Generazione e caratterizzazione dell'infarto miocardico ventricolare destro indotto dalla legatura permanente dell'arteria coronaria destra nei topi

Riepilogo

Ci sono diverse differenze tra i ventricoli destro e sinistro. Tuttavia, la fisiopatologia dell'infarto ventricolare destro (RVI) non è stata chiarita. Nel presente protocollo viene introdotto un metodo riproducibile per la generazione di modelli murini RVI, che può fornire un mezzo per spiegare il meccanismo di RVI.

Abstract

L'infarto ventricolare destro (RVI) è una presentazione comune nella pratica clinica. La RVI grave può portare a disfunzione emodinamica fatale e aritmia. In contrasto con il modello di infarto miocardico di topo (MI) ampiamente utilizzato generato dalla legatura dell'arteria coronaria sinistra, il modello murino RVI è raramente impiegato a causa della difficoltà associata alla generazione del modello. La ricerca sui meccanismi e il trattamento del rimodellamento e della disfunzione del camper indotto da RVI richiede modelli animali per imitare la fisiopatologia della RVI nei pazienti. Questo studio introduce una procedura fattibile per la generazione di modelli RVI in topi C57BL/ 6J. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato sulla base di quanto segue: valutazione delle dimensioni dell'infarto a 24 ore dopo l'infarto, valutazione del rimodellamento cardiaco e della funzione con ecocardiografia, valutazione dell'emodinamica del camper e istologia della zona dell'infarto a 4 settimane dopo RVI. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronaria in RV. Questo modello murino di RVI faciliterebbe la ricerca sui meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e cercherebbe nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.

Introduzione

Il ventricolo destro (RV), a lungo pensato per essere un semplice tubo collegato all'arteria polmonare, è stato erroneamente trascurato per molti anni¹. Tuttavia, recentemente c'è stato un crescente interesse per la funzione RV poiché svolge un ruolo essenziale nei disturbi emodinamici ^2,3 e può servire come predittore di rischio indipendente di malattie cardiovascolari ^4,5,6,7. Le malattie RV includono infarto RV (RVI), ipertensione arteriosa polmonare e malattia valvolare⁸. In contrasto con l'immenso interesse per l'ipertensione dell'arteria polmonare, RVI è rimasto trascurato ^7,9.

La RVI, di solito accompagnata da infarto miocardico inferiore-posteriore^10,11, è causata dall'occlusione dell'arteria coronaria destra (RCA). Secondo le indagini cliniche, la RVI grave probabilmente induce disturbi emodinamici e aritmie, come ipotensione, bradicardia e blocco atrioventricolare, associati a una maggiore morbilità e mortalità ospedaliera 12,13,14. La funzione RV potrebbe recuperare spontaneamente in una certa misura anche in assenza di riperfusione^15,16. Esistono diverse differenze morfologiche e funzionali tra il ventricolo sinistro (LV) e RV¹⁷. Si ritiene che il camper sia più resistente all'ischemia rispetto al LV⁸, in parte a causa della più ampia formazione di circolazione collaterale dopo RVI. Chiarire le differenze tra infarto LV (LVI) e RVI e identificare i meccanismi sottostanti fornirebbe nuovi bersagli terapeutici per la rigenerazione cardiaca e l'insufficienza cardiaca ischemica. Tuttavia, a causa della difficoltà associata alla generazione di modelli murini RVI, la ricerca di base su RVI è principalmente limitata.

Un grande modello animale di RVI è stato generato legando RCA in suini¹⁸, che è più facile da usare a causa del RCA visibile. Rispetto al modello animale di grandi dimensioni, il modello murino presenta i seguenti vantaggi: maggiore accessibilità nella manipolazione genica, costi economici inferiori e periodo sperimentale più breve^19,20. Sebbene in precedenza fosse stato riportato un modello RVI murino incentrato sull'influenza di RVI sulla funzione LV, le fasi dettagliate della procedura, le difficoltà e i punti chiave di funzionamento e le caratteristiche del modello come i cambiamenti emodinamici non sono stati completamente introdotti ^9,21.

Questo articolo fornisce procedure chirurgiche dettagliate per la generazione di un modello murino di RVI. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato da misurazione ecocardiografica, valutazione emodinamica invasiva e analisi istologica. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronarica in RV. La tecnica introdotta in questo documento aiuterebbe i principianti a cogliere rapidamente la generazione del modello RVI del topo con mortalità operativa accettabile e approcci di valutazione affidabili. Il modello murino di RVI aiuterebbe a ricercare i meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e a cercare nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996) e sono state approvate dal Comitato etico animale dell'ospedale Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, Cina). Topi maschi sani C57BL / 6J (8-10 settimane; peso corporeo, 25-30 g) sono stati ottenuti dall'Animal Center della Southern Medical University. Possono essere utilizzati anche topi femmina, ma non è consigliabile mescolare entrambi i sessi a causa delle potenziali influenze delle differenze sessuali. Dopo l'arrivo, i topi sono stati alloggiati sotto un ciclo buio / luce di 12 ore / 12 ore (3-4 topi per gabbia), con cibo e acqua ad libitum.

1. Preparazione per la chirurgia

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave prima dell'intervento. Regolare la piastra riscaldante a 37 °C.
2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital (vedi Tabella dei materiali) per alleviare il dolore chirurgico. Posizionare i topi in scatole separate per l'induzione dell'anestesia. Garantire la profondità dell'anestesia dall'assenza di una risposta di astinenza da punta.
   NOTA: Si consiglia inoltre di utilizzare l'1,5% di isoflurano per l'anestesia per inalazione perché è meglio per l'analgesia.
3. Posiziona i topi supini sul pad fissando i loro incisivi con una sutura e immobilizzando i loro arti con nastro adesivo. Garantire nuovamente la profondità dell'anestesia controllando il riflesso.
4. Rimuovere i peli dal collo allo xifoide con una crema depilatoria. Disinfettare l'area chirurgica 3 volte con scrub antisettico alternato e alcool al 75% e quindi drappeggiare il campo chirurgico.
5. Eseguire l'intubazione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Regolare la frequenza respiratoria dell'animale con un mini ventilatore (vedi Tabella dei materiali) a 150/min e il volume di marea a 300 μL.
      NOTA: non è necessario utilizzare la modalità di pressione positiva di fine espirazione.
   2. Estrarre leggermente la lingua con una pinzetta, sollevare la mandibola con un depressore della lingua per esporre la glottide ed eseguire l'intubazione intra-tracheale inserendo una cannula da 22 G nella glottide.
   3. Accendere il mini ventilatore e collegare la cannula tracheale al ventilatore. Il fenomeno dell'ondulazione toracica che diventa uguale alla frequenza del ventilatore indica un successo dell'intubazione. Fissare la cannula con del nastro adesivo per evitare che scivoli durante l'operazione.

2. Legatura permanente dell'arteria coronaria destra

1. Collegare correttamente gli elettrodi per elettrocardiografia (ECG) (vedere Tabella dei materiali) agli arti del topo e registrare l'ECG.
   NOTA: uno dei lead II, III o AVF viene selezionato come lead di monitoraggio; Lead III è più appropriato.
2. Apri il petto.
   1. Fai un'incisione lunga 1 cm nella pelle parallela alla terza costola destra con forbici oftalmiche. Determinare nuovamente il terzo intercostale e garantire uno spazio adeguato in base all'angolo dello sterno.
      NOTA: La direzione dell'incisione cutanea è fatta dall'angolo dello sterno alla linea ascellare anteriore destra.
   2. Separare e tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori con forbici e micro pinze sopra il terzo spazio intercostale. Successivamente, separare senza mezzi termini il muscolo intercostale con una pinza del gomito per esporre il campo chirurgico.
      NOTA: Solo una piccola parte dei muscoli pettorali deve essere tagliata, e quindi si consiglia una separazione smussata per esporre il cuore.
   3. Incidere il pericardio. Sollevare l'atrio destro con cotone sterile e legare l'RCA con uno sterile 8-0 filo di nylon con un intervallo di legatura di 3-5 mm. Dopo aver legato l'RCA, l'ECG di monitoraggio (piombo III) mostra l'elevazione del segmento ST.
      NOTA: poiché l'RCA del mouse è invisibile, la sua posizione anatomica deve essere attentamente confermata. Il miocardio del camper è molto più sottile di quello del LV. Pertanto, è difficile afferrare la profondità dell'ago inserito. È facile indurre bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare se la profondità dell'ago inserito è troppo profonda e l'intervallo di legatura è troppo ampio.
3. Rimuovere il cotone sterile e suturare i muscoli e la pelle con un filo di nylon sterile 5-0 per chiudere l'incisione intercostale. Disinfettare nuovamente la pelle con alcol al 75% e utilizzare il topo dopo l'intervento chirurgico.
   NOTA: Il muscolo ben suturato è importante per evitare l'aerotorace. Un tubo di drenaggio sterile viene posizionato nella cavità toracica fino al completamento della chiusura del torace, quindi la cavità toracica viene evacuata da una siringa per iniezione che collega il tubo di drenaggio.
   NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i topi vengono posizionati su una piastra riscaldante. Analgesici come la buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo, iniezione sottocutanea) sono necessari per ridurre il dolore degli animali dopo l'intervento chirurgico. Le complicanze attese sono bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare e il tasso di mortalità post-operatorio è del 10-20%.

3. Valutazione ecocardiografica della funzione RV dopo l'intervento chirurgico

NOTA: per l'ecocardiografia, utilizzare una sonda MS400D con una frequenza centrale di 30 MHz, collegata a un sistema di imaging ad ultrasuoni ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali). L'esame ecocardiografico viene eseguito 4 settimane dopo l'intervento chirurgico.

1. Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano per inalazione.
2. Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma ad ultrasuoni per la fissazione degli animali e il funzionamento ad ultrasuoni. Fissare i suoi artigli all'elettrodo per ottenere una registrazione ECG attraverso un sistema collegato alla macchina ad ultrasuoni.
3. Monitorare la frequenza cardiaca attraverso l'ECG e mantenerla tra 450-550 battiti / min regolando la concentrazione di anestetico tra l'1,5% e il 3%.
4. Rimuovere i capelli dal petto del topo con una crema depilatoria e applicare il gel ad ultrasuoni sulla pelle del torace.
5. Impostare la piattaforma in posizione orizzontale. Orientare il trasduttore parallelamente alla gamba sinistra e ottenere l'immagine dell'asse lungo ventricolare sinistro. Ruotare la sonda di 90° in senso orario per ottenere la vista LV a breve asse. Premere il pulsante Cine store per salvare le immagini.
   NOTA: l'angolo superiore sinistro della piattaforma è inclinato nel punto più basso. L'angolo di rotazione LV a breve asse del trasduttore viene mantenuto mentre il trasduttore è orientato verso la spalla destra del mouse.
6. Spostarsi verso il basso verticalmente del trasduttore, mantenendo la sua posizione sopra l'addome superiore e sotto il diaframma del mouse in modalità B. Regola leggermente la posizione della piattaforma ruotando gli assi x e y fino a quando il camper, l'atrio destro (RA), l'atrio sinistro (LA) e il LV sono chiaramente visibili sullo schermo. Salva le immagini apicali a quattro camere premendo il pulsante Cine store o Frame store .
   NOTA: la modalità B viene utilizzata per visualizzare la vista bidimensionale (2D) del cuore.
7. Premere la modalità M; dopo aver visualizzato la linea dell'indicatore 2x, individuare la linea dell'indicatore sull'orifizio della valvola tricuspide per ottenere il movimento del piano anulare tricuspide. Premere il pulsante Cine store o Frame store per salvare dati e immagini.
   NOTA: modalità M indica la modalità di movimento, che rivela il movimento del cuore o del vaso in forma curva.
8. Premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Fare clic sul pulsante Misurazione area per zonare in RV e LV. Calcolare l'area di RV e LV per ottenere il rapporto di area tra RV e LV.
   1. Fare clic sul pulsante Timeline e creare due linee di base per definire l'intervallo di movimento del piano anulare tricuspide durante i periodi sistolico e diastolico. Fare clic sul pulsante Distanza e misurare la distanza tra due linee di base per ottenere un'escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE).
9. Inclina il lato sinistro della piattaforma nel punto più basso. Mantenere la sonda con un angolo di 30° rispetto all'asse orizzontale lungo la linea ascellare anteriore destra. Ruotare gli assi x e y della piattaforma per visualizzare il camper.
   1. Premere il pulsante M-mode e individuare la linea dell'indicatore nel punto iperecoico del setto per ottenere l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV. Premere il pulsante Cine Store per salvare l'immagine.
10. Aprire l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV, premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Misurare la distanza interna del camper alla fine della diastole (RVIDd), della frazione di eiezione RV (RVEF) e dell'accorciamento della frazione RV (RVFS) utilizzando lo strumento di misurazione integrato del sistema ecocardiografico.
11. Smettere di somministrare isoflurano e posizionare il mouse sulla piastra riscaldante per 3-5 minuti fino a quando non riprende conoscenza. Successivamente, riportare il mouse nella sua gabbia con un ciclo di luce / buio di 12 ore.

4. Misure invasive di RV emodinamica

NOTA: L'emodinamica RV viene valutata attraverso il cateterismo cardiaco destro 4 settimane dopo RVI. Viene applicato un catetere da 1,0 F insieme a un sistema di monitoraggio.

1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio (vedere Tabella dei materiali).
2. Dopo aver confermato la scomparsa del riflesso di astinenza del pedale, tenere il mouse in posizione supina e immobilizzarlo con del nastro adesivo.
3. Radere i peli del torace dall'angolo sternale allo xifoide. Disinfettare l'area operativa con alcool al 75%.
4. Eseguire l'intubazione tracheale e impostare il parametro del ventilatore animale come descritto nei passaggi 1.5.2-1.5.3.
5. Fai un'incisione bilaterale di 1 cm sulla pelle sopra il processo xifoide e trascorri il diaframma e la costola con forbici oftalmiche per esporre il cuore.
6. Forare la parete libera ventricolare destra con un ago da 32 G. Rimuovere l'ago e premere la ferita con il cotone per fermare il sanguinamento.
7. Inserire la punta del catetere nel ventricolo destro attraverso il sito di puntura e spingere lentamente il catetere in avanti. Regolare la posizione della punta per ottenere una tipica forma d'onda di pressione RV mostrata su un monitor e un sistema di registrazione.
   NOTA: La vena giugulare destra è anche una via appropriata per la misurazione emodinamica.
8. Dopo 10 minuti di stabilizzazione, registrare i dati della pressione arteriosa sistolica RV (RVSBP), della pressione diastolica finale RV (RVEDP) e RV dP / dt. Fare clic sul pulsante Seleziona per selezionare i cicli cardiaci per il calcolo e quindi fare clic sul pulsante Analizza per calcolare i valori medi dei cicli selezionati.
9. Rimuovere il catetere dopo il completamento della registrazione e quindi posizionarlo all'interno della normale soluzione salina.
10. Eutanasizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di sovradosaggio di pentobarbital sodico (150 mg/kg) e poi sacrificarlo per lussazione cervicale.
11. Raccogliere il cuore e la tibia per l'analisi istologica.

5. Cast vascolare coronarico utilizzando un agente di colata vascolare

1. Eparinoilizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 200 UI/mL di eparina sodica a 2000 UI/kg (vedere Tabella dei materiali).
2. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio.
3. Posizionare l'animale supino sul tampone e intubare per la ventilazione artificiale seguendo i passaggi 1.5.2-1.5.3.
4. Aprire il torace con le forbici chirurgiche come descritto nel passaggio 4.5 ed esporre il cuore.
5. Fai una tacca di 3 mm con forbici oftalmiche sugli atri destro e perfondi il cuore con 5 ml di soluzione salina normale attraverso l'apice cardiaco con un iniettore.
6. Bloccare il sangue dall'aorta con un morsetto aortico e perfondere 0,1 ml di nitroglicerina (1 mg / mL) attraverso l'apice cardiaco con un iniettore per dilatare l'arteria coronaria.
7. Preparare il reagente fuso mescolando gli ingredienti nel kit secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Si raccomanda di preparare contemporaneamente il reagente fuso e la perfusione con soluzione salina e nitroglicerina normali per prevenire la chiusura microvascolare.
8. Perfondere il cuore con 1 mL di reagente fuso attraverso l'apice cardiaco e attendere 2-3 ore.
9. Erodere il cuore con idrossido di sodio al 50% per 2-3 giorni e rimuovere il tessuto muscolare o il tessuto connettivo risciacquando con soluzione salina normale.
10. Scatta foto sotto una fotocamera.
    ATTENZIONE: Il reagente cast è dannoso per gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. L'idrossido di sodio è corrosivo. È necessario indossare guanti protettivi, occhiali e un cappotto da laboratorio. Il reagente fuso deve essere preparato in una cappa aspirante.

Risultati

In questo studio, i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo RVI (n = 11) o all'operazione fittizia (n = 11). Il cast coronarico in 2 cuori di topo normali è mostrato nella Figura 1A. In risposta alla legatura RCA, l'elevazione del segmento ST è stata osservata nel piombo III dell'ECG (Figura 1B). Inoltre, la colorazione del cloruro di tetrazolio 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) ha mostrato che l'area dell'infarto rappresenta il 45% della parete libe...

Discussione

Sicard e colleghi francesi hanno riportato per la prima volta un modello murino di RVI nel 2019, che descriveva il processo chirurgico e si concentrava sull'interazione tra LV e RV dopo RVI⁹. Tuttavia, ad oggi, nessuno studio ha riportato l'utilizzo di questo modello per ulteriori studi. Una procedura più dettagliata sarebbe utile per i ricercatori per utilizzare il modello murino di RVI per l'indagine. In contrasto con il rapporto di Sicard et ^al.9, abbiamo fornito inform...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	For TTC staining
Animal Mini Ventilator	Havard	Type 845	For artificial ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit	Polyscience Inc	7349	For vasculature casting
buprenorphine	Isoreag	1134630-70-8	For reduce the pain of mice after surgery
C57BL/6J mice + D29A1A2:D27	Animal Center of South Medical University	-	For the generation of mouse RVI model
Camera	Sangnond		For taking photograph
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light for operation
electrocardiograph	ADI Instrument	ADAS1000	For recording electrocardiogram
hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove mouse hair
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Heating
Hematoxylin-eosin dye	Leagene	DH0003	Hematoxylin-eosin staining
Heparin sodium salt	Macklin	H837056	For heparization
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Lab made spatula			Work as a laryngoscope
Lab made tracheal cannula			For intubation
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	For chest close
Microsurgical elbow tweezers	RWD life science	F11021-11	For surgery
Microsurgical scissors	NAPOX	MB-54-1	For arteriotomy
Millar Catheter	AD Instruments, Shanghai	1.0F	Measurement of pressure gradient
MS400D ultrasonic probe	Visual Sonic	MS400D	Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque
needle forceps	Visual Sonic	F31006-12	For surgery
nitroglycerin	BEIJING YIMIN MEDICINE Co		For dilating coronary artery
Ophthalmic scissors	RWD life science	S11022-14	For surgery
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System	AD Instruments, Shanghai	4/35	Pressure recording
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing scale
Silk suture (8-0)	Ningbo Medical Needle Co.	6-0	coronary artery ligation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
tissue forceps	Visual Sonic	F-12007-10	For surgery
tissue scissor	Visual Sonic	S13052-12	Open chest for hemodynamic measurement
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	preparation for Echocardiography measurement
Vascular Clamps	Visual Sonic	R31005-06	For blocking blood from aorta