Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Özet

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Özet

Hücrenin enerjisinin çoğu, glikozun, yağ asitlerinin ve amino asitlerin, hücresel taleplere yanıt olarak düzenlenen mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sistemi üzerinde birleşen farklı yollarla parçalanmasıyla elde edilir. Lipid molekülü Koenzim Q (CoQ), elektronları sabit oksidasyon/indirgeme döngüleri yoluyla elektron taşıma zincirindeki (ETM) kompleks III'e aktararak bu süreçte esastır. Mitokondri durumu ve nihayetinde hücresel sağlık, respirometrik testler kullanılarak ETC oksijen tüketiminin ölçülmesiyle değerlendirilebilir. Bu çalışmalar tipik olarak birkaç gündür kültürlenmiş yerleşik veya birincil hücre hatlarında gerçekleştirilir. Her iki durumda da, elde edilen solunum parametreleri, herhangi bir organ veya dokudaki normal fizyolojik koşullardan sapmış olabilir.

Ek olarak, iskelet kasından izole edilen kültürlenmiş tek liflerin içsel özellikleri bu tür analizleri engellemektedir. Bu yazıda, fare iskelet kasından yeni izole edilmiş mitokondrilerde solunumun analizi için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, sürecin herhangi bir adımında ortaya çıkabilecek potansiyel sorunlara da çözümler sunuyoruz. Burada sunulan yöntem, çeşitli transgenik fare modellerinde oksijen tüketim oranlarını karşılaştırmak ve ilaç tedavilerine veya yaşlanma veya cinsiyet gibi diğer faktörlere mitokondriyal yanıtı incelemek için uygulanabilir. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik metabolizma ve düzenleme ile ilgili önemli sorulara cevap vermek için uygun bir yöntemdir.

Giriş

Mitokondri, hücredeki birincil metabolik ^{organellerdir1}. Bu özel membranla çevrili organeller, OXPHOS tarafından adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji üretmek için besin molekülleri kullanır. Bu süreç, ^ETC2'deki bir dizi redoks reaksiyonunda donör moleküllerden elektronların transferine dayanır. CoQ, tüm hücresel membranlarda endojen olarak üretilen ve antioksidan fonksiyon gösteren dolaşımdaki lipoproteinlerde bulunan tek redoks-aktif ^lipittir3. Elektronları NADH'ye bağımlı kompleks I ve _FADH2'ye bağımlı kompleks II'den kompleks III'e aktaran ETM'nin önemli bir bileşenidir, ancak diğer birçok redüktaz, mitokondriyal CoQ'nun çoklu hücresel metabolik yollarda zorunlu bir adım olarak ubikinol'e indirgenmesini ^{sağlayabilir4,5}.

İşlem boyunca, ATP sentaz kompleksi ^V2 tarafından biyolojik olarak aktif enerjiye dönüştürülen mitokondriyal iç zar boyunca bir elektrokimyasal proton gradyanı oluşturulur. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyon, esas olarak yüksek enerji gereksinimi olan beyin, kalp ve iskelet kası gibi dokuları etkileyen sayısız patolojik duruma yol ^açar6,7. Bu nedenle, mitokondriyal biyoenerjetik maddeleri, özellikle iskelet kasları gibi yüksek enerjili dokularda, sağlık ve hastalıktaki rolünü araştırmak için doğru bir şekilde analiz etmek için yöntemler geliştirmek esastır.

Clark tipi oksijen elektrodu, mitokondriyal solunum çalışmasında klasik olarak ^{kullanılmıştır8}. Bununla birlikte, bu sistem giderek daha yüksek çözünürlüklü teknolojilerle yer değiştirmiştir ve Agilent Seahorse XF analizörleri gibi mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojileri özellikle ^popülerdir9. İskelet kası alanında, bu çalışmalar tipik olarak kültürlenmiş hücrelerde, özellikle C2C12 ölümsüzleştirilmiş fare miyoblast hücre hattında veya uydu hücrelerinden türetilen birincil kültürlerde ^{gerçekleştirilir10,11}. Bununla birlikte, bu çalışmalar, özellikle mitokondriyal biyolojiyi araştırırken ve belirli hakaretler, genetik olmayan müdahaleler veya genetik manipülasyonlar üzerine doku düzeyinde işlev görürken, durumu in vivo olarak tam olarak özetlememektedir.

Ayrıca, hücrelerdeki solunum tahlilleri, ATP'nin mitokondriyal olmayan talebi ve sonuçların yorumlanmasını yanlış yönlendirebilecek tahlil substratları veya sinyal olayları da dahil olmak üzere ek faktörler nedeniyle daha karmaşıktır. Alternatif olarak, kaslardan yeni izole edilmiş miyoliflerin tek veya demetlerini kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, izolasyon yöntemi teknik olarak zordur ve sadece birkaç kas tipi için uygulanabilir. Bu durumda, fleksör digitorum brevis (FDB) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kasları esas olarak kullanılır10,12,13, ancak birkaç rapor diğer kas tiplerinin kullanımını da ^{açıklamaktadır14,15}.

İskelet kası kesitlerinin biyoenerjetik profillemesi de ^{bildirilmiştir16}. Bu yöntemin en büyük avantajı, sağlam kasların çalışılabilmesidir (yazarlar, liflerden dilimlemenin, izole miyoliflerle karşılaştırıldığında sonuçları rahatsız etmediğini göstermektedir). Bununla birlikte, substratlara ve tahlil inhibitörlerine mitokondriyal erişim sınırlıdır ve bu nedenle sadece birkaç parametre ^{ölçülebilir16}. Son olarak, izole mitokondri de aynı şekilde kullanılabilir9,17,18,19. Bu durumda, mitokondri sitozolik ortamlarını kaybeder ve bu da işlevlerini etkileyebilir. Buna karşılık, bu yöntem substratlara ve inhibitörlere erişimi garanti eder, çok sayıda numune tipinin analizini sağlar ve tipik olarak daha az malzeme gerektirir.

Bu yazıda, mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondrinin biyoenerjetik profillemesini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Özellikle, üç protokol detaylandırılmıştır: ETC ve OXPHOS makineleri arasındaki bağlantı derecesini değerlendirmek için Kaplin Testi, CA; Elektron Akış Testi, bireysel ETC komplekslerinin aktivitesini ölçmek için EFA; ve mitokondriyal β-oksidasyon kapasitesini belirlemek için BOX testi. Özellikle, geleneksel respirometri yöntemlerine kıyasla sadece az miktarda numune gereklidir. Burada kullanılan yalıtım protokolü, başka bir yerde yayınlanan yöntemden ^{değiştirilmiştir18}.

Protokol

Fare muhafazası ve doku toplama, Universidad Pablo de Olavide Etik Komitesi (Sevilla, İspanya; protokoller 24/04/2018/056 ve 12/03/2021/033) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak İspanya Kraliyet Kararnamesi 53/2013, Avrupa Direktifi 2010/63/EU ve diğer ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Solunum tahlilleri için stokların, tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. Belirtilen sıcaklıkta aylarca saklanabilen aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın. Her durumda ultra saf _H2O kullanın.
   1. 1x PBS hazırlamak için fosfat tamponlu salin (PBS) tabletlerini H2O'da (200 mL _H2O başına 1 tablet) çözün. Çözeltiyi otoklav edin ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
   2. 1 M NaOH hazırlamak için 2 g NaOH peletini 50 mL _H2O'da çözün.
   3. pH kalibrasyonu için 0,1 M, 1 M, 5 M ve 10 M KOH stokları hazırlayın.
   4. 70 mL H2O'ya 14.612 g EDTA ekleyin. 100 mL'ye _H2O kuantum satis (QS) ekleyin. Elde edilen 0,5 M EDTA (pH 8) çözeltisini otoklav edin ve RT'de saklayın.
   5. 70 mL _H2O'ya 19 g EGTA ekleyin. EGTA'nın tamamen çözünmesini sağlamak için pH 8.0'a ulaşana kadar NaOH peletleri ekleyin. 100 mL'ye _H2O QS ekleyin. Elde edilen 0,5 M EGTA (pH 8) çözeltisini otoklav edin ve RT'de saklayın.
   6. 98 mL PBS'ye 2 mL 0,5 M EDTA ekleyin. Elde edilen 10 mM EDTA/PBS çözümünü RT'de saklayın.
   7. 5.958 g HEPES'i 40 mL H2O'da çözün. pH'ı KOH ile _7.2'ye ve QS'yi _H2O ile 50 mL'ye ayarlayın. Elde edilen 0.5 M HEPES tamponunu 0.45 μm'lik bir ağdan filtreleyin ve RT'de saklayın.
   8. 3.402 g KH2PO4'ü 50 mL'ye kadar H2O'da çözün. Elde edilen 0,5 M _KH2PO4 çözeltisini 0,45 μm'lik bir ağdan filtreleyin ve RT'de saklayın.
   9. 9.521 g susuz _MgCl2'yi 100 mL'ye kadar _H2O'da çözün.
      NOT: Bu ekzotermik bir reaksiyon olduğundan, dikkatli bir şekilde ilerleyin ve _MgCl2'yi buz üzerinde çözün.
2. Substrat ve inhibitör stok çözeltileri hazırlayın (bakınız Tablo 1). Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. Donma-çözülme döngülerinden kaçının. Bir istisna olarak, her zaman kullanımdan hemen önce piruvik asit hazırlayın.
   1. Ultra saf _H2O'da hazırlayın: 0,5 M süksinat, 0,5 M piruvik asit, 0,5 M malik asit, 100 mM ADP, 1 M askorbik asit ve 50 mM N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenilen-diamin (TMPD) (ışıktan koruyun).
   2. %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın: 50 mM palmitoil-L-karnitin, 4 mM rotenon, 20 mM karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP), 4 mM oligomisin ve 5 mM Antimisin A.
      NOT: Mikroplaka kuyucuklarındaki nihai DMSO konsantrasyonunu %0,1 aşmayın. Bu nedenle, bu sınırın altında kalmak için yüksek konsantrasyonlu stok çözümleri hazırlayın.
3. Mitokondri izolasyonu ve protein niceliği için tamponları deney gününde taze olarak hazırlayın. Her durumda ultra saf _H2O kullanın ve aksi belirtilmedikçe tüm tamponları buz üzerinde tutun.
   NOT: Zamandan tasarruf etmek için, tüm reaktifler tartılabilir ve önceki gün doğru sıcaklıkta uygun kaplarda (örneğin, 15 mL tüpler) tutulabilir.
   1. % 10 serbest yağ asitleri (FFA) BSA hazırlamak için, 150 mg FFA BSA'yı 1.5 mL _H2O içinde ters çevirme / dönme tekerleği ile iyice çözün. Köpüklenmeyi önlemek için vorteks yapmayın.
   2. 1x Bradford reaktifi hazırlamak için 5x ticari stok çözümünü _H2O ile seyreltin ve RT'de karanlıkta tutun.
   3. 8x Mitokondri Tamponu (MB) hazırlamak için, 15 mL H2O'da 4.112 g sakkaroz ve 763 mg HEPES'i çözün. pH'yi 7.2'ye ayarlayın, 1.6 mL% 10 FFA BSA ve QS'yi _H2O ile 20 _mL'ye ekleyin.
   4. 20 mL İzolasyon Arabelleği 1 (IB1) (numune başına 4 mL kullanılır) hazırlamak için, 15 mL H2O'da 400 μL 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol ve _2,5 mL 8x MB çözün.
   5. 5 mL İzolasyon Tamponu 2 (IB2) (numune başına 500 μL kullanılır) hazırlamak için, 4 mL H2O'da 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol ve ₆₂₅ μL 8x MB çözün.
   6. 5 mL Resuspension Buffer (RB) (numune başına 200 μL kullanılır) hazırlamak için, 120 mg sakaroz, 191.3 mg D-mannitol, 50 μL 0.5 M HEPES ve 10 μL 0.5 M EGTA'yı 4 mL _H2O'da çözün.
   7. 2x Mitokondriyal Tahlil Çözeltisi-1 (MAS-1) hazırlamak için, 1.199 g sakaroz, 2.8 g mannitol, 1 mL 0.5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0.5 M HEPES, ve 100 μL 0.5 M EGTA 20 mL _H2O'da çözün. pH'yi 7.2 ve QS'yi _H2O ile ₂₅ mL'ye ayarlayın. Daha uzun süreler boyunca, yağışı önlemek için 4 ° C'de tutun.
   8. 1x Kaplin Testi ortamını (CAM) hazırlamak için iki farklı MAS-1 tabanlı tampon hazırlayın: 1) CA testi için CAM + BSA ve 2) Tahlil inhibitörlerini hazırlamak için CAM-BSA. Piruvat: malat oranını daima 10: 1'de tutun.
      NOT: BSA enjeksiyon portlarını tıkayabildiğinden, inhibitörleri BSA içermeyen CAM'de seyreltin.
      1. CAM + BSA'yı hazırlamak için, 300 μL 0,5 M piruvik asit, 30 μL 0,5 M malik asit ve 7,5 mL 2x MAS-1'i 6 mL _H2O'da seyreltin. _H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
      2. CAM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 120 μL 0,5 M piruvik asit, 12 μL 0,5 M malik asit ve 3 mL _2x MAS-1 seyreltin.
   9. 1x Elektron Akış Testi ortamı (EFAM) hazırlamak için, hem BSA içeren hem de BSA içermeyen EFAM tamponları hazırlayın.
      1. EFAM + BSA'yı hazırlamak için, 300 μL 0,5 M piruvik asit, 60 μL 0,5 M malik asit, 3 μL 20 mM FCCP ve 7,5 mL _2x MAS-1'i 6 mL H2O'da seyreltin. _H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
      2. EFAM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 120 μL 0,5 M piruvik asit, 24 μL 0,5 M malik asit, 1,2 μL 20 mM FCCP ve 3 mL _2x MAS-1 seyreltin.
   10. 1x β oksidasyon ortamı (BOXM) hazırlamak için BSA içeren ve BSA içermeyen BOXM çözeltileri hazırlayın.
       1. BOXM + BSA'yı hazırlamak için, 7 mL H2O'da 12 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 30 μL 0.5 M malik asit ve 7.5 mL _2x MAS-1 seyreltin. _H2O ile 15 mL'ye 300 μL %10 FFA BSA ve QS ekleyin.
       2. BOXM-BSA'yı hazırlamak için, 2 mL H2O'da 4.8 μL 50 mM palmitoil-L-karnitin, 12 μL 0.5 M malik asit ve 3 mL _2x MAS-1 seyreltin.

2. Kas diseksiyonu, homojenizasyon ve mitokondriyal izolasyon

1. Tüm malzemeleri ve tamponları buzun üzerine yerleştirin. Mitokondrileri hasardan korumak için tüm prosedür boyunca tüm malzemelerin buz gibi soğuk olduğundan emin olun.
2. Buz üzerine numune başına üç adet 50 mL beher yerleştirin ve aşağıdaki çözeltileri ekleyin: Beher 1'de 10 mL PBS, beher 2'de 10 mL 10 mM EDTA/PBS ve beher 3'te 4 mL IB1.
3. Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. _CO2 ötenazisinden kaçının, çünkü iskelet kasları hipoksik hale gelebilir ve solunum analizlerine müdahale edebilir.
4. Kürkün dökülmesini önlemek için sağ arka bacağı% 70 etanol ile püskürtün ve bant uzuvunu mantar diseksiyon panosuna püskürtün. Sol ön ayağı da bantlayın.
5. Steril tek kullanımlık neşter ile dizden ayak parmağına kadar deriden bir kesi yapın.
6. Cildi ayak bileği seviyesinde dişli forseps ile tutun ve ayak bileği çevresinde ince makasla kesin.
7. Bir elinizde ince uçlu cımbızla cildi altta yatan kas yapısından uzaklaştırırken, diğer elinizde dişli forseps ile yukarı çekin.
8. Ayak bileğinden dize kadar tüm iskelet kaslarını diseke edin (Şekil 2).
   1. İnce cımbız ve makas kullanarak kas ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için tibialis anterior (TA) kası üzerindeki tüm bağ dokusunu çıkarın.
   2. EDL kasının dört distal tendonunu bulun ve ayak parmaklarındaki yerleştirmelerine yakın bir şekilde bölümlere ayırın. TA distal tendonunu bulun ve her zaman ayak bileğinin altında, yerleştirilmesine yakın bir yerde kesin.
   3. Gevşek uçları serbest bırakmak için TA ve EDL tendonlarını ayak bileğinin üzerine dikkatlice çekin.
   4. Tendonların gevşek uçlarını tutun ve kasları yukarı çekerek kas sisteminin ve kemiklerin geri kalanından uzaklaştırın. İşlemi kolaylaştırmak için ince cımbız veya makas kullanın. Miyofiber kasılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde devam edin.
   5. EDL'nin proksimal tendonunu ve TA kasını diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin.
   6. Gastroknemius (GA) ve soleus kas ekstraksiyonuna devam etmek için fareyi baş aşağı çevirin.
   7. Biceps femoris ve GA arasında oluşan cebi dişli forseps ile tutun. Bu kasları ayırmak ve proksimal GA tendonunu görselleştirmek için ince makas kullanın.
   8. Aşil tendonunu ince forsepslerle tutun ve ince makasla dikkatlice kesin. GA ve soleus kaslarını altta yatan kemikten tendonlarından yukarı çekerek serbest bırakın. Proksimal GA tendonunu altta yatan soleus ile birlikte serbest bırakarak kesin.
   9. Sadece kemikler kalana kadar aynı prosedürü izleyerek kalan kasları tendondan tendona dikkatlice inceleyin.
   10. Kuadriseps kasını incelemek için fareyi başlangıç pozisyonunda yeniden sabitleyin.
   11. Dişli forseps ve ince makas kullanarak yağ dokusunu proksimal taraftaki kuadrisepslerin üzerine atın.
   12. Kuadriseps ve femur arasına ince cımbız yerleştirin ve kası kemikten ayırmak için femur ekseni boyunca her iki yönde de hareket ettirin.
   13. Distal kuadriseps kas tendonlarını dişli forseps ile tutun ve tendonu diz kapağına mümkün olduğunca yakın ince makasla kesin.
   14. Kuadrisepsleri yukarı çekin ve ince makasla proksimal yerleştirmede serbest bırakın.
9. Bu bölümdeki 4-8 arası adımları sol arka bacakla tekrarlayın.
10. Tüm kasları önce Beaker 1'de, sonra Beaker 2'de durulayın.
11. Tüm kasları Beher 3'e aktarın ve tüm kasları buz üzerinde keskin makasla ince bir şekilde kesin.
12. Süspansiyonu daima buzda tutarak bir C Tüpüne (mor kapak) aktarın.
13. C Tüpünü sıkıca kapatın ve homojenizatörün manşonuna baş aşağı takın. Numune malzemesinin rotator/stator alanında olduğundan emin olun. m_mito_tissue_01 adlı 1 dakikalık programı seçin.
14. Homojenatı iki adet 2 mL önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne bölün ve bir masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 × g'da santrifüj yapın.
15. Süpernatantları yeni 2 mL önceden soğutulmuş tüplere aktarın, yağ ve homojenize edilmemiş dokudan dikkatlice kaçının. Parçalanma saflığının belirlenmesi için peletleri -80 °C'de saklayın (fraksiyon N) (Şekil 3).
16. Süpernatantları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.500 × g'de santrifüj yapın.
17. Süpernatantları yeni 2 mL önceden soğutulmuş tüplere aktarın ve bunları Süpernatant Numarası 1 (SN1) olarak etiketleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
18. Her iki peleti de buzda toplam 500 μL IB2 hacminde yeniden askıya alın ve birleştirin.
19. 4°C'de 10 dakika boyunca 10.500 × g'de santrifüj.
20. Süpernatantı yeni bir 2 mL önceden soğutulmuş tüpe aktarın ve Süpernatant Numarası 2 (SN2) olarak etiketleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
21. Son mitokondriyal peleti 200 μL RB'de yeniden askıya alın. Protein niceliği için hızlı bir şekilde 10 μL ayırın ve hasarı önlemek için kalan mitokondriyal süspansiyona derhal 10 μL% 10 FFA BSA ekleyin.
22. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
    1. Standart eğri için, RB tamponunda bir proteinin bilinen konsantrasyonunun 30 μL seri seyreltisini hazırlayın. Örneğin, 1 mg / mL, 0.5 mg / mL, 0.25 mg / mL, 0.125 mg / mL, 0.0625 mg / mL ve 0 mg / mL BSA kullanın.
    2. RB tamponunda mitokondriyal örneklerin 1: 3 ve 1: 6 seri seyreltmelerini hazırlayın.
    3. 96 delikli düz tabanlı bir plakada, önce kuyu başına 2,5 μL numune/standart yükleyin. Daha sonra, her numuneye 10 μL 1 M NaOH ve son olarak 200 μL 1x Bradford reaktifi ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak iyice karıştırın. Numunelerin renginin kalibrasyon çizgisi içinde olup olmadığını görsel olarak kontrol edin. Analizi her zaman üçlü olarak gerçekleştirin.
    4. Plakaları karanlıkta RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve bir mikroplaka spektrofotometresinde 595 nm'deki absorbansı okuyun.
    5. Bu bölümdeki (x ekseni) adım 22.1'de hazırlanan seyreltmelerin karşılık gelen protein konsantrasyonuna karşı absorbans değerlerini (y ekseni) çizerek standart eğriyi hesaplayın.
    6. Standart eğri ile ekstrapolasyon yaparak mitokondriyal örneklerdeki toplam protein miktarını hesaplayın.

3. Mikroplaka bazlı respirometrik testlerin hazırlanması

1. Deneyden en az 12 saat önce respirometrik tahlil sensörünü, kuyu başına 1 mL kalibrasyon tamponu ile nemlendirin. 37 °C'de inkübe edin (_CO2 yok).
   NOT: Hidratlı sensörler 72 saate kadar kullanılabilir. Bu adımda kartuş dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır: sensörlere herhangi bir şey dokunursa, ölçüm hassasiyeti etkilenebilir.
2. Hazırlık santrifüjünü, sallanan kova mikroplaka rotoru ve ilgili mikroplaka adaptörleri ile 4 °C'de önceden soğutun.
3. Bilgisayarı açın, analiz yazılımını açın ve istediğiniz protokolü seçin.
   NOT: Yazılım oksijen tüketimi ölçüm cihazına bağlandığında bir tıklama duyulur. Isıtma sensörü, deney başlamadan önce yeşil ve 37 ° C'de olmalıdır.
4. İnhibitör çözeltilerini, yapılacak tahlil uyarınca bölüm 1, adım 2'de belirtilen stoklardan hazırlayın. Her çözüm için yeterli hacim hazırlayın. Başvuru için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakınız.
5. Her bağlantı noktasına her bir inhibitörün uygun hacmini ekleyin, kartuşu oksijen tüketimi ölçüm cihazına takın ve kalibrasyona başlayın.
   NOT: Kartuşa inhibitör eklenmesi ve kartuşun cihaza takılması 15-20 dakika sürer. Doğru kartuş bileşenlerinin takıldığından emin olun. Kartuş kapağı ve hidro hidrofor, sensör kartuşu ve yardımcı alana ihtiyaç duyulurken atılabilir.
6. Bölüm 2'nin konsantre mitokondriyal süspansiyonunu, adım 21'i 10.500 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
7. Mitokondriyal peleti, gerçekleştirilecek protokole bağlı olarak 100 μL 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA veya 1x BOXM + BSA'da yeniden askıya alın.
8. Konsantre mitokondriyal numuneyi, karşılık gelen tahlil ortamında son 0.2 μg / μL konsantrasyonuna kadar seyreltin.
9. Buz üzerinde önceden soğutulmuş 24 delikli bir mikroplakada kuyu başına süspansiyonun 50 μL'sini (toplam 10 μg protein) tohumlayın. Arka plan düzeltme kuyularına mitokondri eklemeyin; sadece ilgili tahlil ortamını ekleyin. Parçalanma saflığının belirlenmesi için kalan mitokondriyal süspansiyonu -80 °C'de saklayın (Şekil 3).
10. Mikro plakayı önceden soğutulmuş preparatif santrifüjde 2.000 × g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca döndürün. Buna göre dengelemek için karşı ağırlık.
11. Mikroplaka santrifüjleme sırasında kalan tahlil ortamını 37 ° C'de ısıtın.
12. Santrifüjlemeden sonra, dengelemek için mikro plakayı tezgahta 5 dakika bekletin. RT'de kuyucuk başına 500 μL'lik son hacim için 450 μL sıcak tahlil ortamı ekleyin. Bunu yavaş ve dikkatli bir şekilde yapın, mitokondrilerin ayrılmasını önlemek için ortamı kuyucukların duvarına ekleyin.
13. Mikroplakayı hemen oksijen tüketimi ölçüm cihazına kapaksız olarak yerleştirin ve protokolü başlatın (Tablo 3). Mikro plakanın ısınmasına izin vermek için ilk adımın 10 dakikalık bir inkübasyon olduğundan emin olun.
14. Deney bittiğinde, kartuşu ve mikro plakayı çıkarın, cihazı kapatın ve analizi başlatın.

4. Sonuçların analizi

1. CA ve BOX tahlilleri söz konusu olduğunda, aşağıdaki analizleri gerçekleştirin:
   1. Antimisin A ve rotenon enjeksiyonundan sonra elde edilen değerlerin ortalamasına karşılık gelen mitokondriyal olmayan _O2 tüketimini kaydedin.
      NOT: Antimisin A ve rotenon sırasıyla kompleks III ve I inhibitörleridir.
   2. Bazal değerlerden mitokondriyal olmayan _O2 tüketimini çıkararak bazal solunumu hesaplayın (ölçüm noktaları 1 ve 2).
   3. Mitokondriyal olmayan _O2 tüketimini, mitokondriyal durum III'ü belirlemek için karmaşık V substratı ADP'nin (enjeksiyon A) enjeksiyonundan sonraki değerlerden çıkarın.
   4. Mitokondriyal durum IVo'yu elde etmek için kompleks V inhibitörü oligomisinin (enjeksiyon B) enjeksiyonundan sonra mitokondriyal olmayan _O2 tüketimini solunum değerlerinden çıkarın.
   5. FCCP enjeksiyonu sonrası solunumdan mitokondriyal olmayan _O2 tüketimini düşerek mitokondriyal durum IIIu'yu hesaplayın (enjeksiyon C).
      NOT: FCCP güçlü bir mitokondriyal oksidatif fosforilasyon çözücüsüdür. ATP sentezi varlığında atlanır ve ETC maksimum aktiviteye ulaşır.
   6. Artan enerji talebi durumunda ekstra ATP üretme kapasitesi olan mitokondriyal yedek kapasiteyi elde etmek için mitokondriyal durum IIIu değerlerinden bazal solunum değerlerini çıkarın.
   7. Solunum Kontrol Oranını (RCR) elde etmek için mitokondriyal durum IIIu'yu durum IVo değerlerine bölün.
      NOT: Negatif veya boş RCR değerleri, mitokondriyal kuplajın etkilendiğini gösterir.
2. EFA'ya başvurmak için aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin:
   1. Rotenon ve Antimisin A enjeksiyonu sonrası ortalama değeri hesaplayarak artık aktivite elde edin (A ve C enjeksiyonları).
   2. Bazal değerlerden (ölçüm noktaları 1 ve 2) artık aktiviteyi çıkararak karmaşık I ila IV (CI-CIV) aktivitesini hesaplayın.
   3. CII-CIII-CIV aktivitesini elde etmek için CII substrat süksinatının (enjeksiyon B) enjeksiyonundan sonraki değerlerden artık aktiviteyi çıkarın.
   4. Sitokrom c-indirgeyici ajanlar, askorbik asit ve TMPD (enjeksiyon D) enjekte edildikten sonra elde edilen değerlerden artık aktiviteyi düşerek CIV aktivitesini hesaplayın.
3. Uygun sonuçları çıkarmak için Şekil 4'te olduğu gibi çubuk grafikler kullanarak tüm sonuçları temsil edin.

Sonuçlar

Burada sunulan protokol, mitokondrinin fare iskelet kasından izole edilmesi yoluyla mitokondriyal solunumun in vivo analizine izin verir. Yöntemin bir anahattı Şekil 1'de gösterilmiştir. İskelet kasları arka bacaklardan diseke ettikten sonra (Şekil 2), dokular homojenize edilir ve izotonik koşullar altında, seri santrifüjlemeler yoluyla mitokondri saflaştırılır. İzolasyon işlemi sırasında elde edilen farklı fraksiyonların saflığ?...

Tartışmalar

Mitokondriyal solunumu incelemek için kullanılan tüm yöntemlerin sınırlamaları vardır; Bu nedenle, belirli bir deneysel soruya en uygun yöntemi seçmek çok önemlidir. Bu çalışma, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için farklı solunum tahlilleri yapmak üzere mitokondrileri fare iskelet kasından izole etmek için güncellenmiş ve ayrıntılı bir protokol sağlar. Gerçekten de, mikroplaka bazlı teknolojiler kullanılarak izole mitokondride mitokondriyal biyoenerjetik çalışmaların incelenmesi, do...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)