Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Resumen

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Resumen

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.

Introducción

Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado¹. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma ^2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC desempeñan un papel fundamental en la diafonía entre las células parenquimatosas y no parenquimatosas, como las células estrelladas y las células inmunes. Los LSEC son clave para mantener la homeostasis hepática al mantener las células estrelladas y las células de Kupffer en un estado de reposo⁴. Los LSEC modulan la composición de las poblaciones de células inmunes hepáticas mediando la adhesión y la migración transendotelial de los leucocitos circulantes ^5,6. Durante la lesión hepática aguda y crónica 7, incluida^la lesión por isquemia-reperfusión (IRI)⁸, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)⁹ y el carcinoma hepatocelular (CHC), los LSEC experimentan cambios fenotípicos conocidos como capilarización caracterizados por la defenestración y la formación de la membrana basal¹⁰. Estos cambios fenotípicos en los LSEC están asociados con la disfunción de los LSEC y la adquisición de propiedades protrombóticas, proinflamatorias y profibrogénicas.

Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de LSECs del hígado de ratón¹¹. Algunas técnicas dependen de la separación de células no parenquimatosas y parenquimatosas seguidas de centrifugación por gradiente de densidad para purificar los LSEC de las fracciones no paresquimatosas. La limitación de este método es la presencia de macrófagos contaminantes en los pasos finales del aislamiento de LSECs, lo que podría afectar la pureza de los LSECs aislados¹². Este protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y en la selección positiva de perlas magnéticas CD146⁺ de células no paresquimatosas para purificar LSAC. Los LSEC aislados utilizando este método muestran alta pureza y conservan morfología y viabilidad. Estos LSEC son óptimos para estudios funcionales, incluidos los ensayos de permeabilidad y adhesión, así como para estudios posteriores para vías de interés. Además, con el creciente interés en generar grandes conjuntos de datos tanto en la investigación clínica como en la ciencia del descubrimiento, estos LSEC de alta calidad aislados de hígados sanos y enfermos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) u otras afecciones se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos y la comparación entre la salud y la enfermedad^13,14 . Además, los LSEC aislados se pueden emplear para desarrollar modelos bidimensionales y tridimensionales in vitro como organoides para descifrar la vía de señalización activada en LSEC y su comunicación intercelular con otras células hepáticas bajo diferentes estímulos nocivos y en respuesta a diversas intervenciones terapéuticas.

Protocolo

Los protocolos con animales se llevaron a cabo según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados en una instalación de ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con temperatura controlada con acceso gratuito a la dieta.

1. Preparación de un plato o plato de cultivo recubierto de colágeno

1. Para producir 50 ml de ácido acético de 0,02 mol/L, añadir 0,6 ml de ácido acético glacial a 49,4 ml de H₂O.
2. Hacer 50 μg/ml de colágeno tipo I en ácido acético 0.02 mol/L. La dilución depende de la concentración del lote.
3. Cubra los platos de cultivo de 10 cm con 3 ml de solución de colágeno. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   NOTA: Cuando se utiliza un plato o plato diferente para el cultivo, el volumen de la solución de recubrimiento debe ajustarse en función del área de cultivo, generalmente use 6-10 μg / cm².
4. Retire el exceso de líquido de la superficie recubierta y lávese con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces. Deje que los platos se sequen al aire.
5. Si la solución de colágeno no es estéril, esterilice los platos recubiertos de colágeno mediante la exposición a la luz ultravioleta (UV) durante 10 minutos en una campana de cultivo de tejidos estériles.

2. Configuración del equipo

1. Configure el aparato de perfusión de recirculación calentado y humidificado como se muestra en la Figura 1B.
2. Enjuague el sistema de perfusión con lejía al 10% durante 5 minutos, seguido de agua estéril durante otros 10 minutos.
3. Escurra el líquido de enjuague tanto como sea posible antes de perfundir la solución de colagenasa.
4. Infundir solución de colagenasa a través del sistema de perfusión (como se muestra en la Figura 1B) para precalentarla a 37 °C. Ajuste la velocidad de la bomba a la velocidad 1 como se muestra en el dial de control de velocidad (igual a 40 ml/min).
5. Mantenga esta velocidad igual durante todo el procedimiento. Reutilizar la solución de colagenasa en circuito cerrado durante el día del aislamiento de LSEC.
   NOTA: La velocidad de la bomba se fija en 1 para evitar la presión mecánica que podría perturbar la condición biológica de LSEC.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Pesa el ratón.
2. Inyecte 90 mg/kg de peso corporal de ketamina y 10 mg/kg de peso corporal de xilazina por vía intraperitoneal (IP).
3. Una vez que el ratón no sea reactivo a los estímulos dolorosos, asegure el ratón a la superficie quirúrgica, como se muestra en la Figura 1B.
4. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión de ~ 5 cm de largo a partir de la parte inferior del abdomen hasta el proceso xifoide.
5. A continuación, haga dos cortes laterales con pequeñas tijeras de iris a cada lado del abdomen para exponer completamente los órganos abdominales.
6. Coloque la vaina del catéter intravenoso (IV) debajo de la espalda del animal para levantar y nivelar el abdomen.
7. Usando un apósito curvo regular, tire suavemente de los intestinos y el estómago hacia la izquierda del animal.
8. Coloque una sutura quirúrgica 5-0 debajo de la vena cava inferior (IVC) justo debajo del riñón izquierdo expuesto. Ata un enganche suelto en la sutura.
9. Coloque otra sutura quirúrgica 5-0 alrededor de la vena porta hepática (PV) justo encima del punto de ramificación de la vena esplénica fuera de la PV hepática. Ata un enganche suelto en la sutura.
10. Usando la sutura PV como tensión, inserte el catéter 20 G IV en el PV hepático 1 cm por debajo de donde se ramifica a la PV hepática derecha e izquierda.
11. Deslice el catéter por la vena, pero manténgalo debajo del área de ramificación. Permita que la sangre viaje por el catéter hasta que comience a gotear.
12. Con parte del tampón A (Tabla 1) en un frasco intravenoso (IV) colocado sobre el área quirúrgica, use una línea IV y conéctela al catéter. Enjuague el hígado con esta solución mientras evita la entrada de aire en el sistema.
13. Ate la sutura alrededor de la vena cava inferior debajo del riñón. Esto permitirá que el hígado retrofunda la perfusión.
14. Corte el IVC debajo de la sutura para permitir que el animal se desangre.
    NOTA: Este paso debe realizarse rápidamente para evitar la congestión del hígado.
15. Asegure el catéter intravenoso con la sutura PV.
16. Una vez perfundido, corte el estómago, los intestinos, el bazo y otras entrañas adheridas al hígado.
17. Corte el diafragma y los vasos principales de la cavidad torácica. Retire el hígado del animal y colóquelo en la bandeja de perfusión.
18. Retire con cuidado la línea IV y conecte la solución de colagenasa en la cámara de recirculación.
    NOTA: Los pasos 3.16-3.18 deben realizarse dentro de los 5 minutos, para que el hígado no se perfunda demasiado tiempo con Buffer A. Tenga mucho cuidado de no permitir que entren burbujas de aire en el hígado.
19. Permita que el hígado se perfunda hasta que la cápsula se motee y aparezca blanda (10-15 minutos o más, el período varía según los diferentes lotes de colagenasa).
20. Mientras el hígado está en perfusión, asegúrese de que el animal haya fallecido antes de desecharlo en una bolsa de necropsia.
21. Una vez digerido, retire el hígado de la cámara y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con aproximadamente 20 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin suero.
22. Separe suavemente el hígado con un par de puntas de pipeta y deseche el árbol biliar.
23. Filtre la suspensión hepática a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml.
24. Centrifugar la suspensión celular a 50 x g durante 2 min en RT. Recoger el sobrenadante que contiene células hepáticas no parenquimatosas.
    NOTA: Los hepatocitos se precipitan en el pellet, que se puede purificar aún más mediante centrifugación por gradiente como se describió anteriormente¹⁵.

4. Separación de células hepáticas no paresquimatosas y purificación de LSEC

NOTA: Purifique los LSEC CD146⁺ utilizando las perlas inmunomagnéticas, siguiendo las instrucciones del fabricante.

1. Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
2. Recoja el pellet de celda y vuelva a suspenderlo en 1 ml de tampón de aislamiento (Tabla 1), determine el número de celda utilizando un contador de celda automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C, aspirar el sobrenadante por completo.
4. Resuspend el pellet con 90 μL de tampón de aislamiento por 10⁷ células totales.
5. Añadir 10 μL de perlas magnéticas CD146 por cada 10⁷ células totales. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
6. Para lavar las células, agregue 1-2 ml de tampón de aislamiento por cada 10⁷ células, centrífuga a 300 x g durante 10 minutos y luego aspire el sobrenadante por completo.
7. Resuspendir hasta 10⁹ celdas en 500 μL de tampón de aislamiento (Tabla 1).
   NOTA: Para números de celda más altos, escale el volumen del búfer en consecuencia.
8. Prepare la columna de separación, enjuáguela con 3 ml de tampón de aislamiento.
9. Aplique la suspensión de celda sobre la columna apilada con filtros de preseparación de 70 μm.
10. Lave la columna con los 3 ml de tampón de aislamiento 3 veces.
    NOTA: Al lavar la columna, el búfer de aislamiento debe agregarse tan pronto como el depósito de la columna esté vacío.
11. Retire la columna del separador y colóquela sobre un tubo centrífugo de 15 ml. Pipeta 5 ml de tampón de aislamiento sobre la columna.
12. Para recuperar las células marcadas con cuentas magnéticas, empuje firmemente el émbolo hacia la columna para eliminar las células.
13. Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Los LSEC están listos para el examen microscópico y el análisis posterior.

5. Inmunofenotipificación de LSEC y evaluación de la pureza por citometría de flujo

1. Determine los números de celda de los LSEC aislados utilizando un contador de celdas automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante por completo.
3. Tomar 1 x 10⁶ células/tubo y resuspend con 90 μL de tampón de tinción (Tabla 1).
4. Añadir 10 μL/tubo de bloque FcR de ratón y 1 μL de colorante de viabilidad, incubar a 4 °C durante 10 min.
5. Mante las células con una combinación de anticuerpos CD45, CD146 y estabilina-2 diluidos a 1:50 con tampón de tinción. Incubar a 4 °C durante 20 min.
6. Lave las células con 5 ml de tampón de tinción y centrífuga a 300 x g durante 10 min, luego aspire el sobrenadante por completo.
7. Resuspend las células con 300 μL de tampón de tinción y correr a través del citómetro de flujo.

6. Cultura y examen de LSECs

1. Sembrar 1 x 10⁶ células/pocillo en una placa de 6 pocillos y cultivarlo con medio de crecimiento de células endoteliales que consiste en 5% de suero fetal bovino (FBS), 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y solución de primocina al 1%.
2. Examinar los LSEC aislados mediante microscopía de luz. Adquiera imágenes de campo brillante con un aumento de 10x.

7. Examen de morfología y fenestra de LSECs mediante microscopía electrónica de barrido

1. Cubra previamente los insertos de cultivo celular (tamaño de poro de 3 μm) con solución de colágeno.
2. Cultivo aislado de LSEC (120.000 células) en el inserto con medio de crecimiento de células endoteliales en una placa de 24 pocillos a 37 °C atmósfera cálida y humidificada. Deje que las células se asienten y se adhieran durante 2 h.
3. Para la fijación celular, agregue un volumen equivalente de fijador de Trump precalentado a 37 ° C a los medios de cultivo celular.
4. Después de la incubación durante 10 minutos, reemplace el fijador de Trump diluido al 50% con el fijador de Trump sin diluir.
5. Fije las células en el fijador Trump durante 2 h, luego incube durante 1 h en tetróxidos de osmio al 1%.
6. Proceda con la deshidratación de las muestras, el secado en un dispositivo de secado de punto crítico, el montaje, el recubrimiento por pulverización y el examen con un microscopio electrónico de barrido.

Resultados

Esquemas experimentales y configuración de equipos:
En este protocolo, el hígado de ratón se digirió utilizando un circuito de perfusión cerrado, luego las células no parentales y los hepatocitos se separaron mediante centrifugación de baja velocidad a 50 x g durante 2 min. Los LSEC primarios se aislaron utilizando la selección de perlas magnéticas CD146 de la fracción no parnquimatosa. Los esquemas experimentales se muestran en la Figura 1A. La cánula...

Discusión

En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selecci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07