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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

Une méthode non marquée et non radio-isotopique pour tester l’activité de l’uracile-ADN glycosylase a été mise au point à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour l’analyse directe du produit contenant un site apurinique/apyrimidinique. Le test s’est avéré assez simple, spécifique, rapide et facile à utiliser pour la mesure de l’ADN glycosylase.

Résumé

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) est un composant clé de la voie de réparation de l’excision de base pour la correction de l’uracile formé à partir de la désamination hydrolytique de la cytosine. Ainsi, il est crucial pour le maintien de l’intégrité du génome. Une méthode très spécifique, non étiquetée et non radio-isotopique a été développée pour mesurer l’activité UDG. Un duplex d’ADN synthétique contenant un uracile spécifique au site a été clivé par UDG, puis soumis à une analyse de spectrométrie de masse à temps de vol MALDI-TOF MS (MalDI-TOF MS) assistée par laser assistée par matrice. Un protocole a été établi pour préserver le produit du site purinique/apyrimidinique (AP) dans l’ADN sans rupture de brin. La variation de la valeur m/z du substrat au produit a été utilisée pour évaluer l’hydrolyse de l’uracile par UDG. Un substrat G:U a été utilisé pour l’analyse cinétique UDG donnant le Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s et Kcat = 9,31 s-1. L’application de cette méthode à un essai d’inhibiteur de l’uracile glycosylase (UGI) a donné une valeur IC50 de 7,6 pM. La spécificité de l’UDG utilisant l’uracile à différentes positions dans les substrats d’ADN simple brin et double brin a démontré différentes efficacités de clivage. Ainsi, cette méthode SIMPLE, rapide et polyvalente MALDI-TOF MS pourrait être une excellente méthode de référence pour diverses glycosylases d’ADN monofonctionnelles. Il a également le potentiel d’être un outil pour le dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

Introduction

Bien que l’uracile soit une base normale dans l’ARN, il s’agit d’une lésion commune et hautement mutagène dans l’ADN génomique. L’uracile peut résulter d’une désamination hydrolytique spontanée/enzymatique d’une désoxycytidine. Dans chaque cellule vivante, cette désamination se produit 100 à 500 fois par jour dans des conditions physiologiques1,2. Si ces altérations ne sont pas réparées, il peut y avoir un changement dans la composition de la séquence d’ADN, provoquant une mutation. Comme l’uracile dans l’ADN préfère s’apparier avec le dATP pendant la réplication, si la cytosine se désamine en uracile, dans deux événements de réplication, il y aura une nouvelle mutation de transition G:C à A:T dans la moitié de l’ADN de la descendance3.

Parmi les stratégies cellulaires pour maintenir la stabilité génétique, la réparation de l’excision de base (BER) est un mécanisme essentiel qui répare les bases endommagées, telles que l’uracile, dans l’ADN4. Le BER est un processus hautement conservé sur le plan de l’évolution. Il existe deux voies BER générales : la voie à patch court menant à un tractus de réparation d’un seul nucléotide et la voie à long patch qui produit un tractus de réparation d’au moins deux nucléotides5. Le BER est un mécanisme coordonné qui se déroule en plusieurs étapes. La première étape du BER est l’hydrolyse enzymatique de la base nucléotidique endommagée par une glycosylase d’ADN spécifique aux dommages pour générer un site intermédiaire purinique/apyrimidinique (AP)6. Ceci est suivi par le clivage de l’épine dorsale sucre-phosphate sur le site AP par une endonucléase, le nettoyage des extrémités de l’ADN par une lyase, le remplissage de l’espace par une ADN polymérase et le scellement de l’entaille finale par une ligase5.

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) hydrolyse l’uracile à partir de l’ADN contenant de l’uracile pour le BER chez Escherichia coli. Les tests UDG conventionnels utilisant de l’ADN radiomarqué impliquant différentes techniques de séparation6,7,8,9,10,11,12,13 prennent généralement beaucoup de temps, demandent beaucoup de main-d’œuvre, avec des réactifs d’étiquetage coûteux, des procédures compliquées et nécessitent une formation et une pratique intensives pour réduire les risques d’exposition aux matières radioactives. Des dosages fluorométriques d’oligonucléotides ont été développés en remplacement du marquage des radio-isotopes14, en plus des balises moléculaires et de la technologie de transfert d’énergie par résonance de Förster15,16,17,18,19,20. Cependant, un étiquetage spécifique est requis pour toutes les méthodes susmentionnées. Récemment, des tests de biocapteurs sans étiquette21,22,23 et des méthodes colorimétriques basées sur la formation d’un G-quadruplex24,25,26 ont été développés. Cependant, plusieurs paires A:U ou séquences spécialement conçues dans les sondes compliquent la définition de l’unité enzymatique.

MALDI-TOF MS est une technologie qui pourrait être d’une grande utilité dans l’analyse de l’ADN. Les applications développées comprennent le génotypage du polymorphisme mononucléotidique27,28, l’analyse de nucléotides modifiés29 et l’identification intermédiaire de réparation de l’ADN30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS devrait être facilement adopté pour l’analyse de l’ADN glycosylase afin de détecter les produits d’ADN contenant du site AP. Cependant, les sites AP dans l’ADN sont sujets à la rupture des brins dans de nombreuses conditions expérimentales33. Un test UDG est présenté ici en utilisant MALDI-TOF MS pour mesurer directement la production du site AP sans bruit de rupture de brin significatif. Cette méthode sans étiquette est facile à utiliser et présente un potentiel élevé pour l’application pharmaceutique du dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

Protocole

1. Préparation du substrat/gabarit

  1. Concevez un substrat d’uracile / gabarit duplex avec une teneur équilibrée en G + C d’environ 50 ± 10% et une température de fusion minimale de 50 ° C pour la région duplex.
    REMARQUE : Une différence de nucléotide entre les substrats de 18 nt et les gabarits de 19 nt (tableau 1 et figure 1) permet une meilleure interprétation du signal MS et un recuit approprié. Le brin modèle sert d’ADN complémentaire pour générer des incohérences A-U ou G-U (tableau 1), mais peut également être utilisé comme signal de référence dans les mesures de SEP. L’utilisation d’oligonucléotides synthétiques purifiés par CLHP est satisfaisante pour cette étude.
  2. Dissoudre l’ADN dans 1 mM d’EDTA et 10 mM de Tris-HCl(pH 8,0 à 25 °C) (TE) à une concentration de 100 μmol/L comme bouillon et conserver à -20 °C. Diluer cette matière de 20 μL avec TE jusqu’à un volume final de 800 μL (dilution 25 fois à 4 μmol/L). Mesurer l’absorbance de la solution d’ADN dans un spectrophotomètre UV visible à λ = 260 nm pour s’assurer de la concentration assignée par le fabricant. Par exemple : A260 = 0,204 pour 4 μmol/L de U+9 et A260 = 0,192 pour 4 μmol/L de T1 (tableau 1).
  3. Effectuer l’analyse MALDI-TOF MS (sections 4-6) pour le contrôle de la qualité des oligonucléotides en inspectant les signaux de crête uniques aux valeurs m/z désignées ainsi qu’en vérifiant que le rapport signal/bruit est >100 (Figure 1B et Figure 1D).

2. Dosage de l’ADN glycosylase

  1. En utilisant un substrat G:U de duplex T1/U+9 (tableau 1 et figure 1A) pour la réaction de glycosylase, par exemple, dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 70 μL de H2O, 10 μL de tampon de réaction UDG 10x, 5 μL de stock T1 et 5 μL de stock U+9 (étape 1.2.).
    REMARQUE: Choisissez le bon type de micropipette et suivez les instructions du fabricant pour gérer le volume requis. Par exemple, utilisez une pipette de 2 μL pour distribuer 0,1 à 2 μL de liquide, utilisez une pipette de 10 μL pour distribuer 2 à 10 μL de liquide et utilisez une pipette de 100 μL pour distribuer 20 à 100 μL de liquide afin d’assurer l’exactitude et la précision des résultats. Le volume décrit du mélange de réactifs est pour 10 essais; ajuster le volume pour le nombre de réactions souhaité. Le tampon de réaction 1x UDG contient 1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol et 20 mM de Tris-HCl (pH de 8,0 à 25 °C). Voir le tableau des matériaux pour la source du tampon de réaction UDG 10x.
  2. Fermez solidement le tube; incuber au bain-marie pendant 30 min à 65 °C, puis pendant 30 min à 37 °C, et enfin sur glace pendant 3 min pour assurer un recuit correct du duplex substrat/gabarit.
  3. Dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 49 μL de tampon de réaction UDG glacé 1x et 1 μL d’UDG (5 000 unités/mL; voir la Table des matériaux), en diluant à 0,1 unité/μL. Effectuez des dilutions en série avec 1x tampon UDG aux concentrations enzymatiques souhaitées de 0,05, 0,02 ou 0,01 unité/μL. Conservez toujours l’UDG dilué sur de la glace.
    REMARQUE: Dans une réaction de 10 μL, 0,1 unité d’UDG peut cliver plus de 30 pmol d’uracile d’un duplex T1 / U + 9 en 3 min.
  4. Dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 9,0 μL de mélange de substrat à partir de l’étape 2.2 et pré-préchauffer le tube à 37 °C. Ajouter 1,0 μL de l’UDG dilué de l’étape 2.3. Utilisez une minuterie pour chronométrer la réaction et faites glisser le tube pour mélanger le contenu.
    REMARQUE: Pour un test de définition d’unité, le temps d’incubation est de 30 min. Pour un essai cinétique, utilisez une analyse temporelle de 0,5, 1, 2, 3, 5 min pour obtenir le taux initial. Pour un test d’inhibition de l’UGI, chronométrez la réaction pendant 15 min.
  5. Centrifuger les tubes avec le mélange réactionnel pendant 3-5 s à 3 200 × g à température ambiante. Ensuite, transférez immédiatement la réaction à 37 °C.
  6. Fin de la réaction
    1. Préparer des solutions de base de 0,25 M HCl et 0,23 M Tris. Dans un tube à essai de 15 mL, ajouter 10 mL d’une solution de 1 mM d’EDTA et 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0 à 25 °C) pour imiter 1x tampon de réaction UDG. Acidifiez avec 1 mL de 0,25 M HCl et vérifiez avec un pH-mètre pour vous assurer que le pH est d’environ 2 ± 0,5. Neutraliser avec 1 mL de base Tris de 0,23 M et vérifier avec un pH-mètre un pH final de 6,5 ± 0,5.
      REMARQUE: L’utilisation de bandelettes de test de pH est un moyen rapide et facile de reconfirmer les niveaux de pH du mélange de réactifs.
    2. Ajouter 1 μL de 0,25 M HCl pour acidifier le mélange réactionnel de 10 μL afin d’inactiver l’enzyme et le placer sur de la glace pendant 6 min. Ajouter 1 μL de base Tris de 0,23 M pour neutraliser les produits à base d’ADN afin d’éviter la rupture du site AP par une exposition prolongée à l’acide. Ajouter 13 μL TE pour augmenter le volume du mélange de produits pour le transfert de puce matricielle , puis placez-le sur de la glace.
      REMARQUE: Le produit AP est chimiquement instable et doit être analysé par MALDI-TOF MS dans les 2 jours. Après un stockage prolongé de plus d’une semaine, l’accumulation d’une partie importante des ruptures de brins se produit en raison de réactions d’élimination β/δ des produits AP (Figure 1D-G).
  7. Transférer tous les produits de réaction UDG de 25 μL des tubes de microcentrifugation vers une plaque de microtitrage de 384 puits.
    REMARQUE: Des concentrations élevées de cations, tels que le sodium ou le potassium dans les tampons, génèrent des interférences dans l’analyse MALDI-TOF MS et nécessitent donc un dessalement. Comme le tampon de réaction UDG d’E. coli contient de très faibles concentrations de cations, le dessalement n’est pas nécessaire. Cependant, modifiez ce protocole pour mesurer d’autres réactions d’ADN glycosylase contenant des cations métalliques qui nécessitent un dessalement comme décrit précédemment35.

3. Transférer les produits de réaction UDG sur une puce matricielle

  1. Ouvrez la porte du distributeur de nanolitres (voir le tableau des matériaux) et chargez la plaque de microtitrage de 384 puits de l’étape 2.7 sur le support de plaque du pont.
  2. Insérez le réseau de puces matricielles dans la position correspondante de la plaque de reconnaissance. Placez la plaque de reconnaissance chargée sur le pont de traitement du distributeur de nanolitres et fermez la porte.
  3. Appuyez sur le bouton d’exécution de l’écran de transfert et attendez que l’instrument commence à distribuer des échantillons de la plaque de microtitrage de 384 puits à la puce matricielle.
  4. Utilisez l’option de l’onglet Vision pour afficher l’image de la puce et les volumes de distribution pour chaque endroit pendant la distribution. Assurez-vous que le volume tacheté sur la puce est compris entre 5 et 10 nL.

4. Configurez les paramètres de dosage sur le spectromètre de masse

  1. Utilisez le programme d’application (voir la table des matériaux) pour préparer un fichier .xlsx contenant la valeur m/z prévue du signal pour l’importation.
    REMARQUE : Les paramètres du fichier I.xlsx (Tableau 2) sont des exemples de paramètres pour le test UDG du substrat G:U dans la section 2.
  2. Utilisez le programme d’application pour créer et définir un nouveau test UDG en cliquant avec le bouton droit sur l’option Importer le groupe de tests au format Designer et en sélectionnant le fichier .xlsx dans la liste déroulante (par exemple, FICHIER I.xlsx de l’étape 4.1).
  3. Cliquez avec le bouton droit sur le bouton Customer:Project:Plate et cliquez en haut de l’arborescence déroulante des options pour établir une nouvelle plaque de test. Dans la boîte de dialogue, tapez un nom de fichier (par exemple, CTT20210620 pour le code de laboratoire et la date du test), puis dans la liste déroulante Type de plaque , sélectionnez le type de plaque à 384 puits et appuyez sur OK. Recherchez une plaque vierge à afficher à droite de l’écran.
  4. Cliquez sur l’option Test ; sélectionnez le test (par exemple, FICHIER I.xlsx) dans la liste déroulante.
  5. Pour affecter le test sélectionné (par exemple, FICHIER I.xlsx) à chaque position de point d’échantillon sur la plaque, déplacez le curseur sur chaque position de la plaque vierge, cliquez pour mettre en surbrillance le puits, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Ajouter Plex.
  6. Utilisez un ordinateur de bureau ou un ordinateur portable pour préparer une liste de travail en format .xlsx sans en-tête (p. ex., 0620.xlsx du tableau 3) pour tous les échantillons sur la puce de l’étape 2.7. Cliquez sur le bouton Ajouter un nouvel exemple de projet ; sélectionnez le fichier (par exemple, 0620.xlsx) dans la liste déroulante pour importer la liste de travail.
  7. Recherchez tous les exemples de codes de test dans la liste de travail (par exemple, à partir de 0620.xlsx) à gauche de l’écran. Cliquez sur l’exemple de code dans la liste de travail et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la position correspondante de la plaque pour lier les tests à chaque position.

5. Fonctionnement du spectromètre de masse

  1. Utilisez le programme d’application pour relier le spectromètre de masse (voir le tableau des matériaux) à la puce d’échantillon (de la section 3) à analyser.
  2. Cliquez sur le paramètre par défaut. Dans la boîte de dialogue, tapez un nom de fichier à partir de l’étape 4.3 (par exemple, CTT20210620) ; dans le nom de l’expérience, tapez l’ID de la puce dans le code-barres de la puce et enregistrez les paramètres.
  3. Démarrez le programme de contrôle du spectromètre de masse (voir le tableau des matériaux).
  4. Appuyez sur le bouton d’entrée/ sortie du spectromètre de masse et laissez le pont s’étendre. Retirez le porte-puce et insérez l’échantillon de puce de l’étape 3.4 dans le porte-puce. Placez le porte-puce chargé sur le pont étendu et appuyez sur le bouton d’entrée/sortie pour que la puce d’échantillon pénètre dans l’instrument.
  5. Double-cliquez sur l’icône Acquérir du programme d’application. Dans la fenêtre Acquérir , cliquez sur l’onglet Exécution automatique pour démarrer l’instrument et acquérir des spectres de masse à partir des échantillons de la puce.

6. Visualisation des spectres de masse et analyse des données

  1. Exécutez le programme d’analyse des données (voir la table des matériaux).
  2. Parcourez l’arborescence de la base de données et sélectionnez l’ID de puce à l’étape 5.2. Cliquez pour mettre en surbrillance un puits cible sur la puce, puis cliquez sur l’icône de spectre pour afficher le spectre de masse.
  3. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour choisir Boîte de dialogue de personnalisation afin de recadrer une plage de spectre spécifique dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur l’axe X pour taper les limites supérieure et inférieure de m/z, puis appuyez sur OK pour afficher le spectre de plage spécifié, y compris les signaux d’intérêt.
    REMARQUE: La quantité d’ADN est proportionnelle à l’intensité maximale à chaque unité de valeur m / z.
  4. Mesurez la hauteur de crête des valeurs m/z des signaux correspondant au substrat U, au produit AP et au modèle. Cliquez sur le pic et affichez la hauteur du pic dans le coin supérieur gauche de l’écran.
    REMARQUE: Un spectre de 1 600 largeur / 1 200 unité est une dimension raisonnable pour l’inspection sur un écran d’ordinateur ainsi que pour la tenue de dossiers.
  5. Pour enregistrer le spectre pour la tenue de dossiers, cliquez avec le bouton droit sur Exporter et sélectionnez Type de fichier JPEG dans la liste déroulante. Cliquez sur Destination et Parcourir le disque pour sélectionner le périphérique de stockage dans la liste déroulante (par exemple, le disque flash E:). Tapez le nom du fichier (par exemple, 0620_1-2.jpg) et cliquez sur Exporter.
  6. Si nécessaire, imprimez un fichier JPEG exporté et mesurez manuellement la hauteur de crête à l’aide d’une règle.

Résultats

Modèles et substrats
En prenant des oligonucléotides synthétiques avec U au centre (U + 9) associés à un gabarit G à titre d’exemple (Figure 1A), un contrôle à blanc des quantités équimolaires de substrat contenant du gabarit et de l’uracile peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de la pureté des oligonucléotides synthétiques (Figure 1B; les signaux correspondent au m / z désigné et au faible bruit de fond). P...

Discussion

Cet article fournit une procédure détaillée pour l’utilisation d’une méthode de dosage UDG MALDI-TOF MS pour détecter directement les produits d’ADN contenant de l’AP. Les principaux avantages de cette méthode sont que les substrats contenant de l’uracile sont sans étiquette, évolutifs, faciles à travailler et offrent une plus grande flexibilité dans la conception du substrat.

L’extraction phénol/chloroforme recommandée par le fournisseur UDG permet l’inactivation de ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Centre intégré de génomique fonctionnelle du NCFPB (Taipei, Taïwan) et le Laboratoire de pharmacogénomique du NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan, R.O.C. [numéro de subvention MOST109-2314-B-002 -186 à K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 à S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 à W.-h.F.]. H.-L.C. est récipiendaire d’une bourse de doctorat de l’Université nationale de Taiwan. Financement de la redevance pour le libre accès : Ministère des sciences et de la technologie, R.O.C.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

Références

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