Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante

Resumen

La enterocolitis necrosante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave que a menudo ocurre en bebés prematuros, especialmente en bebés de muy bajo peso al nacer, con alta mortalidad y patogénesis poco clara. La causa de la NEC puede estar relacionada con anomalías inflamatorias del sistema regulador inmunitario. Un modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación inmune de la enfermedad NEC. Los modelos animales NEC generalmente usan ratones neonatales C57BL / 6J; Los ratones neonatales BALB/c rara vez se utilizan. Los estudios relacionados han demostrado que cuando los ratones están infectados, la diferenciación de células Th2 es predominante en ratones BALB / c en comparación con ratones C57BL / 6J. Los estudios han sugerido que la aparición y el desarrollo de NEC se asocian con un aumento en las células T auxiliares tipo 2 (Th2) y generalmente se acompañan de infección. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB/c neonatales para inducir un modelo de NEC con características clínicas similares y cambios patológicos intestinales como los observados en niños con NEC. Se justifica un estudio adicional para determinar si este modelo animal podría usarse para estudiar las respuestas de las células Th2 en NEC.

Resumen

La enterocolitis necrosante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave que a menudo ocurre en bebés prematuros, especialmente en bebés de muy bajo peso al nacer, con alta mortalidad y patogénesis poco clara. La causa de la NEC puede estar relacionada con anomalías inflamatorias del sistema regulador inmunitario. Un modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación inmune de la enfermedad NEC. Los modelos animales NEC generalmente usan ratones neonatales C57BL / 6J; Los ratones neonatales BALB/c rara vez se utilizan. Los estudios relacionados han demostrado que cuando los ratones están infectados, la diferenciación de células Th2 es predominante en ratones BALB / c en comparación con ratones C57BL / 6J. Los estudios han sugerido que la aparición y el desarrollo de NEC se asocian con un aumento en las células T auxiliares tipo 2 (Th2) y generalmente se acompañan de infección. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB/c neonatales para inducir un modelo de NEC con características clínicas similares y cambios patológicos intestinales como los observados en niños con NEC. Se justifica un estudio adicional para determinar si este modelo animal podría usarse para estudiar las respuestas de las células Th2 en NEC.

Introducción

La enterocolitis necrosante (ECN), la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave, ocurre en la mayoría de los bebés prematuros (>90%), especialmente en aquellos con muy bajo peso al nacer (VLBW)¹. En los lactantes VLBW, la incidencia de la enfermedad oscila entre el 10% y el 12%, y la mortalidad de los niños diagnosticados con ECN se sitúa entre el 20% y el 30%^2,3. La causa de la NEC puede estar relacionada con lesiones mucosas, invasión por bacterias patógenas y alimentación intestinal, lo que puede conducir a respuestas inflamatorias y a la inducción de lesiones intestinales en huéspedes ^{susceptibles3}. La patogénesis de la NEC no está clara. Investigaciones relevantes muestran que la respuesta inmune del bebé afectado es anormal, y la susceptibilidad genética, la tensión microvascular y los cambios bacterianos intestinales pueden desempeñar un papel importante en la ^enfermedad3.

El modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación sobre la patogénesis de NEC. Las especies animales utilizadas para los modelos NEC son cerdos, ratas y ratones. Sin embargo, debido al largo período de gestación, los ciclos de crecimiento y los altos costos, en los últimos años, los cerdos no han sido la primera opción para los modelos NEC y han sido reemplazados por ratas o ^ratones4. Como existen diferencias en el fondo inmune de diferentes cepas de ^ratón5, diferentes estudios necesitan usar diferentes cepas de ratones para establecer modelos animales NEC. Los ratones BALB/c tienen una característica importante; cuando están infectados o hacen frente a daños externos, la polarización de las células TH2 durante la infección en ratones es significativamente más fuerte que la de otras cepas de ratones6,7,8. Las células T auxiliares desempeñan un papel crucial en la aparición y progresión de nec, especialmente en el desarrollo de células TH23,9,10,11. Por lo tanto, este estudio utilizó ratones BALB / c para establecer el modelo NEC, que podría ser útil para la investigación de la enfermedad NEC en células T.

Protocolo

Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Centro Médico de Mujeres y Niños de Guangzhou (NO. 174A01) y el Comité de Ética Animal del Centro de Animales de Laboratorio de Guangzhou Forevergen Biosciences (IACUC-G160100). Todos los animales fueron criados en la misma habitación en un ambiente específico libre de patógenos (SPF), y los experimentos se llevaron a cabo en un ambiente convencional. Los ratones utilizados para la cría tenían 7-8 semanas de edad; los ratones para inducir NEC (n = 72) se separaron de la presa el día 4, y las presas (n = 14) se mantuvieron en la jaula original y amamantaron a los ratones del grupo de control (Cont.) (n = 24).

1. Preparación de reactivos y dispositivos

1. Preparar el sustituto de la leche para los ratones BALB/c en la proporción correspondiente (leche en polvo prematura para bebés: leche de cabra en polvo = 2:1).
   NOTA: Las composiciones nutricionales finales de la leche de ^fórmula12 se muestran en la Tabla 1.
2. Solución de LPS (2,5 mg/ml)
   1. Disolver un total de 10 mg de polvo de LPS en 4 ml de agua esterilizada de doble destilación, mezclar bien y almacenar en un refrigerador a -20 °C después de la alícuota.
      NOTA: La solución de LPS se almacena en la oscuridad a 2-8 °C para uso inmediato o a -20 °C para almacenamiento a largo plazo.

2. Inducir enterocolitis necrosante en ratones BALB/c neonatales

1. Alimentar a los ratones neonatales.
   1. Mantenga a los ratones neonatales en la misma jaula con la presa, amamantados por la presa en los días 0-4.
   2. En la noche del día 4 (cuando los ratones neonatales pesan 2.5-3 g), separe a los ratones neonatales en el grupo NEC de la presa para inducir NEC, manténgalos en una incubadora de animales y aliméntelos con fórmula. Sin embargo, al grupo cont. se le permite quedarse y ser alimentado por la presa.
      NOTA: Los ratones neonatales que están separados de la presa deben ser criados en una incubadora debido a su débil regulación de la temperatura corporal.
2. Prepare el tubo de sonda remojándolo en recipientes de alcohol al 75% durante 1-2 minutos y lávelos dos veces en agua limpia y doble destilada.
   NOTA: Para evitar la contaminación cruzada entre los ratones, el proceso anterior debe realizarse después de alimentar a cada ratón.
3. Inducir el modelo NEC.
   1. Tome los ratones neonatales de la presa el día 4 y ayunarlos durante una noche.
   2. Gavage los ratones con LPS (20-30 μL a la vez) y aliméntelos con fórmula el día 5 (40-50 μL a la vez).
   3. A partir del día 5, someta a los ratones a un ciclo de hipoxia-reoxigenación-frío-choque dos veces al día durante 5 días. Coloque los ratones en un dispositivo de hipoxia al 5% de _O2 durante 90 s y reoxigenarlos durante 3 min; repita este proceso cinco veces. A continuación, coloque los ratones en un ambiente de 4 ° C durante 15 minutos y luego transfiéralos a una incubadora. Ver Figura 1A,B para el proceso de inducción.
      NOTA: Se realizó un ciclo de hipoxia-reoxigenación-estimulación en frío una vez por la mañana y otra por la tarde. Se preparó una mezcla de 5% de _O2 con 95% de _N2 en el recipiente, y la concentración se midió con un detector de oxígeno.
4. Observe de cerca a todos los ratones, peséelos todos los días, registre la supervivencia de los ratones durante el período de inducción y registre las características de las heces (con o sin heces pegajosas / heces con sangre).
   NOTA: El modelo NEC establecido tiene una duración de 5 días.
5. El día 10 o antes, cuando los ratones muestren síntomas de NEC (íleo, hematoquecia, diarrea)¹³, eutanasiar a los ratones mediante anestesia por inhalación con isoflurano, luego recolectar inmediatamente el tejido intestinal. No recolecte tejidos de los ratones que murieron espontáneamente.
   NOTA: En este estudio, el punto final de la eutenasia del ratón se adaptó cuando el ratón mostró hematoquecia y cianosis de todo el cuerpo.

3. Gavage el ratón

1. Fije la cabeza del ratón, sosteniendo la sonda gástrica en la mano derecha. Inserte la sonda gástrica desde la esquina izquierda de la boca del ratón.
   NOTA: La cabeza se fijó con el dedo índice en la cabeza del ratón y se presionó suavemente hacia atrás y hacia abajo para evitar que el ratón se doblara hacia adelante durante la operación y afectara la inserción del tubo gástrico.
2. Mueva lentamente el tubo hacia el centro de la boca. Después de insertar el tubo aproximadamente 2-3 cm, empuje 40-50 μL de fórmula o 20-30 μL de LPS en el tracto digestivo. Ver Figura 2A,B para la sonda gavage.
   NOTA: En circunstancias normales, la sonda gástrica se inserta en el tracto digestivo sin problemas. Si el ratón tiene un fuerte reflejo de vómito, el tubo gástrico se ha insertado en la tráquea por error. El tubo gástrico debe extraerse suavemente y dejar que el ratón descanse por un tiempo antes de intentar la sonda de nuevo. Además, el procedimiento de sonda gavage se utiliza para inducir el modelo de NEC antes de la eutanasia de ratones.

4. Recolecte muestras de tejido intestinal fresco para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Sumergir el tejido fresco del íleon del ratón en formalina al 10% durante 24 h.
2. Incrustar los tejidos en parafina y cortarlos en secciones de 4 μm.
3. Desparafinar las secciones en xileno y rehidratarlas sucesivamente en etanol absoluto, etanol al 95%, etanol al 80%, etanol al 70% y agua destilada, remojando durante 5 min en cada paso. Manche las secciones con solución de hematoxilina durante 5 min y diferéncialas en ácido clorhídrico al 1% en alcohol al 75% durante 5 s. Finalmente, manchelos con solución de eosina durante 1 min.
   NOTA: Después de la tinción con solución de hematoxilina, se debe diferenciar con ácido clorhídrico al 1% en etanol para eliminar la solución de hematoxilina excesivamente unida y el colorante de hematoxilina citoplasmática. La concentración de ácido clorhídrico al 1% es adecuada para el tejido intestinal.
4. Examine la histopatología del tejido intestinal a un aumento de 40x.

Resultados

El modelo NEC de ratón BALB/c fue inducido por la alimentación con fórmula, la alimentación lpS, la hipoxia y la estimulación en frío. Durante el período de inducción, los ratones fueron observados para la patología intestinal, las características de las heces, los cambios en el peso corporal y la supervivencia diaria. Imágenes representativas del intestino delgado durante la inducción de NEC; los números en la imagen representan la puntuación de patología intestinal de 0 (epitelio normal) a 4 (el más gra...

Discusión

La ECN es la emergencia del sistema gastrointestinal más frecuente para los neonatos, con una alta incidencia y mortalidad, especialmente en prematuros1,2,3. Sin embargo, su patogénesis aún no está clara. Actualmente se cree que el daño de la mucosa, la invasión de patógenos y la alimentación enteral son factores de alto riesgo para ^NEC3. Hasta la fecha, los animales utilizados para el modelo NEC ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	100092683
Goat Milk powder	Petag	71795558417
HE dye solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	G1003
Isoflurane	RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD.	R510
LPS	Sigma-Adrich	L2880
Medical oxygen	various	various
Microscope	NIKON	NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10004160
Paraffin	various	various
Premature baby milk powder	Abbott	57430
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD.	10023418
1% Hydrochloric acid	various	various
10% Formalin	LEAGENE	DF0110