Ablación dirigida con láser en el embrión de Saccharina latissima

Resumen

La destrucción de células específicas en el embrión es una herramienta poderosa para estudiar las interacciones celulares involucradas en el destino celular. El presente protocolo describe técnicas para la ablación con láser de células diana en el embrión temprano del alga marrón Saccharina latissima.

Resumen

En Saccharina latissima, el embrión se desarrolla como una lámina celular monocapa llamada lámina o cuchilla. Cada célula embrionaria es fácil de observar, fácilmente distinguible de sus vecinas, y puede ser dirigida individualmente. Durante décadas, la ablación con láser se ha utilizado para estudiar el desarrollo embrionario. Aquí, se desarrolló un protocolo para la ablación con láser específica de la célula para embriones tempranos del alga marrón S. latissima. El trabajo presentado incluye: (1) la preparación de embriones de Saccharina , con una descripción de los parámetros críticos, incluidas las condiciones de cultivo, (2) los ajustes de ablación con láser y (3) el monitoreo del crecimiento posterior del embrión irradiado mediante microscopía de lapso de tiempo. Además, se proporcionan detalles sobre las condiciones óptimas para transportar los embriones desde la plataforma de imágenes hasta el laboratorio, lo que puede afectar profundamente el desarrollo embrionario posterior. Las algas pertenecientes al orden Laminariales muestran patrones de embriogénesis similares a Saccharina; por lo tanto, este protocolo puede transferirse fácilmente a otras especies en este taxón.

Introducción

La ablación con láser se ha utilizado durante décadas para estudiar el desarrollo embrionario. La irradiación de células embrionarias con un rayo láser permite monitorear el potencial regenerativo y la modificación del linaje celular durante la embriogénesis e investigar el impacto de la ablación dirigida en la división celular y el destino celular. Los organismos modelo utilizados en los métodos de ablación con láser son típicamente animales, como insectos ^1,2, nematodos ^3,4, vertebrados ^5,6 y ocasionalmente plantas ^7,8. Además, se utilizó un enfoque de microablación láser en el alga marrón Fucus en 1994 y 1998 para demostrar el papel de la pared celular en la fotopolarización del embrión temprano ^9,10.

Las algas pardas pertenecen al grupo Stramenopiles, divergieron en la raíz del árbol eucariota hace 1.600 millones de años. Como resultado, son filogenéticamente independientes de otros organismos multicelulares, como animales y plantas¹¹. Saccharina latissima pertenece al orden Laminariales, más comúnmente conocido como algas marinas, y se encuentran entre los organismos más grandes de la tierra, alcanzando tamaños de más de 30 m. Saccharina sp. es un gran alga marina utilizada para muchas aplicaciones como alimentos y piensos, y sus polisacáridos se extraen para su uso en las industrias agrícola, farmacológica y cosmética en todo el mundo^{12, 13}. Su cultivo, principalmente en Asia y más recientemente en Europa, requiere la preparación de embriones en criaderos antes de liberar juveniles en mar abierto. Como todas las algas marinas, tiene un ciclo de vida bifásico compuesto por una fase gametofítica microscópica, durante la cual un gametofito haploide crece y produce gametos para la fertilización, y una fase esporófita macroscópica diploide, donde se desarrolla una gran cuchilla plana desde su sujeción unida al fondo marino o las rocas. El esporófito libera esporas haploides en la madurez, completando así el ciclo de vida 14,15,16.

S. latissima presenta algunos rasgos morfológicos interesantes¹⁷. Su embrión se desarrolla como una lámina plana monocapa 15,18,19 antes de adquirir una estructura multicapa coincidiendo con la aparición de diferentes tipos de tejidos. Además, Laminariales es uno de los únicos taxones de algas pardas cuyos embriones permanecen adheridos a su tejido gametofítico materno (Desmarestiales y Sporochnales también lo hacen¹⁵). Esta característica ofrece la oportunidad de estudiar el papel del tejido materno en este proceso de desarrollo y comparar los mecanismos de control materno en algas marrones con los de animales y plantas.

Este artículo presenta el primer protocolo completo para la ablación con láser en un embrión temprano de algas marinas. Este protocolo que involucra la técnica UV ns-pulsada da como resultado la destrucción específica de células embrionarias individuales para estudiar sus respectivos roles durante la embriogénesis. El procedimiento ofrece un enfoque confiable para investigar las interacciones celulares y el destino celular durante la embriogénesis en Laminariales.

Protocolo

1. Producción de Saccharina latissima gametophytes

1. Recolectar esporófitos maduros de S. latissima de la naturaleza como se describió anteriormente^20,21. Asegúrese de que los esporófitos seleccionados estén desprovistos de epífitas (pequeños organismos visibles en la superficie de la cuchilla) o parásitos internos (que se encuentran en las áreas blanqueadas o manchas en la cuchilla).
2. Con un bisturí, corte la parte más oscura en el centro de la cuchilla (tejido fértil productor de esporas²²) en 1-5 piezas cuadradas (1 cm²), evitando cualquier mancha blanqueada, si está presente.
3. Retire las epífitas restantes limpiando suavemente los trozos cortados con la parte posterior de un bisturí y un poco de papel absorbente.
4. Coloque las piezas limpias en un plato de vidrio lleno de agua de mar natural estéril (ver Tabla de materiales) durante 45 minutos para liberar esporas después del informe publicado previamente²².
5. Retire las piezas de la cuchilla y filtre el agua de mar a través de un colador de células de 40 μm para eliminar los desechos u organismos no deseados.
6. Diluir las esporas en el filtrado a una concentración de 20-40 esporas/ml en placas de Petri de plástico²².
7. Coloque la solución de esporas en un gabinete de cultivo (ver Tabla de Materiales) configurado con las condiciones óptimas de cultivo (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D).
8. Permita que las esporas germinen y se conviertan en gametofitos.
   NOTA: La germinación de las esporas es visible después de 2 días en el gabinete, y la primera división celular de las células gametofíticas generalmente ocurre dentro de las siguientes 48 h.
9. Reemplace el medio de crecimiento después de 5 días con agua de mar natural microfiltrada enriquecida con una solución de Provasoli 0.5x (NSW1/2) (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Para evitar repetir estos pasos, se pueden seleccionar gametofitos masculinos y femeninos específicos y propagarlos vegetativamente durante varios meses. Los gametófitos permanecen vegetativos cuando se cultivan bajo luz roja (4 μE.m-2.s-1 con una longitud de onda de al menos 580 nm)²³ en las mismas condiciones de cultivo descritas anteriormente (paso 1.7).

2. Fragmentación e inducción de la oogénesis

1. Cosecha gametofitos con un raspador celular.
2. Usando un pequeño mortero de plástico, triture los gametofitos recolectados en un tubo de 1.5 ml en piezas de 4-5 celdas.
3. Llene el tubo con 1 ml NSW1/2 (paso 1.9).
4. Añadir 2,5 μL de la solución de gametofito triturada en 3 ml de agua de mar natural enriquecida con 1 solución de Provasoli (NSW) y colocarlos en una placa de Petri.
   NOTA: Se recomienda una placa de Petri con fondo de vidrio de 25 mm para facilitar su manejo.
5. Coloque los platos preparados en un gabinete de cultivo e induzca la gametogénesis a 13 °C bajo luz blanca con una intensidad de 24 μE.m-2.s-1 (luz tenue, fotoperiodo 16:8 L:D).
   NOTA: La primera gametangia (oogonia femenina y arquegonia masculina) se puede observar después de 5 días. El macho está hiper-ramificado con células pequeñas, y la hembra está compuesta por células más grandes formando filamentos largos^15,22. Los primeros huevos se observan ~ 10 días después, y la primera división de cigotos generalmente ocurre dentro de los siguientes 2 días.
6. Seis días después de observar los primeros huevos, transfiera los platos a condiciones de luz blanca más brillantes: 50 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16: 8 L: D, todavía a 13 ° C.

3. Adquisición de imágenes para la selección de embriones para la ablación y seguimiento del crecimiento posterior

1. Tome una imagen de toda la placa de Petri para (re)localizar los embriones seleccionados durante la etapa de ablación (sin necesidad de devolver la placa al microscopio ocular) y monitorear el desarrollo posterior de los embriones seleccionados.
   NOTA: Utilice un microscopio confocal de barrido láser invertido (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes (Figura 1), y la ablación con láser se describe en el paso 5.
2. Coloque la placa de Petri en el escenario y orientarla con una marca visual (por ejemplo, dibuje una línea con un marcador permanente).
3. Utilice el objetivo 10x/0.45 para centrarse en un embrión. Registre la posición de los cuatro puntos cardinales de la placa de Petri.
4. Inicie el análisis de mosaicos. Adquirir imágenes transmitidas/fluorescentes de toda la placa de Petri a baja resolución: 256 x 256 píxeles, un tiempo de permanencia de píxeles de 1,54 μs con escaneo bidireccional y un zoom digital de 0,6x utilizando un láser de 561 nm con una transmisión del 1,2%.
   NOTA: El tiempo de escaneo para una placa de Petri completa de 2,5 cm es de ~ 6 min para 225 baldosas (Figura 2). Aquí, el láser de 561 nm se utilizó para la transmisión y las imágenes de fluorescencia. La señal de fluorescencia se recogió entre 580-720 nm en los fotomultiplicadores confocales (PMT) y la luz transmitida se recogió en el PMT transmitido. El láser de 561 nm también puede monitorear la clorofila en este paso, pero es innecesario porque solo ayuda a distinguir el ruido de la señal y los organismos correctamente.
5. Guarde la imagen de escaneo de mosaico y manténgala abierta en la ventana del software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
6. Cambia el objetivo, no retires la placa de Petri.
   NOTA: El objetivo de agua 40x/1.2 se movió al costado del escenario para que el medio de inmersión (agua) pudiera agregarse al objetivo sin mover la placa de Petri de su posición inicial.
7. Navegue a través de la imagen de escaneo de mosaico previamente adquirida para seleccionar el embrión apropiado. Una vez que se ha identificado un embrión en esta imagen, mueva la etapa a la posición exacta del embrión y adquiera imágenes transmitidas / fluorescentes de ese embrión a alta resolución.
   NOTA: Configuración de alta resolución: 512 x 512 píxeles, 0,130 μm/píxel, tiempo de permanencia de píxeles de 0,208 μs con escaneo monodireccional y zoom digital 2x utilizando un láser de 561 nm con una transmisión del 0,9%.
8. Anote la imagen de escaneo de mosaico para cada embrión candidato para la ablación con láser (Figura 2B) y proceda a la etapa de ablación con láser.

4. Calibración láser

1. Calibre el láser y sincronice el software de adquisición de imágenes con el software de controlador láser en el "modo Click & Fire" y un láser pulsado de 355 nm.
   NOTA: Este paso es crucial para garantizar una sincronización perfecta entre la posición del cursor del ratón en el software del controlador láser (consulte la Tabla de materiales) con la posición en la imagen en vivo del software de adquisición.
2. Abra el paquete de software laser-driver y haga clic en Live en el paquete de software de adquisición de imágenes.
3. Sincronice ambos paquetes de software haciendo clic en Iniciar adquisición en el paquete de software de controlador láser. La imagen en vivo ahora también se graba en el software del controlador láser UV.
4. Defina un área de interés (AOI) haciendo clic en el botón Elegir AOI y haciendo clic en los bordes de la imagen (derecha, izquierda, superior e inferior) en el paquete de software del controlador láser UV.
   NOTA: Después de este paso de calibración, la configuración para el tamaño de píxel, el formato de imagen y el zoom en el paquete de software de adquisición debe permanecer constante.
5. Seleccione un área vacía en el plato y baje el nivel del escenario a 20 μm por debajo del plano focal de la muestra para enfocar el fondo de vidrio.
6. Configure el láser de ablación y las trayectorias del láser de imágenes haciendo clic en Iniciar calibración y elija Calibración manual.
7. Seleccione una potencia láser lo suficientemente alta como para ver un punto negro en el centro de la imagen en vivo correspondiente al orificio en la cubierta de vidrio (todos los obturadores deben estar abiertos).
8. Haga clic en este punto negro central con el cursor del mouse y haga clic en 18 puntos adicionales propuestos por el software para completar el procedimiento de alineación.
9. Compruebe la calibración en el "Modo Click & Fire" en el mismo coverlip.
   NOTA: La calibración láser depende de los parámetros de imagen. Una vez que el láser haya sido calibrado, asegúrese de que los parámetros de imagen (es decir, 512 x 512 píxeles, 0,130 μm / píxel, 0,208 μs de tiempo de permanencia de píxeles con escaneo monodireccional y zoom digital 2x) no hayan cambiado.

5. Ablación con láser

1. Selecciona un embrión de interés. Inicie una grabación de lapso de tiempo en el software de adquisición de imágenes.
2. Adquiera imágenes transmitidas / fluorescencia con un objetivo de 40x / 1.2 W a alta resolución (es decir, 512 x 512 píxeles, 0.130 μm / píxel, tiempo de permanencia de píxeles de 1.54 μs con escaneo monodireccional y zoom digital 2x utilizando un láser de 561 nm a 0.9% de transmisión). Adquiera la grabación de lapso de tiempo a la máxima velocidad.
3. Aleja el área al comienzo de la grabación de lapso de tiempo. Amplíe el AOI.
4. Utilice la función "Click & Fire" del software de controlador láser para aplicar la irradiación dañina en la célula de interés en el embrión. Utilice los siguientes parámetros: 45% de transmisión láser (correspondiente a un máximo de 40 μW) y duración del tiempo de pulso de 1 ms (paso 4).
   NOTA: Se recomienda la grabación de vídeo durante el disparo láser.
5. Por debajo de 688 nm, controlar la eyección de cloroplastos autofluorescentes del citoplasma.
6. Si el contenido de la celda permanece en la celda, use la función "Click & Fire" una vez más para aumentar el tamaño de la brecha en la celda. Repita, manteniendo el número de disparos al mínimo hasta que se haya liberado la mayor parte del contenido de la celda.
7. Detener el registro de lapso de tiempo después de que el embrión se haya estabilizado (es decir, no se puede detectar ningún movimiento intracelular adicional (~ 1-5 min).
8. Actualice la anotación en la imagen de escaneo de mosaico, si es necesario.

6. Monitorización del crecimiento de embriones irradiados

NOTA: El monitoreo se lleva a cabo durante varios días.

1. Determine la tasa de supervivencia monitoreando el número de embriones que se desarrollan después de la ablación con láser y compárelos con los que mueren.
   NOTA: Algunos embriones mueren inmediatamente después de la ablación por varias razones. Una tasa de mortalidad alta y rápida suele ser un signo de parámetros láser inapropiados o una exposición más alta / más prolongada al estrés durante el experimento o el transporte posterior.
2. Determine el retraso en el crecimiento midiendo la longitud de los embriones inyectados con láser todos los días y comparándola con embriones intactos.
   NOTA: La tasa de crecimiento de los organismos disparados con láser es generalmente más lenta que la de los organismos no tratados. Sin embargo, algunos ajustes láser (inapropiados) pueden inhibir el crecimiento durante más de una semana, y el crecimiento se reanuda después de eso.
3. Averigüe el daño adyacente monitoreando la reacción de las células adyacentes a las células ablacionadas. En algunos casos, la despresurización posterior a la explosión puede hacer que las células vecinas estallen.
4. Compruebe si hay contaminaciones de microbios. Monitorear el crecimiento de microalgas y bacterias en el medio. Si hay un nivel inusual de microbios presentes en el plato, deséchelo y repita el protocolo del paso 2 o el paso 3.
   NOTA: Después de la ablación con láser, los embriones dañados de S. latissima ya están muy estresados, y el estrés externo adicional puede causar un aumento de la mortalidad. Los brotes bacterianos o virales son posibles porque los embriones tratados no pueden crecer en condiciones axénicas.
5. Verifique el desarrollo global de los organismos disparados estudiando el fenotipo y entendiendo el papel en el desarrollo de la región objetivo.

Resultados

Se cultivaron gametofitos de S. latissima , y se indujo la gametogénesis para producir cigotos y embriones. Doce días después de la inducción de la gametogénesis, los embriones se sometieron a ablación con láser. Aquí, el experimento tuvo como objetivo evaluar el papel de células específicas en el desarrollo general de embriones de S. latissima . La célula más apical, la célula más basal y las células medianas fueron atacadas. Después del escaneo de baldosas, toda la placa de Petri (

Discusión

La ablación celular local con láser permite la ablación temporal y espacial con un alto nivel de precisión. Sin embargo, su eficiencia puede verse obstaculizada por la falta de accesibilidad de las células objetivo; por ejemplo, todas las células son de un embrión tridimensional. Este protocolo se desarrolló en el embrión del alga Saccharina latissima, que desarrolla una lámina monocapa en la que todas las células se pueden distinguir y destruir fácilmente individualmente con un rayo láser.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version