Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי C57BL / 6J. מחקרים הראו כי התרחשות והתפתחות של NEC קשורים לעלייה בתאי T helper מסוג 2 (Th2) ובדרך כלל מלווים בזיהום. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c יילודים כדי לגרום למודל NEC עם מאפיינים קליניים דומים ושינויים פתולוגיים במעיים כמו אלה שנצפו אצל ילדים עם NEC. מחקר נוסף הוא מוצדק כדי לקבוע אם מודל זה בעלי חיים יכול לשמש כדי ללמוד תגובות תא Th2 ב NEC.

Abstract

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי C57BL / 6J. מחקרים הראו כי התרחשות והתפתחות של NEC קשורים לעלייה בתאי T helper מסוג 2 (Th2) ובדרך כלל מלווים בזיהום. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c יילודים כדי לגרום למודל NEC עם מאפיינים קליניים דומים ושינויים פתולוגיים במעיים כמו אלה שנצפו אצל ילדים עם NEC. מחקר נוסף הוא מוצדק כדי לקבוע אם מודל זה בעלי חיים יכול לשמש כדי ללמוד תגובות תא Th2 ב NEC.

Introduction

נמק enterocolitis (NEC), המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI), מתרחשת ברוב הפגים (>90%), במיוחד אלה עם משקל לידה נמוך מאוד (VLBW)1. בתינוקות פולקסווגן, שכיחות המחלה נעה בין 10% ל -12%, ותמותת הילדים שאובחנו עם NEC היא בין 20% ל -30% 2,3. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לפציעות רירית, פלישה על ידי חיידקים פתוגניים, והאכלת מעיים, אשר יכול להוביל לתגובות דלקתיות ואת אינדוקציה של פציעות מעיים ב המארחים הרגישים3. הפתוגנזה של NEC אינה ברורה. מחקרים רלוונטיים מראים כי התגובה החיסונית של התינוק המושפע היא חריגה, ורגישות גנטית, מתח מיקרו-וסקולרי ושינויים חיידקיים במעיים עשויים למלא תפקידים חשובים במחלה3.

מודל בעלי החיים NEC הוא כלי חיוני למחקר על הפתוגנזה של NEC. מיני בעלי החיים המשמשים למודלים של NEC הם חזירים, חולדות ועכברים. עם זאת, בשל תקופת ההיריון הארוכה, מחזורי הצמיחה והעלויות הגבוהות, בשנים האחרונות החזירים לא היו הבחירה הראשונה עבור דגמי NEC והוחלפו בחולדות או בעכברים4. מכיוון שיש הבדלים ברקע החיסוני של זני עכבר שונים5, מחקרים שונים צריכים להשתמש בזנים שונים של עכברים כדי להקים מודלים של בעלי חיים NEC. לעכברי BALB/c יש תכונה חשובה; כאשר הם נגועים או להתמודד עם נזק חיצוני, הקיטוב של תאי TH2 במהלך זיהום בעכברים הוא חזק משמעותית מזה בזנים אחרים של עכברים6,7,8. תאי עוזר T ממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות ובהתקדמות של NEC, במיוחד הפיתוח של תאי TH23,9,10,11. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c כדי להקים את מודל NEC, אשר עשוי להיות מועיל עבור מחקר מחלת NEC על תאי T.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של המרכז הרפואי לנשים וילדים בגואנגג'ואו (מס '174A01) והוועדה האתית לבעלי חיים של גואנגג'ואו Forevergen Biosciences המעבדה לביוסיות מרכז בעלי חיים (IACUC-G160100). כל בעלי החיים גודלו באותו חדר בסביבה ספציפית ללא פתוגנים (SPF), וניסויים בוצעו בסביבה קונבנציונלית. העכברים ששימשו לרבייה היו בני 7-8 שבועות; העכברים לגרימת NEC (n = 72) הופרדו מהסכר ביום 4, והסכרים (n = 14) הוחזקו בכלוב המקורי וטיפלו בעכברים קבוצתיים (Cont.) (n = 24).

1. הכנת ריאגנטים ומכשירים

  1. הכן את תחליף החלב לעכברי BALB / c ביחס המקביל (אבקת חלב פגה: אבקת חלב עיזים = 2:1).
    הערה: ההרכבים התזונתיים הסופיים של חלב פורמולה12 מוצגים בטבלה 1.
  2. פתרון LPS (2.5 מ"ג/מ"ל)
    1. ממיסים בסך הכל 10 מ"ג אבקת LPS ב-4 מ"ל של מים מעוקרים עם זיקוק כפול, מערבבים היטב ומאחסנים במקרר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחר ההדבקה.
      הערה: פתרון LPS מאוחסן בחושך ב 2-8 °C (8 °F) לשימוש מיידי או ב -20 °C (20 °F) לאחסון לטווח ארוך.

2. לגרום לנמק enterocolitis בעכברים BALB / c יילודים

  1. להאכיל את העכברים יילודים.
    1. שמור את העכברים יילודים באותו כלוב עם הסכר, מטופל על ידי הסכר בימים 0-4.
    2. בליל יום 4 (כאשר העכברים היולדות שוקלים 2.5-3 גרם), להפריד את העכברים היילוד בקבוצת NEC מן הסכר כדי לגרום NEC, לשמור אותם באינקובטור בעלי חיים, ולהאכיל אותם עם נוסחה. עם זאת, הקבוצה Cont. מותר להישאר עם ולהיות מוזן על ידי הסכר.
      הערה: עכברים יילודים המופרדים מהסכר חייבים להיות מורמים באינקובטור בגלל ויסות טמפרטורת הגוף החלשה שלהם.
  2. הכן את צינור gavage על ידי השרייתו ב 75% מיכלי אלכוהול במשך 1-2 דקות ולשטוף אותם פעמיים במים נקיים, מזוקקים כפול.
    הערה: כדי למנוע זיהום צולב בין העכברים, יש לבצע את התהליך לעיל לאחר האכלת כל עכבר.
  3. לגרום למודל NEC.
    1. קח את העכברים הילודים מהסכר ביום 4 וצום אותם ללילה אחד.
    2. Gavage העכברים עם LPS (20-30 μL בכל פעם) ולהאכיל אותם עם נוסחה ביום 5 (40-50 μL בכל פעם).
    3. מיום 5 ואילך, הכפיפו את העכברים למחזור היפוקסיה-ראוקסיגניה-הלם קר פעמיים ביום במשך 5 ימים. מניחים את העכברים במכשיר היפוקסיה ב 5% O2 עבור 90 s ו reoxygenate אותם במשך 3 דקות; חזור על תהליך זה חמש פעמים. לאחר מכן, מניחים את העכברים בסביבה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן מעבירים אותם לאינקובטור. ראו איור 1A,B לתהליך האינדוקציה.
      הערה: מחזור של גירוי היפוקסיה-reoxygenation-קר בוצע פעם בבוקר ופעם אחר הצהריים. תערובת של 5% O2 עם 95% N2 הוכן במיכל, והריכוז נמדד עם גלאי חמצן.
  4. התבונן מקרוב בכל העכברים, שקול אותם כל יום, תיעד את הישרדות העכברים במהלך תקופת האינדוקציה, ותיעד את מאפייני הצואה (עם או בלי שרפרפים דביקים / שרפרפים מדממים).
    הערה: דגם NEC שנקבע נמשך 5 ימים.
  5. ביום 10 או מוקדם יותר, כאשר העכברים מראים תסמיני NEC (ileus, hematochezia, שלשולים)13, להרדים את העכברים על ידי הרדמה שאיפה עם איזופלוריין, ואז מיד לאסוף את רקמת המעי. אל תאסוף רקמות מהעכברים שמתו באופן ספונטני.
    הערה: במחקר זה, נקודת הקצה של המתת חסד העכבר הותאמה כאשר העכבר הציג המטוצ'זיה וכיחלון של כל הגוף.

3. גבאג' העכבר

  1. תקן את ראש העכבר, מחזיק את צינור הקיבה ביד ימין. הכנס את צינור הקיבה מהפינה השמאלית של פי העכבר.
    הערה: הראש תוקן עם האצבע המורה על ראשו של העכבר ולחץ בעדינות אחורה ולמטה כדי למנוע מהעכבר להתכופף קדימה במהלך הניתוח ולהשפיע על החדרת צינור הקיבה.
  2. לאט להזיז את הצינור למרכז הפה. לאחר החדרת הצינור כ 2-3 ס"מ, לדחוף 40-50 μL של נוסחה או 20-30 μL של LPS לתוך מערכת העיכול. ראו איור 2A,B עבור ה-gavage.
    הערה: בנסיבות רגילות, צינור הקיבה מוכנס למערכת העיכול בצורה חלקה. אם לעכבר יש רפלקס הקאות חזק, צינור הקיבה הוכנס לקנה הנשימה בטעות. צינור הקיבה חייב להיות שלף בעדינות את העכבר מותר לנוח לזמן מה לפני ניסיון gavage שוב. בנוסף, הליך gavage משמש כדי לגרום למודל של NEC לפני המתת חסד של עכברים.

4. לאסוף דגימות רקמת מעיים טריות עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) כתמים

  1. יש לטבול את רקמת האיליום הטרייה מהעכבר ב-10% פורמלין למשך 24 שעות.
  2. מטמיעים את הרקמות בפרפין ופורסים אותן ל-4 מיקרומטר.
  3. הפוך את החלקים בקסילן לטהר אותם ברציפות באתנול מוחלט, 95% אתנול, 80% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול, ומים מזוקקים, השריה במשך 5 דקות בכל שלב. להכתים את החלקים עם פתרון המטוקסילין במשך 5 דקות ולהבדיל אותם 1% חומצה הידרוכלורית ב 75% אלכוהול עבור 5 s. לבסוף, להכתים אותם עם פתרון אאוזין במשך 1 דקות.
    הערה: לאחר כתמים עם פתרון המטוקסילין, זה חייב להיות מובחן עם 1% חומצה הידרוכלורית באתנול כדי להסיר פתרון המטוקסילין קשור יתר על המידה וצבע המטוקסילין ציטופלסמי. הריכוז של 1% חומצה הידרוכלורית מתאים לרקמת המעי.
  4. בדוק את ההיסטופתולוגיה של רקמת המעי בהגדלה של פי 40.

תוצאות

מודל NEC עכבר BALB / c הושרה על ידי האכלת פורמולה, האכלת LPS, היפוקסיה, וגירוי קר. במהלך תקופת האינדוקציה, העכברים נצפו עבור פתולוגיה מעיים, מאפייני הצואה, שינויים במשקל הגוף, והישרדות יומיומית. תמונות מייצגות של המעי הדק במהלך אינדוקציה NEC; המספרים בתמונה מייצגים את ציון פתולוגיית המעי מ- 0 (אפיתל ?...

Discussion

NEC הוא מצב החירום הנפוץ ביותר במערכת העיכול עבור יילודים, עם שכיחות גבוהה ותמותה, במיוחד בפגים 1,2,3. עם זאת, הפתוגנזה שלה עדיין לא ברורה. הוא האמין כיום כי נזק הרירית, פלישת פתוגן, האכלה אנטאלית הם גורמי סיכון גבוה עבור NEC3. עד כה, ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לבנק המשאבים הביולוגיים הקליניים של המרכז הרפואי לנשים ולילדים בגואנגג'ואו על מתן המדגם הקליני ומרכז בעלי החיים של המעבדה לביו-מדעי גואנגג'ואו פוראברגן על אספקת עכברים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק 81770510 (R.Z.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., LTD.100092683
Goat Milk powder Petag 71795558417
HE dye solutionSinopharm Chemical Reagent Co., LTD.G1003
IsofluraneRWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.R510  
LPSSigma-AdrichL2880
Medical oxygenvariousvarious
MicroscopeNIKONNIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resinSinopharm Chemical Reagent Co., LTD.10004160
Paraffinvariousvarious
Premature baby milk powderAbbott57430
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., LTD.10023418
1% Hydrochloric acidvariousvarious
10% FormalinLEAGENEDF0110

References

  1. Horbar, J. D., et al. Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009. Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).
  2. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  3. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  4. Sangild, P. T., et al. Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).
  5. Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice. Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).
  6. Kuroda, E., Yamashita, U. Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice. Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).
  7. Fornefett, J., et al. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).
  8. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  9. Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. T cells in preterm infants and the influence of milk diet. Frontiers in Immunology. 11, 1035 (2020).
  10. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  11. Afrazi, A., et al. New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond. Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).
  12. Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat. British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).
  13. Liu, Y., et al. Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).
  14. MohanKumar, K., et al. A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions. Nature Communications. 10 (1), 3494 (2019).
  15. He, Y. M., et al. Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation. Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).
  16. Cho, S. X., et al. Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities. Nature Communications. 11 (1), 5794 (2020).
  17. Halpern, M. D., et al. Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).
  18. Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
  19. Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).
  20. Chuang, S. L., et al. Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis. Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177BALB CT helper 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved