Ретроградный подход к имплантации для установки катетера перитонеального диализа у мышей

Резюме

В этой статье описываются модификации процедуры имплантации перитонеального диализного катетера в мышиную модель, чтобы избежать серьезных технических проблем, наблюдаемых при использовании обычных методов.

Аннотация

Мышиные модели используются для исследования различных аспектов перитонеального диализа (БП), таких как воспаление брюшины и фиброз. Эти события приводят к недостаточности брюшины у людей, которая остается областью интенсивного исследования из-за ее глубоких клинических последствий для лечения пациентов с терминальной стадией заболевания почек (ESKD). Несмотря на клиническую важность БП и связанных с ней осложнений, современные экспериментальные мышиные модели страдают от ключевых технических проблем, которые ставят под угрозу производительность моделей. К ним относятся миграция и перегиб катетера PD и обычно требуют более раннего удаления катетера. Эти ограничения также обусловливают необходимость в большем количестве животных для завершения исследования. Устраняя эти недостатки, это исследование вводит технические усовершенствования и хирургические нюансы для предотвращения часто наблюдаемых осложнений катетера БП в мышиной модели. Кроме того, эта модифицированная модель подтверждается путем индуцирования воспаления брюшины и фиброза с использованием инъекций липополисахарида. По сути, в данной работе описан усовершенствованный метод создания экспериментальной модели ПДн.

Введение

Бремя терминальной стадии почечной недостаточности
Хроническая болезнь почек (ХБП) является всемирной проблемой здравоохранения¹. Текущие оценки показывают, что более 850 миллионов человек во всем мире имеют заболевания почек. Распространенность заболеваний почек почти удваивает число людей с диабетом (422 миллиона) и более чем в 20 раз превышает распространенность рака (42 миллиона) или ВИЧ / СПИДа (36,7 миллиона) во всем мире². Примерно каждый седьмой американец имеет ХБП, а двое из 1000 американцев имеют ESKD, требующий пересадки почки или поддержки диализа³. Учитывая растущее бремя ESKD во всем мире, оптимизация технологии диализа имеет решающее значение³.

Перитонеальный диализ
БП является значительно недоиспользуемым методом лечения ESKD в Соединенных Штатах. По данным Системы почечных данных США (USRDS), процент распространенных пациентов с БП составил всего 11% в 2020^{году 4,5}. БП дает несколько преимуществ по сравнению с гемодиализом в центре (БГ), включая лучшее качество жизни, меньшее количество посещений клиники и снижение расходов на Medicare ^6,7. Кроме того, БП является домашней терапией и связана с гораздо более низким риском тяжелых инфекций, таких как бактериемия и эндокардит, которые часто связаны с катетерами гемодиализа. Кроме того, БП может быть быстро инициирована с протоколом срочного запуска, уменьшая необходимость начала диализа с помощью внутренних сосудистых катетеров⁸. БП считается предпочтительным методом диализа в педиатрической популяции ESKD⁹.

Нарушение брюшины, вызванное перитонеальным диализом
БП влечет за собой введение жидкости БП (диализата) в брюшину, что приводит к воспалению и ремоделированию перитонеальной мембраны с течением времени. Воспаление брюшины вызывает фиброз, кульминацией которого является потенциальная потеря ультрафильтрационных возможностей мембраны с течением времени. Сохранение перитонеальной мембраны является серьезной проблемой при БП, и дальнейшие исследования критически важны для обеспечения того, чтобы лучшие клинические практики были доступны для практикующих врачей. Существуют хорошо зарекомендовавшие себя мышиные модели, помогающие углубить понимание патофизиологических механизмов перитонеальной инфекции и воспаления, растворенного вещества, кинетики транспорта воды и мембранной недостаточности; Тем не менее, технические проблемы с катетером часто ограничивают эти модели¹⁰.

Анализ изменений перитонеальной мембраны
У пациентов с ESKD диализат традиционно вводится в брюшинную полость через катетер Tenkhoff с глубокой и поверхностной манжетой. Пациенты могут потенциально испытывать осложнения, связанные с катетером, включая миграцию катетера, боль при инфузии и плохой дренаж диализата 11,12,13. Два основных типа перитонеальных катетеров были введены для людей, спиральные или прямые, чтобы свести к минимуму эти осложнения¹². Несколько модификаций, включая дополнительную манжету к обычным катетерам с двумя манжетами, были добавлены к оригинальным катетерам для продления выживаемости катетера^{PD 11}. Метод введения варьируется в зависимости от нескольких факторов, предотвращая миграцию катетера, которая должна быть добавлена после выживания, включая доступность ресурсов и уровень знаний¹⁴.

Напротив, мышиные модели перитонеального диализа имеют фундаментальные различия в методах и назначении по сравнению с перитонеальными катетерами человека. Например, перитонеальные катетеры в мышиных моделях используются в основном для изучения изменений мембран и в меньшей степени предназначены для двунаправленных дренажных функций. Современный метод страдает от потенциального смещения порта и миграции катетера из-за обращения с животными. В обычных мышиных моделях порты доступа не были закреплены на коже. Этот аспект создал нестабильный порт доступа, который у бодрствующих животных может быть смещен, что приведет к миграции катетера. Учитывая важность мышиных моделей в исследованиях перитонеальной мембраны, крайне важно создать эффективные хирургические методы для создания надежных моделей. Поэтому мы поставили перед собой задачу оптимизировать традиционную модель размещения катетера БП. Важно отметить, что сам катетер вызывает гистопатологические изменения в перитонеальной мембране, и, таким образом, любые выводы относительно влияния растворов БП в исследованиях на животных должны интерпретироваться в контексте катетера БП как инородное тело 15,16,17.

Гистопатология перитонеальной мембраны
Недостаточность БП в основном связана с фиброзом и избыточным ангиогенезом, что приводит к потере осмолярного градиента концентрации. Кроме того, на способность фильтрации перитонеальной мембраны может влиять перитонит. Кроме того, инфекционный перитонит является хорошо известной причиной изменения модальности диализа от перитонеального диализа к гемодиализу. ^18.

протокол

Для этого исследования использовались восемь самок мышей C57BL/6J, возрастом 8-12 недель и средним весом 20 г. Мыши содержались в стандартных условиях и питались чау-чау и водой ad libitum. Это исследование было выполнено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC), Медицинского центра Бостонского университета (AN-1549). Описанные здесь процедуры выполнялись в стерильных условиях.

1. Обезболить мышь в изофлурановой камере и ввести анальгетик подкожно

1. Держите животное от основания хвоста. Держите животное на спинной поверхности недоминирующей руки.
2. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного анестетика, заполненную 3%-4% изофлураном. Подтвердить адекватную общую анестезию при отсутствии рефлекса защемления пальцев ног в правой и левой задних конечностях. Сохраняют поддержание общей анестезии с изофлураном 1%-3%.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза.
4. Вводят подкожную инъекцию Бупренорфина.
   1. Растворить запас бупренорфина в концентрации 0,3 мг/мл в хлориде натрия (NaCl) 0,9% до достижения конечной концентрации 0,03 мг/мл.
   2. Вводят в дозе 0,05-0,1 мг/кг 0,03 мг/мл бупренорфина вместе с 500 мкл стерильного NaCl 0,9%, за 20 мин до операции у 20 г мыши (2 мкг или 66 мкл 0,03 мг/мл бупренорфина на мышь).

2. Подготовка кожи

1. Поместите полностью обезболенную мышь в левое боковое положение, обнажив ее правый фланг от нагревательного одеяла. Побрейте правую сторону брюшка, как раз близко к средней линии к параспинальной области и вниз к хвосту животного.
2. Продезинфицируйте выбритый участок три раза с помощью ватного тампона с альтернативным нанесением антисептического раствора или скраба и либо 70% спирта, либо стерильного физиологического раствора круговыми движениями, начиная с места хирургического разреза и двигаясь наружу. Выбрасывайте ватный тампон после каждого использования. Будьте осторожны, чтобы чрезмерно не смочить нехирургические участки животного алкоголем или антисептиком, так как это может ухудшить переохлаждение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно правильно разбавлять антисептические растворы и не оставлять хирургические скрабы на коже во время операции, так как они могут раздражать и должны быть смыты. Часто проверяйте температуру нагревательного одеяла во время процедуры, чтобы убедиться, что температура не падает.

3. Измерьте длину катетера и отметьте точку введения в брюшной полости и трубчатом тракте над подготовленной кожей

1. Назначьте карман порта доступа на 1 см выше хвоста животного. Удерживайте сегмент установки недоминирующим указательным и большим пальцами над назначенной областью возле хвоста.
2. Поместите катетер над кожей и оцените место для введения трубки катетера в брюшной полости. Отметьте назначенное место для вставки трубки, соблюдая минимальный изгиб трубки вблизи передней средней линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных перчатках, а катетер должен быть стерильным во время измерения. Хирургические инструменты должны быть автоклавированы при 121 °C перед использованием. Инструменты, необходимые для процедуры, приведены в дополнительном рисунке S1 .

4. Настройте секцию резервуара перитонеального катетера

1. Проткните боковое отверстие над рамой секции резервуара с помощью мышиного ушного бирки (рисунок 1 и рисунок 2). Следует отметить, что ушной перфоратор является хирургическим инструментом, и он должен быть стерильным.

5. Разместите порт инстилляции

1. Сделайте горизонтальный разрез кожи шириной 1 см на 1 см выше хвоста. Грубо рассекните подкожную плоскость от нижележащего мышечного слоя, чтобы сделать мешочек для размещения катетера, чтобы обеспечить свободное нахождение порта инстилляции в идеальном кармане порта.
2. Держите кончик ножниц радужной оболочки к средней линии, чтобы сделать наклонный туннель для размещения трубы (рисунок 3A).
3. Пройдите шов 3.0 от настроенного бокового отверстия. Закрепите входное отверстие к мышечному ложу, затянув пройденный шов, сохранив ход трубки цефаладой.

6. Сделайте разрез в месте введения наконечника катетера

1. Сделайте разрез 1 см над ранее отмеченной областью около средней линии. Подтвердите хорошо развитый тракт, проведя ножницы через тракт.
2. Осторожно подберите наконечник катетера щипцами, чтобы поместить катетер в ретроградный курс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте защемления боковых отверстий трубки.
3. Пропустите катетерную трубку через подготовленный тракт (рисунок 3В). Сделайте разрез 1 см над мышечным слоем близко к правой средней линии.

7. Подтвердите функционирование катетера

1. Прежде чем закрыть все разрезы, убедитесь, что установленный катетер функционирует. Проверьте функцию с помощью шприца объемом 1 мл, прикрепленного к конкретной игле Huber для порта.
2. Введите 200 мкл нормального физиологического раствора в инстилляционный порт. Ищите плавный поток с нулевой терпимостью к сопротивлению.
3. Промывайте порт и катетер 10% гепарином для поддержания проходимости.

8. Закройте разрезы кожи

1. Закройте разрезы кожи вокруг резервуара порта (рисунок 3С) 3-0 рассасывающимися швами.

9. Зафиксируйте кончик катетера внутри брюшной полости

1. Наложите свободный шов из кошелька с 4-0 круглым рассасывающимся швом вокруг разрезанной мышцы брюшной стенки. Пройдите проксимальный войлок катетера внутрь разреза.
2. Затяните подготовленный шов вокруг трубки, удерживая второй войлок вне нити кошелька, над мышечным слоем (рисунок 3D), и закройте кожу 3-0 рассасывающимися швами (рисунок 2).

10. Следите за животными после операции и ежедневно, вводите послеоперационную анальгезию и жидкости, а также ведите ежедневные послеоперационные записи в течение как минимум 7 дней и до полного выздоровления

1. Поддерживайте работоспособность катетера с ежедневной инъекцией 200 мкл нормального физиологического раствора через катетер.

11. Инъекции жидкости

1. Подтвердите беззаботный постпроцедурный процесс, тщательно осмотрев разрез кожи.
2. Готовят ЛПС 2 мг/кг массы тела для внутрибрюшинных инъекций (т..) путем разбавления 40 мкг ЛПС стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (ПБС) до рабочей концентрации 0,2 мкг/мкл (по существу, 10 мкл на 2 мкг/г массы тела и 200 мкл ЛПС на 20 г мышей).
3. Начните инъекции на второй неделе после имплантации катетера.
   1. Осторожно держите животное недоминирующей рукой и удерживайте инстилляционный порт, двигая указательным и большим пальцами в направлении цефалады.
   2. Продезинфицируйте кожу, покрывающую резервуар, 70% изопропиловым спиртом. Используйте шприц, прикрепленный к игле Huber, чтобы ввести LPS.
      1. После входа в порт с помощью иглы Хубера введите 100 мкл нормального физиологического раствора в порт для подтверждения патентного курса.
      2. Введите приготовленные 200 мкл LPS, а затем 100 мкл нормального физиологического раствора для орошения труб и убедитесь, что нет сопротивления.

12. Обезболить мышей перед сбором брюшины и собрать брюшную жидкость

1. После 7 дней инъекций ЛПС и 2 недель имплантации катетера запланируйте биопсию брюшины.
2. План общей анестезии.
   1. Обезболивают мышь в изофлурановой камере и вводят анальгетик подкожно.
   2. Держите животное от основания хвоста, и держите животное на спинной поверхности руки.
   3. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного анестетика, заполненную 3%-4% изофлураном. Подтвердить адекватную общую анестезию при отсутствии рефлекса защемления пальцев ног в правой и левой задних конечностях. Поддерживают поддержание общей анестезии изофлураном 1%-3%.

13. Биопсия брюшины

1. Положите животное на нагретое одеяло в лежачем положении. Сделайте разрез кожи по средней линии от субофоидного до мочевого пузыря.
2. Перфьюзируйте субфасциальную плоскость холодным PBS (рисунок 3E).
3. Убедитесь, что плоскость полностью рассечена, не нарушая целостности брюшины. Начните рассечение брюшины от бокового перитонеального отражения в левом нижнем квадранте, начиная с хилума до левого фланга, и мочевого пузыря в нижнем аспекте, чтобы сохранить образцы согласованными между животными (рисунок 3F).
4. После сбора урожая брюшины усыпляют животное путем вывиха шейки матки.

Результаты

Все имплантированные катетеры функционировали до конца исследования, и смещение катетера или перегиб не усложняли ни один из имплантированных катетеров. Текущий, модифицированный метод был дополнительно подтвержден с помощью модели, вызванной перитонитом, с использованием LPS. Контро...

Обсуждение

Описаны три мышиные модели БП. Это включает в себя слепой прокол поверхности брюшины, открыто-постоянную систему и закрытую систему¹⁰. Слепой прокол перитонеальной поверхности предполагает прямой перитонеальный доступ, аналогичный внутрибрюшинным инъекциям, но не позвол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% heparin	Canada Inc., Boucherville, QC, Canada)	Pharmaceutical product
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
CD31	Abcam	Ab9498
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools	11282-11
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch	Fisher Scientific	13-812-201
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Huber point needle	Access  technologies	PG25-500	Needle for injections
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Lipopolysaccharide from E.coli	SIGMA	L4391
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes	Access  technologies	MMP-4S-061108A
Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´	Access  technologies	PG25-500
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Vicryl Suture	AD-Surgical	#L-G330R24