Analisi dell'interazione di proteine marcate fluorescenti con microvescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa

Riepilogo

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

Abstract

Nel corpo umano, la maggior parte delle principali reazioni fisiologiche coinvolte nella risposta immunitaria e nella coagulazione del sangue procedono sulle membrane delle cellule. Un primo passo importante in qualsiasi reazione dipendente dalla membrana è il legame delle proteine sulla membrana fosfolipidica. Un approccio allo studio dell'interazione proteica con le membrane lipidiche è stato sviluppato utilizzando proteine marcate fluorescentemente e citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio delle interazioni proteina-membrana utilizzando cellule vive e vescicole fosfolipidiche naturali o artificiali. Il vantaggio di questo metodo è la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. In questo metodo, le proteine sono etichettate utilizzando coloranti fluorescenti. Tuttavia, possono essere utilizzate sia proteine autoprodotte che disponibili in commercio, etichettate in modo fluorescente. Dopo la coniugazione con un colorante fluorescente, le proteine vengono incubate con una fonte della membrana fosfolipidica (microvescicole o cellule) e i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso. I dati ottenuti possono essere utilizzati per calcolare le costanti cinetiche e l'equilibrio K_d. Inoltre, è possibile stimare il numero approssimativo di siti di legame proteico sulla membrana fosfolipidica utilizzando speciali perle di calibrazione.

Introduzione

Le biomembrane separano il contenuto interno delle cellule animali e lo spazio extracellulare. Si noti che le membrane circondano anche le microvescicole formate durante il ciclo di vita della cellula e gli organelli. La membrana cellulare è prevalentemente composta da lipidi e proteine. Le proteine di membrana svolgono funzioni di segnalazione, strutturali, di trasporto e adesive. Tuttavia, il doppio strato lipidico è anche essenziale per l'interrelazione della cellula animale con lo spazio extracellulare. Questo documento propone un metodo per studiare l'interazione periferica delle proteine esterne con la membrana lipidica.

L'esempio più....

Protocollo

1. Etichettatura delle proteine fluorescenti

1. Preparazione del materiale
   1. Preparare il tampone di bicarbonato di sodio 1 M, pH 9,0, conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro una settimana.
   2. Preparare il tampone idrossilammina cloridrato da 1,5 M, pH 8,5, immediatamente prima dell'uso.
   3. Preparare una soluzione da 10 mg/mL di colorante fluorescente (vedere la Tabella dei materiali) in dimetilsolfossido.
      NOTA: questa soluzione può essere conservata per un mese a -20 °C al buio.
   4. Preparare soluzioni di anticorpi purificati o altre proteine a 1-10 mg/ml.
      NOTA: Evitare tamponi contenenti ioni....

Risultati

Il metodo di citometria a flusso qui descritto viene utilizzato per caratterizzare il legame delle proteine della coagulazione plasmatica alle piastrine attivate. Inoltre, le vescicole di fosfolipidi PS:PC 20:80 sono state applicate come sistema modello. Questo documento si concentra principalmente sulle vescicole fosfolipidiche artificiali come esempio. I parametri del citometro, in particolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e la compensazione devono essere selezionati per ogni dispositivo specifico, l'og.......

Discussione

Il metodo proposto può essere adattato per una caratterizzazione approssimativa dell'interazione delle proteine con membrane fosfolipidiche provenienti da varie fonti e composizioni. La citometria quantitativa a flusso qui descritta concede alla risonanza plasmonica di superficie (SPR) in diversi parametri. In particolare, ha una sensibilità e una risoluzione temporale inferiori e richiede l'etichettatura fluorescente delle proteine. L'etichettatura fluorescente può portare a un cambiamento nella conformazione e alla .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A37573	fluorescent dye
Apyrase from potatoes	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
bovine serum albumin	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
EDTA disodium salt	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		cytometry data acquisition software
FlowJo	Tree Star		cytometer software for data analysis
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme research	HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride	Panreac	141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840032P
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandin E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate	Corning	61-065-RO
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm	Sartorius	VS0171
Trisodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	S1804-1KG