、RT-qPCRを実行して、 Itgam (CD11b)、Cx3cr1、Olig2、シナプトフィジン、 および Gfap mRNAを定量します。レポーターとして Rpl13a mRNAを用いてCqを正規化し、 Itgam mRNAに対する相対発現を行う。

結果

ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状...

ディスカッション

現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。

古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービ?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

参考文献

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

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