التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة للإنتاج السريع لحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة مع البروتينات الهيكلية الخلوية المغلفة. تثبت هذه الطريقة أنها مفيدة لإعادة تشكيل الهياكل الخلوية الهيكلية من أسفل إلى أعلى في الحبس والتفاعلات بين الهيكل الخلوي والغشاء.

Abstract

كثيرا ما تستخدم الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كنماذج للأغشية البيولوجية ، وبالتالي فهي أداة رائعة لدراسة العمليات الخلوية المتعلقة بالأغشية في المختبر. في السنوات الأخيرة ، أثبت التغليف داخل GUVs أنه نهج مفيد لتجارب إعادة التشكيل في بيولوجيا الخلية والمجالات ذات الصلة. إنه يحاكي بشكل أفضل ظروف الحبس داخل الخلايا الحية ، بدلا من إعادة التكوين الكيميائي الحيوي التقليدي. غالبا ما لا يكون من السهل تنفيذ طرق التغليف داخل GUVs ، ويمكن أن تختلف معدلات النجاح اختلافا كبيرا من مختبر إلى آخر. إحدى التقنيات التي أثبتت نجاحها في تغليف أنظمة البروتين الأكثر تعقيدا تسمى تغليف واجهة القطيرات المستمرة (cDICE). هنا ، يتم تقديم طريقة قائمة على cDICE لتغليف البروتينات الهيكلية الخلوية بسرعة في GUVs مع كفاءة تغليف عالية. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم إنشاء قطرات أحادية الطبقة من الدهون عن طريق استحلاب محلول بروتيني ذي أهمية في خليط من الدهون / الزيت. بعد إضافتها إلى غرفة دوارة مطبوعة 3D ، تمر هذه القطرات أحادية الطبقات الدهنية عبر طبقة أحادية دهنية ثانية في واجهة مائية / زيتية داخل الغرفة لتشكيل GUVs التي تحتوي على نظام البروتين. تبسط هذه الطريقة الإجراء العام للتغليف داخل GUVs وتسرع العملية ، وبالتالي تسمح لنا بحصر ومراقبة التطور الديناميكي لتجميع الشبكة داخل الحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية. هذه المنصة مفيدة لدراسة ميكانيكا تفاعلات غشاء الهيكل الخلوي في الحبس.

Introduction

تستخدم مقصورات الدهون ثنائية الطبقة كخلايا اصطناعية نموذجية لدراسة التفاعلات العضوية المغلقة والعمليات القائمة على الأغشية أو كوحدات حاملة في تطبيقات توصيل الأدوية ^1,2. تتطلب البيولوجيا من أسفل إلى أعلى مع المكونات النقية الحد الأدنى من الأنظمة التجريبية لاستكشاف الخصائص والتفاعلات بين الجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون ^3,4. ومع ذلك ، مع تقدم هذا المجال ، هناك حاجة متزايدة لأنظمة تجريبية أكثر تعقيدا تقلد بشكل أفضل الظروف في الخلايا البيولوجية. التغليف في GUVs هو نهج عملي يمكن أن يوفر بعض هذه الخصائص الشبيهة بالخلايا من خلال توفير طبقة ثنائية من

Protocol

1. إعداد خليط الزيت والدهون

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة في غطاء الدخان باتباع جميع إرشادات السلامة للتعامل مع الكلوروفورم.

1. خذ 0.5 مل من الكلوروفورم في قارورة زجاجية سعة 15 مل. أضف 88 ميكرولتر من 25 ملغم / مل من ثنائي oleoyl-phosphocholine (DOPC) ، و 9.3 ميكرولتر من 50 ملغ / مل من الكوليسترول ، و 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من ديولويل - فوسفويثانولامين - ليسامين رودامين B (رودامين PE) (انظر جدول المواد) إلى القارورة الزجاجية سعة 15 مل.
   ملاحظة: أجزاء الخلد النهائية من DOPC والكوليسترول في زيت السيليكون / الزيت المعدني هي 69.9٪ و 30٪ على التوالي. ثبت أن 20-30 مول ٪ من الكوليسترول هو تركيز محسن لسيولة ال

النتائج

لإثبات النجاح في توليد GUVs الهيكلية الخلوية باستخدام البروتوكول الحالي ، أعيد تشكيل هياكل حزم fascin-actin في GUVs. Fascin هو رابط متقاطع قصير من خيوط الأكتين التي تشكل حزم أكتين متوازية صلبة ويتم تنقيتها من E. coli كبروتين اندماج Glutathione-S-Transferase (GST)²⁶. تم إعادة تشكيل 5 ميكرومتر من الأكتين ...

Discussion

تم استكشاف طرق مختلفة لتوليد GUVs لإنشاء خلايا اصطناعية ومع ذلك ، فإن تعقيد الإجراءات ، والوقت الممتد لتحقيق التغليف ، وتقييد أنواع الدهون والتركيب الجزيئي للغلاف ، والحاجة إلى مواد كيميائية غير فسيولوجية لتسهيل التغليف ، وانخفاض إنتاجية GUV ، وعدم الاتساق في كفاءة التغليف لا تزال تشكل تحدي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase	ThermoFisher Scientific	165305
Actin from rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton	AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle	Hypermol	8153-01
Axygen microtubes (200 µL)	Fisher Scientific	14-222-262	for handling ABPs
Black resin	Formlabs	RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder)	Avanti Polar Lipids	700100P
Choloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
Clear resin	Formlabs	RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	YOKOGAWA	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Sigma-Aldrich	D1556
DOPC lipid in chloroform	Avanti Polar Lipids	850375C
Fascin	homemade	N/A
F-buffer	homemade	N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
FS02 Sonicator	Fischer Scientific	FS20
G-buffer	homemade	N/A
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
Mineral oil	Acros Organics	8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olumpus	1-U2B933
Silicone oil	Sigma-Aldrich	317667