Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Resumo

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Resumo

A tomografia de coerência óptica (OCT) oferece um método não invasivo para o diagnóstico de retinopatia. A máquina OCT pode capturar imagens transversais da retina a partir das quais a espessura da retina pode ser calculada. Embora a OCT seja amplamente utilizada na prática clínica, sua aplicação na pesquisa básica não é tão prevalente, especialmente em pequenos animais, como camundongos. Devido ao pequeno tamanho de seus globos oculares, é um desafio realizar exames de imagem de fundo de olho em camundongos. Portanto, um sistema de imagem retiniana especializado é necessário para acomodar a imagem OCT em pequenos animais. Este artigo demonstra um sistema específico para pequenos animais para procedimentos de exame OCT e um método detalhado para análise de imagens. Os resultados do exame OCT da retina de camundongos knockout do receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (Vldlr) e camundongos C57BL/6J são apresentados. As imagens OCT de camundongos C57BL/6J mostraram camadas da retina, enquanto as de camundongos knockout Vldlr mostraram neovascularização sub-retiniana e afinamento da retina. Em resumo, o exame OCT poderia facilitar a detecção não invasiva e a medição da retinopatia em modelos de camundongos.

Introdução

A tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica de imagem que pode fornecer imagens in vivo de alta resolução e corte transversal para tecidos 1,2,3,4,5,6,7,8, especialmente para o exame não invasivo na retina 9,10,11,12 . Também pode ser usado para quantificar alguns biomarcadores importantes, como a espessura da retina e a espessura da camada de fibras nervosas da retina. O princípio da OCT é a reflectometria de coerência óptica, que obtém informações teciduais transversais a partir da coerência da luz refletida de uma amostra e a converte em uma forma gráfica ou digital através de um sistema computacional⁷. A OCT é amplamente utilizada em clínicas de oftalmologia como uma ferramenta essencial para diagnóstico, acompanhamento e manejo de pacientes com distúrbios da retina. Também pode fornecer informações sobre a patogênese das doenças da retina.

Além das aplicações clínicas, a OCT também tem sido usada em estudos com animais. Embora a patologia seja o padrão-ouro de caracterização morfológica, a OCT tem a vantagem de imagens in vivo não invasivas e acompanhamento longitudinal. Além disso, tem sido demonstrado que a OCT está bem correlacionada com a histopatologia em modelos animais de retinopatia 11,13,14,15,16,17,18,19,20. O rato é o animal mais comumente usado em estudos biomédicos. No entanto, seus pequenos globos oculares representam um desafio técnico para a realização de imagens OCT em camundongos.

Em comparação com a OCT usada pela primeira vez para imagens da retina em camundongos^21,22, a OCT em pequenos animais agora foi otimizada em relação a sistemas de hardware e software. Por exemplo, o OCT, em combinação com o rastreador, reduz significativamente a relação sinal-ruído; As atualizações do sistema de software OCT permitem que mais camadas da retina sejam detectadas automaticamente; e o beamer DLP integrado ajuda a reduzir os artefatos de movimento.

O receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (Vldlr) é uma proteína transmembrana em células endoteliais. É expressa em células endoteliais vasculares da retina, células epiteliais pigmentares da retina e ao redor da membrana limitante externa^23,24. A neovascularização sub-retiniana é o fenótipo de camundongos knockout Vldlr ²³. Portanto, camundongos knockout Vldlr são usados para investigar a patogênese e a potencial terapia da neovascularização sub-retiniana. Este artigo demonstra a aplicação de imagens OCT para detectar lesões retinianas em camundongos knockout Vldlr, na esperança de fornecer alguma referência técnica para a pesquisa de retinopatia em modelos animais de pequeno porte.

Protocolo

As operações foram realizadas seguindo a Declaração sobre o Uso de Animais na Pesquisa Oftalmológica e Visão da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia. O delineamento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da instituição (Comitê de Ética Médica da JSIEC, EC 20171213(4)-P01). Camundongos C57BL/6J de dois meses de idade e camundongos knockout Vldlr foram utilizados neste estudo. Havia 7 camundongos em cada grupo, todos do sexo feminino e pesavam de 20 g a 24 g.

1. Condições experimentais

1. Atribua os ratos a dois grupos: um grupo experimental composto por camundongos knockout Vldlr e um grupo controle composto por camundongos C57BL/6J.
2. Alimente os ratos com comida e água convencionalmente.
3. Elevar os ratos no laboratório animal sob condições estáveis de temperatura ambiente (22 °C), umidade (50-60%), ciclo claro-escuro (12 h-12 h) e intensidade da luz ambiente (350-400 lux).
4. Preparar o equipamento experimental: tomografia de coerência óptica com oftalmoscópio a laser de varredura confocal (cSLO) para animais de pequeno porte (Figura 1A).
5. Preparar todos os materiais necessários para o experimento (Figura 1B) e pesar os camundongos (Figura 1C).

2. Registos de informação

1. Registre as informações: grupo, código, data de nascimento, idade, sexo, peso e dosagem anestésica.

3. Inicialização e teste do instrumento

1. Ligue o computador e inicie o software.
2. Clique no botão Testar programa para concluir o programa de teste.
3. Ligue o termóstato e pré-aqueça-o à temperatura de 37 °C.
4. Inicie o procedimento do módulo OCT após o teste do programa.
5. Crie um novo assunto e preencha as informações do mouse.
6. Pré-aqueça o cobertor elétrico e cubra-o com toalhas cirúrgicas.

4. Anestesia

1. Use pó anestésico liofilizado contendo tiletamina e zolazepam para preparar a mistura anestésica.
   NOTA: Siga as recomendações do comitê de ética animal local para a escolha, dosagem e via de administração da anestesia. Anestesiar o animal com um anestésico que proporcionará imobilidade e perda da percepção da dor por pelo menos 1 hora, após o que o animal se recupera rapidamente. A dosagem deve ser baseada na duração do tempo de experimento, peso do animal e outros fatores.
2. Anestesiar o animal utilizando a mistura anestésica preparada. Certifique-se de manter o animal aquecido durante todo o procedimento até a recuperação.

5. Aplicação de gotas midriáticas

1. Consiga a contenção manual do mouse pelo scruff, faça com que o globo ocular se projete ligeiramente e gire a cabeça do mouse com um olho voltado para cima.
2. Aplicar as gotas midriáticas para dilatar as pupilas (Figura 2A).
3. Verifique se há dilatação da pupila após 10 minutos.

6. Posicionamento do mouse

1. Coloque um mouse em uma plataforma de cobertor elétrico.
2. Revestir ambos os olhos com gel de hialuronato de sódio medicinal (Figura 2B).
3. Parafuse uma lente esférica dupla 60 D (lente predefinida) no dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
4. Coloque uma lente de contato 100 D na córnea do camundongo com o lado côncavo tocando o gel de hialuronato de sódio na superfície da córnea (Figura 2C, D e Figura 3A-II).
5. Coloque o mouse sobre a plataforma animal pequena e de temperatura constante e mantenha o olho a 1-2 mm de distância da lente do dispositivo cSLO (Figura 3A).
6. Ajuste o ângulo da lente de contato com pinças para manter a pupila no centro da lente.
7. Ajuste os ajustes na cabeça para fazer com que o olho fique voltado para a frente.

7. Oftalmoscópio a laser de varredura confocal (cSLO)

1. Clique no botão OCT , escolha o módulo do mouse e inicie o programa cSLO (Figura 4B).
2. Selecione o modo IR (fonte de luz: luz vermelha) e ajuste o parâmetro (intervalo: 2047, Figura 4D).
3. Selecione o olho a ser examinado (olho direito: Figura 4C-1; olho esquerdo: Figura 4C-2).
4. Controle a alavanca e mova a lente predefinida em direção à lente de contato lentamente.
5. Ajuste o valor da dioptria até que a imagem do polo posterior esteja clara (Figura 4E).
6. Faça ajustes adicionais para alinhar a imagem do polo posterior da retina, centralizando-a na cabeça do nervo óptico.

8. Tomografia de coerência óptica (OCT)

1. Inicie o programa OCT (Figura 4G).
2. Clique na barra de progresso para cima e para baixo até que a imagem da OCT apareça (Figura 4H).
3. Ajustar parâmetros: Range Min (Figura 4I) = 0-20, Range Max (Figura 4J) = 40-60.
4. Ajuste a distância da lente predefinida e a direção da posição até obter uma imagem OCT ideal.
5. Selecione a posição de varredura movendo a linha padrão no cSLO (Figura 4M).
6. Comece a varredura da cabeça do nervo óptico.
7. Coletar imagens na mesma ordem para cada olho: linha horizontal: cabeça do nervo óptico → superior → inferior; linha vertical: cabeça do nervo óptico → nasal → temporal.
8. Colete imagens de quatro direções.
9. Clique em Média para sobrepor os sinais de imagem cSLO e OCT (Figura 4F e Figura 4O).
10. Clique no botão de captura para adquirir a imagem SLO-OCT (Figura 4P).
11. Salve e exporte todas as imagens (Figura 4Q, R).

9. Fim da experiência (após o exame PTU)

1. Coloque o mouse sobre o cobertor elétrico para mantê-lo aquecido até que ele acorde.
   NOTA: O rato deve ser monitorizado até recuperar a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. A exposição pós-operatória à luz brilhante deve ser minimizada.
2. Remova a lente de contato 100 D.
3. Aplique o gel de olho de levofloxacina para proteger a córnea.
4. Coloque o rato de volta na gaiola depois de acordar.
   NOTA: Certifique-se de que o rato examinado não é devolvido à companhia de outros ratinhos até que esteja totalmente recuperado.
5. Desligue o software e desligue o computador.
6. Limpe a lente de contato 100 D com água; secar a lente.
7. Limpar e desinfetar o ambiente.

10. Análise de imagem

1. Compare as imagens OCT de camundongos knockout Vldlr com as de camundongos C57BL/6J.
2. Observe múltiplas posições: varreduras verticais e horizontais passando pela papila óptica; exames superiores, inferiores, nasais e temporais; e varreduras anormais do local de reflexão.
3. Observe a espessura, a forma, as camadas e as lesões de reflectância anormais da retina em cada imagem, bem como a interface vítrea da retina e do corpo vítreo.
4. Registre os locais, características e números de lesões.

11. Correção da estratificação retiniana

1. Clique em Load Examination na interface da OCT (Figura 5A).
2. Chame as imagens OCT de um mouse de uma janela pop-up.
3. Selecionar imagens: Digitalização de imagens OCT através da papila óptica, horizontal ou verticalmente.
4. Clique duas vezes na imagem no Media Container para exibi-la na tela (Figura 5C).
5. Clique em Layer Detection (Detecção de camadas ) para concluir a colocação automática de camadas na retina (Figura 5D).
6. Selecione as linhas divisórias em ambos os lados da camada preparada para análise (Figura 6D-10).
7. Selecione uma linha divisória separada (Figura 6B-6) e clique em Edit Layer (Figura 6A-1) para ativar a linha quando um círculo vermelho aparecer (Figura 6B-7).
8. Ajuste o espaçamento (Figura 6A-4, por exemplo, 50) e o intervalo limite (Figura 6A-5, por exemplo, 50).
9. Modifique a linha divisória movendo o círculo vermelho (compare a linha divisória verde na Figura 6B e na Figura 6C; A Figura 6C mostra o resultado modificado).

12. Espessura da laminação da retina

1. Clique no botão Measure Marker (Figura 6D-9).
2. Selecione a linha divisória da camada a ser analisada (por exemplo, na camada nuclear externa, selecione a 4ª e a^5ª linha divisória na lista) para exibir o limite da camada na imagem OCT (Figura 6D-10).
3. Selecione Connect with Layer (Figura 6D-11) e Stay Connected on Move (Figura 6D-12).
4. Selecione a área para exibir os resultados (a coluna selecionada é colorida, Figura 6D-13).
5. Clique na posição a ser analisada na imagem OCT para que a linha de medição apareça (perpendicular ao eixo horizontal e consistente com a cor da área resultante) (Figura 6D-14).
6. Clique na próxima coluna para a próxima medição e revele os dados anteriores (Figura 6E-15).
7. Leia o valor Vert (espessura da posição medida) na linha Comprimento em μm (tecido) (Figura 6E, retângulo vermelho).
8. Clique em Delete Marker (Figura 6E-16) e New Marker (Figura 6E-17) para testar novamente para que os resultados cubram os dados originais (se a remedição for necessária).
9. Pressione Print Scr no teclado para salvar capturas de tela ou clique em Save Examination para salvar diretamente (Figura 5H).
10. Insira os dados em uma planilha ou software estatístico para análise estatística.

13. Medição da espessura total da retina

1. Selecione a linha 1 (ILM, membrana limitante interna, Figura 7B) e a linha 7 (OS-RPE, OS: segmentos fotorreceptores externos; PSE: camada epitelial pigmentar da retina, Figura 7C) na lista no canto superior direito.
   NOTA: A espessura total da retina significa a espessura da camada do neurepitélio da retina, que é a retina entre ILM e OS-RPE na OCT).
2. Meça a espessura da retina em ambos os lados da papila óptica em um intervalo específico.
   1. Por exemplo: a partir do aparecimento da estrutura da retina na borda da papila óptica, meça 4 valores com espaçamento de 200 μm da régua horizontal (Figura 7G, H).
3. Registre todos os valores medidos em uma planilha.
4. Use vários testes t (um por linha) para comparar os valores medidos de cada posição correspondente em ambos os grupos.

Resultados

Graças às varreduras de alta resolução da OCT, as camadas da retina do rato podem ser observadas e reflexões anormais e suas localizações exatas podem ser identificadas. As imagens de OCT da retina de camundongos knockout Vldlr e C57BL/6J foram comparadas neste estudo. As imagens OCT de todos os camundongos C57BL/6J mostraram várias camadas da retina com diferentes refletividades, e a demarcação foi clara (Figura 8D). Em contraste, todos os camundongos knockout Vldlr

Discussão

Neste estudo, a OCT usando um sistema de imagem de retina de pequenos animais foi aplicada para avaliar as alterações da retina em camundongos knockout Vldlr , que demonstram descolamento vítreo posterior incompleto, neovascularização sub-retiniana e afinamento da espessura da retina. OCT é um método de imagem não invasivo para examinar a condição da retina in vivo. A maioria dos dispositivos OCT são projetados para exame oftalmológico humano. O tamanho do equipamento de hardware, a configur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg