Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris

Résumé

La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris implique généralement un accès par les os du crâne et est guidée par des repères du crâne. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative pour cibler le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la cisterna magna qui repose sur la visualisation directe des repères du tronc cérébral.

Résumé

La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris est généralement guidée par des repères crâniens. L’accès est ensuite obtenu par des trous de bavure percés à travers le crâne. Cette approche standard peut être difficile pour les cibles du tronc cérébral caudal et de la moelle cervicale supérieure en raison de défis anatomiques spécifiques, car ces sites sont éloignés des points de repère du crâne, ce qui entraîne une imprécision. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative via la cisterna magna qui a été utilisée pour cibler des régions discrètes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. La cisterna magna s’étend de l’os occipital à l’atlas (c’est-à-dire le deuxième os vertébral), est remplie de liquide céphalo-rachidien et est recouverte de dure-mère. Cette approche fournit une voie d’accès reproductible à certaines structures du système nerveux central (SNC) qui sont autrement difficiles à atteindre en raison de barrières anatomiques. En outre, il permet une visualisation directe des repères du tronc cérébral à proximité des sites cibles, augmentant ainsi la précision lors de l’administration de petits volumes d’injection dans des régions restreintes d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure. Enfin, cette approche offre l’occasion d’éviter le cervelet, ce qui peut être important pour les études motrices et sensorimotrices.

Introduction

La chirurgie stéréotaxique standard pour cibler les sites cérébraux chez la souris¹ implique généralement la fixation du crâne à l’aide d’un ensemble de barres auriculaires et d’une barre buccale. Les coordonnées sont ensuite estimées sur la base des atlas de référence ^2,3 et des repères crâniens, à savoir bregma (le point où les sutures des os frontaux et pariétaux se rejoignent) ou lambda (le point où les sutures des os pariétaux et occipitaux se rejoignent; Figure 1A,B). Grâce à un trou de bavure dans le crâne au-dessus de la cible estimée, la région cible peut alors être atteinte, soit pour la livraison de microinjections, soit pour l’instrumentation avec des canules ou des fibres optiques. En raison de la variation de l’anatomie de ces sutures et des erreurs dans la localisation de bregma ou lambda ^4,5, la position des points zéro par rapport au cerveau varie d’un animal à l’autre. Bien que les petites erreurs de ciblage, qui résultent de cette variabilité, ne soient pas un problème pour les cibles grandes ou proches, leur impact est plus important pour les petites zones d’intérêt éloignées des points zéro dans les plans antéropostérieur ou dorsoventral et / ou lors de l’étude d’animaux de taille variable en raison de l’âge, de la tension et / ou du sexe. Il existe plusieurs défis supplémentaires qui sont uniques pour la moelle oblongée et la moelle cervicale supérieure. Tout d’abord, de petits changements dans les coordonnées antéropostériennes sont associés à des changements significatifs des coordonnées dorsoventrales par rapport à la dure-mère, en raison de la position et de la forme du cervelet (Figure 1Bi)^2,6,7. Deuxièmement, la moelle cervicale supérieure n’est pas contenue dans le crâne². Troisièmement, la position inclinée de l’os occipital et la couche sus-jacente des muscles du cou² rendent l’approche stéréotaxique standard encore plus difficile pour les structures situées près de la transition entre le tronc cérébral et la moelle épinière (Figure 1Bi). Enfin, de nombreuses cibles d’intérêt dans le tronc cérébral caudal et la corde cervicale sont petites², nécessitant des injections précises et reproductibles ^8,9.

Une approche alternative à travers la cisterna magna contourne ces problèmes. La cisterna magna est un grand espace qui s’étend de l’os occipital à l’atlas (Figure 1A, c’est-à-dire le deuxième os vertébral)¹⁰. Il est rempli de liquide céphalo-rachidien et recouvert de^{dure-mère 10}. Cet espace entre l’os occipital et l’atlas s’ouvre lors de l’antéroflexion de la tête. On peut y accéder en naviguant entre les ventres appariés sus-jacents du muscle longus capitis, exposant la surface dorsale du tronc cérébral caudal. Les régions d’intérêt peuvent ensuite être ciblées en fonction des points de repère de ces régions elles-mêmes si elles sont situées près de la surface dorsale; ou en utilisant l’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le ventricule IV, comme point zéro pour que les coordonnées atteignent des structures plus profondes. Cette approche a été utilisée avec succès chez une variété d’espèces, y compris le rat¹¹, le chat¹², la souris ^8,9 et le primate non humain¹³ pour cibler le groupe respiratoire ventral, la formation réticulaire médiale médullaire, le noyau du tractus solitaire, la zone postrema ou le noyau hypoglosse. Cependant, cette approche n’est pas largement utilisée car elle nécessite des connaissances en anatomie, une boîte à outils spécialisée et des compétences chirurgicales plus avancées par rapport à l’approche stéréotaxique standard.

Nous décrivons ici une approche chirurgicale étape par étape pour atteindre le tronc cérébral et la moelle cervicale supérieure via la cisterna magna, visualiser les points de repère, définir le point zéro (Figure 2) et estimer et optimiser les coordonnées cibles pour l’administration stéréotaxique de microinjections dans les régions discrètes du tronc cérébral et de la moelle épinière d’intérêt (Figure 3). Nous discutons ensuite des avantages et des inconvénients liés à cette approche.

Protocole

L’auteur déclare que le protocole suit les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Préparation des instruments chirurgicaux et du cadre stéréotaxique

REMARQUE: La chirurgie est effectuée dans des conditions aseptiques. La stérilité est maintenue à l’aide de la technique de la pointe stérile.

1. Installez le bras stéréotaxique avec une micropipette ou une seringue remplie d’un injectable de votre choix (virus adéno-associé (AAV) ou traceur conventionnel) sur le cadre stéréotaxique et préparez l’adaptateur de souris (Figure 2A).
2. Préparez des instruments chirurgicaux autoclavés (table des matériaux) et placez-les sur une surface stérile.

2. Induction de l’anesthésie et préparation de la souris

1. Allumez O₂ à 0,5 L / min et réglez le vaporisateur isoflurane à 4,0, en vous assurant que le flux d’O₂ est dans la boîte à induction.
   ATTENTION : Assurez-vous que la boîte d’induction de l’isoflurane est placée dans une hotte et que l’isoflurane est récupéré loin du site chirurgical.
2. Placez la souris (mâle C57BL/6J âgé de 10 semaines) dans la chambre d’induction.
3. Une fois que la respiration a ralenti, ouvrez la chambre d’induction et soulevez légèrement la souris. Utilisez des tondeuses pour enlever les poils de la tête aux épaules.

3. Positionnement de la souris dans le cadre stéréotaxique

1. Déplacez la souris sur le cadre stéréotaxique et placez le nez dans un cône de nez flexible. À ce stade, assurez-vous que le flux d’O₂ est maintenant dirigé vers le cône du nez.
2. Placez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille uniquement.
   REMARQUE: Assurez-vous que les barres d’oreille sont égales et que la tête est de niveau.
3. Antéroflex la tête de la souris à un angle de 90° en guidant manuellement le nez. Pour sécuriser cette position, placez une barrière en plastique entre les piliers de la barre d’oreille de l’adaptateur de souris, parallèlement aux piliers. La partie plate du crâne sert de référence, similaire à l’approche du crâne plat en chirurgie stéréotaxique conventionnelle.
   REMARQUE: Ne fléchissez pas trop la tête (c’est-à-dire au-delà d’un angle de 90 ° entre le plan de l’os frontal du crâne et le plan de la surface de la table) car cela entrave la circulation de l’air dans les voies respiratoires supérieures. Si la circulation de l’air est entravée, repositionnez la souris en vous assurant que le corps est soutenu sous le tronc et qu’une carte en plastique est placée à 90 ° entre le plan de l’os frontal du crâne et le plan de la surface de la table comme indiqué à la figure 2A, C.
4. Placez le coussin chauffant sous la souris, puis assurez-vous que le cou et le reste du corps sont positionnés au même niveau (c.-à-d. à environ 180 ° ou parallèlement à la table). La boîte à outils qui contient les ciseaux à ressort peut être utilisée pour soulever le corps à cette position.
   REMARQUE: Cette étape est importante car le tronc cérébral caudal et la moelle cervicale supérieure se déplacent en fonction de la position, contrairement aux parties plus rostrales du SNC qui sont maintenues en place par le crâne.
5. Injecter une dose unique de 4 mg/kg de méloxicam à libération lente (SR) par voie sous-cutanée (c.v.s.) à un volume de 2 μL/g de poids corporel et placer le lubrifiant sur les yeux.
6. Nettoyez d’abord le site d’incision chirurgicale avec un tampon de préparation à 70% d’alcool, puis avec un tampon de préparation à la bétadine, puis à nouveau avec un tampon de préparation à l’alcool et laissez sécher.
7. Placez un drapé sous le corps.
8. Désinfectez-vous les mains et mettez des gants stériles.
9. Placez un drapé sur le site chirurgical.

4. Chirurgie pour accéder à la cisterna magna

1. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pinçant les orteils ou en vérifiant le réflexe cornéen.
2. Réduire l’isoflurane à des niveaux d’entretien (2.0).
3. Faites une incision de 1 à 1,2 cm avec la lame chirurgicale #10 du bord de l’os occipital vers les épaules en un seul mouvement lisse.
4. Faites une incision dans le raphe médian du muscle trapèze. Cela expose les muscles appariés de longus capitis.
   REMARQUE: Chez la souris, le muscle trapèze est un muscle très mince, presque transparent. Assurez-vous de rester dans la ligne médiane et de ne pas couper dans les muscles sous-jacents, car cela entraînerait des saignements inutiles.
5. Placez les deux crochets d’enrouleur entre les muscles du longus capitis appariés, l’un orienté vers la gauche et l’autre vers la droite. Le poids des hémostats fournit une tension aux crochets de l’enrouleur qui peut être modifiée en réajustant la position des hémostats.
6. Placez le microscope chirurgical en place pour mieux visualiser le champ chirurgical.
7. Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les ventres gauche et droit du muscle longus capitis apparié, en commençant par l’occiput, où la ligne médiane est facilement visible. Guidez les pinces contondantes à travers l’os de l’occiput dans la ligne médiane jusqu’à l’endroit où il rencontre la dure-mère cisternale, puis continuez à travers la dure-mère jusqu’à l’atlas.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de couper à travers les muscles de longus capitis appariés car rien ne les maintient ensemble dans la ligne médiane; cela provoquera des saignements inutiles.
8. Repositionnez les rétracteurs et ajustez la tension en repositionnant les hémostats, ouvrant ainsi la vue de la cisterna magna.
9. Utilisez les pinces à laminectomie émoussée pour séparer les muscles plus loin dans la ligne médiane afin d’obtenir une bonne fenêtre de vision du tronc cérébral et du cervelet.
10. Répétez les étapes 4.7 à 4.9 au besoin jusqu’à ce que le cervelet et le tronc cérébral apparaissent sous la dure-mère.
11. À l’aide de pinces à laminectomie contondantes, dégagez la dure-mère des petits brins de tissu conjonctif en déplaçant la pince de la ligne médiane dans une direction latérale, jusqu’à ce qu’il y ait une vue claire du tronc cérébral et pour créer plus d’espace latéral, au besoin pour la cible.

5. Ouverture de la membrane cisternale

1. Utilisez la pince Dumont inclinée (#4/45) pour saisir la dure-mère, qui s’étend de l’os occipital à l’atlas. Attrapez la dure-mère près de l’os occipital et utilisez les ciseaux à ressort pour faire une petite ouverture (~0,5 à 1,5 mm) dans la dure-mère.
   REMARQUE: À cet endroit rostral, l’espace entre le tronc cérébral et la dure-mère sus-jacente est le plus large, offrant suffisamment d’espace pour une manipulation sûre de la dure-mère.
2. Utilisez les ciseaux à ressort pour soulever la dure-mère et ouvrir davantage la dure-mère. La taille de la fenêtre dépend de la cible.
   REMARQUE: Une fenêtre plus grande sera nécessaire lors de plusieurs injections longitudinales ou bilatérales; une petite fenêtre sera suffisante lors de l’injection unilatérale unique ou médiane.
3. Une fois la dure-mère ouverte, drainez l’excès de liquide céphalo-rachidien avec une pointe stérile.

6. Identification des points de repère et du point zéro

1. Visualisez la surface dorsale du tronc cérébral avec des repères détaillés à travers la dure-mère ouverte. L’obex, le point où le canal central s’ouvre dans le ventricule IV, est le point zéro standard antérieur-postérieur et médiolatéral.

7. Coordonnées de la cible

REMARQUE : Pour diverses cibles, nous avons inclus une liste de coordonnées standard avec des coordonnées postérieures antérieures (AP) et médiolatérales (ML) par rapport aux coordonnées bregma et cisterna magna du point zéro avec les coordonnées AP et ML par rapport à l’obex du point zéro afin de faciliter la transition entre les méthodologies (tableau 1). Les coordonnées dorsoventrales (DV) sont relatives à la surface du cerveau ou du cervelet (approche standard) ou à la surface du tronc cérébral ou de la corde cervicale supérieure (approche cisterna magna) au point d’entrée AP et ML. La planification doit être faite avant la chirurgie.

1. Utilisez les trois ensembles de coordonnées pour déterminer la cible : AP, ML et DV. En raison de la position de la tête, l’orientation relative des structures du tronc cérébral varie selon l’emplacement.
   1. Pour la distance cible >0,4 mm entre le caudal et l’obex (Figure 1B, vert), effectuez les opérations suivantes.
      1. AP : Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard (p. ex., Paxinos et Franklin atlas²) ou des séries de tissus découpés dans le plan transversal pour estimer la distance AP entre obex et la cible.
      2. ML : Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard ou série de tissus découpés dans le plan transversal pour estimer la distance ML entre obex et la cible.
      3. DV : Estimer les coordonnées par rapport à la surface du cerveau ou du cervelet au point cible AP et ML. Utilisez n’importe quel atlas de référence stéréotaxique standard ou série de tissus coupés dans le plan transversal pour estimer la distance entre la surface du tronc cérébral aux coordonnées AP et ML souhaitées et la cible.
   2. Pour la distance cible <0,4 mm entre le caudal et l’obex (Figure 1B, orange), effectuez les opérations suivantes.
      1. AP: Ajustez les coordonnées pour tenir compte de l’antéroflexion du tronc cérébral. Pour les coordonnées ventrales et rostrales, le point d’entrée du tronc cérébral AP sera plus caudal par rapport à la coordonnée AP cible dans le plan standard.
      2. ML : Dériver les coordonnées de la cible à partir d’un atlas de référence stéréotaxique standard ou d’une série de tissus découpés dans le plan transversal. Les coordonnées seront relatives à la ligne médiane visualisée au niveau du point d’accès cible.
      3. DV : Estimer les coordonnées par rapport à la surface du tronc cérébral au point cible AP et ML. Ajuster la VQ pour tenir compte de l’antéroflexion du tronc cérébral. Pour les coordonnées ventrales et rostrales, les coordonnées DV seront plus grandes que la distance de la surface dorsale du tronc cérébral dans le plan standard.

8. Injection de la cible

1. Abaissez la pipette ou la seringue jusqu’à la cible à l’aide du bras stéréotaxique et injectez la solution comme pour les approches stéréotaxiques standard. Laisser en place pendant 1 à 5 minutes après l’injection, pour éviter une trace d’aiguille lors de l’utilisation de volumes compris entre 3 et 50 nL. Ensuite, soulevez la pipette ou la seringue à l’aide du bras stéréotaxique.
2. Répétez l’étape 8.1. pour plusieurs cibles.

9. Fermeture du champ chirurgical

1. Retirez soigneusement les crochets du champ chirurgical. Les muscles appariés de longus capitis retomberont dans une position neutre, couvrant entièrement la cisterna magna. Ne fermez pas le muscle trapèze et la dure-mère dans la ligne médiane car ils sont trop fragiles pour tenir les sutures.
2. Fermez la peau avec trois sutures en nylon ou en polypropylène (5-0 ou 6-0).

10. Soins postopératoires

1. Désactivez l’isoflurane et retirez la souris du cadre stéréotaxique. Placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant et observez jusqu’à ce qu’elle soit éveillée et en mouvement.
2. Surveillez l’état de santé, le poids et les sutures les jours postopératoires 1 à 3. Retirez les sutures le jour 10 si elles ne sont pas déjà retirées.

Résultats

L’approche cisterna magna permet de cibler les structures caudales du tronc cérébral et de la moelle cervicale supérieure qui sont autrement difficiles à atteindre par des approches stéréotaxiques standard ou qui sont sujettes à un ciblage incohérent. La chirurgie pour atteindre la cisterna magna nécessite des incisions de la peau, une fine couche de muscle trapèze et l’ouverture de la dure-mère et est donc bien tolérée par les souris. Il est particulièrement efficace et moins invasif lorsqu’...

Discussion

La chirurgie stéréotaxique standard s’appuie généralement sur des repères crâniens pour calculer les coordonnées des sites cibles dans le^{SNC 1}. Les sites cibles sont ensuite accessibles par des trous de bavure qui sont percés à travers le crâne¹. Cette méthode n’est pas idéale pour le tronc cérébral caudal car les sites cibles sont situés loin des repères du crâne dans les plans antéropostérieur et dorsoventral² et com...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window