Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Özet

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Özet

Düz kas hücreleri (SMC), sırasıyla hava akımı direncini ve pulmoner dolaşımı değiştirmek için hava yolunun ve intrapulmoner arterin kasılmasına aracılık eder, bu nedenle pulmoner sistemin homeostazında kritik bir rol oynar. SMC kontraktilitesinin deregülasyonu, astım ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sınırlı doku erişimi ve in vivo SMC fenotiplerini korumak için kültür sistemlerinin eksikliği nedeniyle, bu hastalıklarda deregüle SMC kontraktilitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak tanımlanmaya devam etmektedir. Hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), bu teknik zorlukları ortadan kaldıran bir ex vivo model sunar. Canlı, ince bir akciğer dokusu kesiti olarak PCLS, SMC'yi doğal ortamda tutar ve SMC kontraktilitesini düzenleyen SMC kontraksiyonunun ve hücre içi Ca²⁺ sinyallemesinin yerinde izlenmesini sağlar. Burada, sağlam hava yollarını ve intrapulmoner arterleri koruyan ayrıntılı bir fare PCLS hazırlama protokolü sağlanmaktadır. Bu protokol, akciğer lobunu dilimlemeye maruz bırakmadan önce iki temel adımı içerir: trakeadan düşük erime noktalı agaroz ile hava yolunu şişirmek ve pulmoner damarları sağ ventrikülden jelatin ile doldurmak. Bu protokol kullanılarak hazırlanan PCLS, hem hava yolu hem de intrapulmoner arteriyel kompartmanlarda SMC'nin Ca^{2 +} aracılı kontraktil regülasyonunu değerlendirmek için biyotahliller için kullanılabilir. Solunum yolu hastalıklarının fare modellerine uygulandığında, bu protokol SMC'nin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlar, böylece hastalıklarda SMC kontraktilitesi deregülasyonunun altında yatan mekanizma hakkında fikir verir.

Giriş

Düz kas hücresi (SMC), öncelikle hava yollarının ve pulmoner damarların medya duvarında bulunan, akciğerde önemli bir yapısal hücre tipidir. SMC'ler luminal kalibreyi değiştirmek için büzülür, böylece hava ve kan akışını düzenler ^1,2. Bu nedenle, SMC'lerin kontraktil regülasyonu, hava ventilasyonu ve pulmoner dolaşımın homeostazını korumak için esastır. Buna karşılık, anormal SMC kontraktilitesi obstrüktif hava yolunu veya astım ve pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkları tetikler. Bununla birlikte, akciğer SMC'lerinin fonksiyonel değerlendirmesi, akciğer dokusuna, özellikle de akciğerin distal kısmındaki küçük hava yollarına ve mikrodamarlara sınırlı erişim nedeniyle zorlanmıştır ^2,3. Mevcut çözümler, hava yolu daralmasını yansıtmak için Flexivent ile hava akımı direncini ölçmek ve pulmoner vazokontraksiyonu değerlendirmek için sağ kalp kateterizasyonu ile pulmoner arteriyel kan basıncını kontrol etmek gibi dolaylı testlere başvurmaktadır ^4,5. Bununla birlikte, bu dolaylı tahlillerin, yapısal faktörler tarafından karıştırılması, tüm akciğer skalası ^6,7'deki hava yolunun veya vasküler yanıtların mekansal çeşitliliğini yakalayamaması ve hücresel düzeyde kontraktil regülasyonun mekanik çalışması için uygun olmaması gibi birçok dezavantajı vardır. Bu nedenle, SMC çalışması için in vitro olarak izole primer hücreler, trakea/bronş kas şeritleri ^8,9 veya büyük vasküler^{segmentler 10} kullanılarak alternatif yaklaşımlar uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır. Örneğin,^11,12 kültür koşulundaki primer SMC'lerin hızlı bir fenotipik adaptasyonu, bulguları hücre kültüründen in vivo ortamlara tahmin etmeyi sorunlu hale getirmektedir. Ek olarak, izole proksimal hava yolu veya vasküler segmentlerdeki SMC'lerin kontraktil fenotipi, distal akciğer ^6,7'deki SMC'leri temsil etmeyebilir. Dahası, doku seviyesindeki kas kuvveti ölçümü, kasılma regülasyonuna mekanik bakış açısı için gerekli olan moleküler ve hücresel olaylardan ayrışmış olarak kalır.

Canlı bir akciğer dokusu kesiti olan hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), pulmoner SMC'leri yakın in vivo mikro ortamda (yani, korunmuş çok hücreli mimari ve etkileşim) karakterize etmek için ideal bir ex vivo araç ^sağlar13. Dr. Placke ve Fisher, 1980'lerde agarozla şişirilmiş sıçan ve hamster akciğerlerinden akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ilk kez^14,15'te tanıttığından beri, bu teknik^, PCLS'lere biyomedikal araştırmalar için daha yüksek kalite ve çok yönlülük sağlamak için sürekli olarak geliştirilmiştir. Önemli bir gelişme, trakea yoluyla agarozlu akciğer enflasyonuna ek olarak, jelatin infüzyonu ile pulmoner arteriyel korumanın arttırılmasıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirme¹⁶ için PCLS'de hem hava yolu hem de pulmoner arterler sağlam tutulur. Ayrıca, PCLS kültürde uzun süre uygulanabilir. Örneğin, fare PCLS'lerinin kültürde en az 12 gün boyunca hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli bir değişiklik olmadı ve ayrıca 7 güne kadar hava yolu kontraktilitesini korudular¹⁷. Ek olarak, PCLS kasılma ve gevşeme tahlilleri için farklı boyutlarda hava yolları veya damarlar tutar. Ayrıca, hücre kontraktilitesinin belirleyici faktörü olan SMC'lerin hücre içi Ca²⁺ sinyalizasyonu, bir konfokal veya 2-foton mikroskobu¹³ tarafından görüntülenen Ca 2⁺ muhabir boyaları ile test edilebilir.

Fare modelinin akciğer araştırmalarında kapsamlı bir şekilde uygulanması göz önüne alındığında, burada ex vivo akciğer araştırması için sağlam hava yolları ve intrapulmoner arterlere sahip fare PCL'lerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Hazırlanan PCLS'leri kullanarak, konstrüktif veya gevşetici uyaranlara karşı hava yolu ve pulmoner arteriyel yanıtların nasıl değerlendirileceğini gösterdik. Ek olarak, PCLS'yi Ca 2+ muhabir boyası ile yükleme ve daha sonra kasılma veya gevşetici yanıtlarla ilişkili SMC'lerin Ca²⁺ sinyallemesini görüntüleme yöntemi de tanımlanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan bakımı, Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundu. Bu çalışmada 8 haftalık vahşi tip C57/B6 erkek fareler kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

1. Çalışma çözümünü hazırlayın.
   1. 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (HBSS, Ca 2+ ve Mg 2⁺ ile ve pH²⁰ mM HEPES ile dengelenmiştir, Malzeme Tablosuna bakınız). PCLS'yi hazırlamak ve işlemek için HBSS çözümünü kullanın. PCLS'leri hazırlarken HBSS solüsyonunu buz üzerinde soğuk tutun.
2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve F-12'yi (DMEM-F12) bir antibiyotik-antimikotik ajanla destekleyerek PCLS'nin kültür ortamını hazırlayın (1:100 hacim oranı, bakınız Malzeme Tablosu).
3. % 1.5 agaroz ve% 6 jelatin çözeltisi hazırlayın.
   1. Düşük erime noktalı (LMP) agaroz veya jelatin tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) HBSS çözeltisi ile ayrı ayrı 15 mL steril santrifüj tüplerinde (veya çözelti hacmi >10 mL) 50 mL tüplerde) nihai konsantrasyonlara karıştırın.
      NOT: Agaloz çözeltisinin toplam hacmi = 5 mL/fare x fare sayısı; jelatin çözeltisi = 2 mL / fare x fare sayısı.
   2. Çözelti tüplerini, toz tamamen çözünene kadar kaynar suda ısıtın. Hem agaroz hem de jelatin çözeltilerini 42 °C su banyosunda tutun.
      NOT: Diseksiyon masasındaki bir ısıtma lambası, çalışma ortamını sıcak tutmak ve agaroz çözeltisinin fare akciğerine enjekte edilmeden önce katılaşmasını önlemek için yararlı olabilir.
4. Bir çift diseksiyon makas, iki çift kavisli mikro diseksiyon forseps ve bir çift hemostatik forseps dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletlerini, sterilizasyon için en az 20 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisine batırın.
5. Akciğer dokusunu ince dilimler halinde bölmek için bir vibratomu hazır tutun (bkz.
6. Hava yolu veya vasküler kontraktil yanıtları değerlendirmek için CCD kameralı ters faz kontrastlı bir mikroskop ve pulmoner SMC'lerde Ca ²⁺ sinyallemesini değerlendirmek için özel yapım bir lazer taramalı konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) bulundurun¹⁸.

2. Fare akciğerlerinin agaroz ve jelatin çözeltisi ile şişirilmesi

1. Fareyi ötenazileştirin.
   1. Fareyi% 5 izofluran içeren plastik bir odaya (yaklaşık 750^cm3) yerleştirin. Fareyi en az 1 dakika boyunca nefes almayı bırakana kadar odada tutun.
      NOT: İntraperitoneal ketamin (240 mg/Kg) ve ksilazin (32 mg/Kg)¹⁹ veya pentobarbital (0.3 mL)²⁰ enjeksiyonu gibi diğer primer ötenazi yöntemleri, inhale izoflurana alternatif olarak uygulanabilir.
   2. Fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25 G şırınga iğneleriyle sabitleyerek vücudu yerinde sabitleyin ve% 70 etanol spreyi ile vücudu sterilize edin.
   3. Farenin karnını cerrahi makasla kesin (kesi, ~2 cm uzunluğunda x 2 cm genişliğinde). Ardından, kan hacmini tüketmek için abdominal aortu kesin.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek akciğer loblarını şişirin.
   1. Göğüs boşluğunu diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın ve göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin.
   2. Kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın. Keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa işaret ederek akciğer hasarından kaçının.
   3. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki timus ve yumuşak dokuyu ayırmak için forseps kullanın.
   4. Trakeanın üst ucunda, 20 G Y şeklinde bir IV kateterin ucunun geçişine izin veren küçük bir delik (1,2 mm çapında) kesin (bkz.
   5. Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mL hava ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya ve diğer portu 2 mL sıcak% 1,5 agaroz çözeltisi (42 ° C) ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
   6. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri önceden kesilmiş açıklıktan 5-8 mm uzunluğunda trakeaya itin.
   7. Agaroz çözeltisini yavaşça yaklaşık 1 mL / 5 s'de enjekte edin. Akciğer, proksimal-distal eksen boyunca genişleyecektir. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun.
      NOT: Akciğeri aşırı şişirmeyin, çünkü bu onu yırtabilir. Genç yetişkin bir farenin tüm akciğerini şişirmek için agaroz çözeltisinin hacmi yaklaşık 1.3 ± 0.1 mL'dir.
   8. Kateterdeki ve iletken hava yollarındaki artık agarozu distal alveol boşluğuna itmek için diğer şırıngadan 0.2-0.3 mL hava enjekte edin.
   9. Klipsle trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapatın (bkz.
3. Pulmoner vaskülatürü doldurun.
   1. 1 mL'lik bir şırıngayı ılık% 6 jelatin ile doldurun. Bir iğne derisi damar kateterine bağlayın, kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın delin.
   2. İğneyi 2-3 mm uzunluğunda sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun.
   3. 0.2 mL jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin.
      NOT: Akciğer lobları uygun jelatin şişirmesi ile biraz daha solgun görünür.
   4. İğneyi enjeksiyondan sonra 5 dakika yerinde tutun, kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun, ardından vücudu diseksiyon tahtası ile 4 ° C'lik bir buzdolabına veya toplam 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   5. Fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın.

3. Akciğer loblarının ince dilimlere ayrılması

1. Numune kolonunun üstündeki akciğer lobunu süper yapıştırıcı ile kesin ve takın ve kesme yönünün hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olmasını sağlamak için lobu (Şekil 1A, B) yönlendirin.
2. Akciğer lobunu 150 μm dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş 100 mm steril Petri kaplarında toplayın.
   NOT: Dilimlemeye başlamadan önce uygun bıçak hareket hızını ve salınım frekansını ayarlayın. Bir Compresstom için tipik bir ayar Hız seviyesi 4 ve Salınım seviyesi 4'tür.
3. Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı (20 dilim/15 mL orta/çanak) ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve deneylerden önce gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.
   NOT: Fare PCLS'leri hava yolu kontraktil yanıtlarını kaybetmeden yaklaşık 7 gün boyunca kültürde tutulabilir¹⁷. Pulmoner arterlerin ömrü tam olarak değerlendirilmemiştir. Gözlemlerimizde, DMEM / F12 ortamında en az 3 gün boyunca sağlam yapı ve vazoreaksiyonu korurlar. Uzun süreli depolama için, fare PCLS'leri% 10 DMSO (şişe başına 1 mL ortamda 5 dilim) içeren DMEM / F12 ortamı ile doldurulmuş kriyovyallere yerleştirilebilir, gece boyunca -80 ° C'de izopropil alkol dolu bir kapta dondurulabilir ve haftalarca^{ila 21}. aylar boyunca sıvı azotta kriyo-korunabilir.

4. İntrapulmoner hava yolları ve arterlerin kontraktil yanıtlarının analizi

1. PCLS'leri HBSS dolgulu 24 delikli bir kültür plakasına, her bir kuyucuğa bir tane yerleştirin. PCLS'yi kuyunun ortasına yerleştirin, ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın.
2. Mikroskop altındaki dilimde hedef hava yolunu ve kabı bulun, ardından hedef alanı ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe (2-3 mm çapında) sahip naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün.
3. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üzerine içi boş bir metal yıkayıcı yerleştirin (Şekil 2A).
4. PCLS'yi suya batırmak için 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin. Dilimi 10 dakika dinlendirin, ardından hava yollarının veya gemilerin temel görüntülerini kaydedin.
5. Boş HBSS solüsyonunu bir pipetle dikkatli bir şekilde emerek ve 1 μM metakolin (MCh) veya 10 nM endotelin gibi bir agonistle 600 μL HBSS ekleyerek hava yolunu veya vasküler kontraksiyonu indükleyin (bkz.
   NOT: Alet seti standardı olarak KCl stimülasyonu, metakolin veya endotel maruziyetinden önce gerekli değildir. Fare hava yollarında 100 mM KCl stimülasyonu sadece küçük ve düzensiz bir hava yolu kasılmasına neden olur (%10-%15)²⁰. Benzer şekilde, aynı agonistin, örneğin metakolin veya serotoninin, ilk ve tekrarlayan maruziyetlerde benzer hava yolu kasılmasını tetiklediğini doğruladığımız için bir astarlama metakolin stimülasyonu zorunlu değildir^20,22.
6. Luminal alan değişimi dengeleyici bir duruma ulaşana kadar mikroskop altında reaksiyonu gözlemleyin ve ardından analiz için hava yolunu veya vasküler görüntüleri kaydedin.
7. MCh veya endotelin solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve aynı agonist konsantrasyonuna ve gevşeticiye sahip yeni bir 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin; hava yolunu veya vasküler gevşemeyi gözlemleyin ve kaydedin.
8. Aşağıdaki adımları izleyerek hava yolunu veya vasküler reaksiyonu ölçün.
   1. Görüntüleri NIH sponsorluğundaki özgür yazılım FIJI'ye yükleyin.
   2. Her çerçevedeki hava yolunu veya vasküler lümeni ana hatlarıyla belirtmek için araç çubuğunda Poligon Seçimi'ni seçin.
   3. Analiz Et > Ölçümleri > Ayarla'yı seçin.
   4. İlgi alanını ölçmek için Analiz > Ölçü'yü seçin. Sonuçlar istatistiksel analiz için ayrı bir pencerede gösterilir.

5. Hava yolu veya vasküler SMC'lerin Ca²⁺ sinyalizasyonunun analizi

1. Ca²⁺ boya yükleme tamponunu hazırlayın.
   1. Ca²⁺ boya, Oregon Green 488 BAPTA-1-( Malzeme Tablosuna bakınız), 50 μg (bir şişe) 10 μL DMSO ile çözün.
   2. % 20'lik bir Pluronik çözelti oluşturmak için 0.2 g Pluronik F-12 tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL DMSO'da çözün.
   3. 10 μL% 20 Pluronik çözeltiyi, 10 μL Ca²⁺ boya-DMSO çözeltisi ile karıştırın.
   4. ²⁰⁰ μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine 20 μL karışım ekleyerek Ca 2+ boya yükleme tamponu yapın (bkz.
2. 2 mL Ca 2⁺ yükleme tamponuna 15 fare PCL'si yerleştirin ve 1 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Daha sonra dilimleri, oda sıcaklığında floresan boya deesterifikasyonu için 30 dakika daha 100 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine taşıyın.
3. SMC'lerin Ca²⁺ sinyalizasyonunu tespit edin.
   1. Ca²⁺ boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin.
   2. 3 mL'lik bir şırıngayı yüksek vakumlu silikon gres ile doldurun. Gresi 18 G körelmiş bir iğneden sıkarak dilimin üstündeki ve altındaki kapak camı boyunca iki paralel çizgi çizin.
   3. İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Yanlarda gresle kapatılmış bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Naylon ağ, dilimi alt kapak kaymasına bağlı tutmak ve böylece 40x yağ gibi yüksek büyüklükte ters çevrilmiş bir hedefin çalışma mesafesinde kalmak için gereklidir.
   4. HBSS veya agonist solüsyonunu manuel olarak veya bir perfüzyon sistemi aracılığıyla pipetleme yaparak bir ucundan hazneye ekleyin. Sürekli sıvı perfüzyonu durumunda diğer ucundan kağıt mendil veya vakum ile emerek sıvıyı odadan çıkarın.
   5. PCLS odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. SMC^23'ün Ca²⁺ sinyalini, 15 veya 30 görüntü/sn lazer tarama hızına sahip özel yapım rezonans taramalı konfokal mikroskopla algılayın.
      NOT: Alternatif olarak, şu anda yaygın olarak bulunan yüksek hızlı bir ticari lazer taramalı konfokal mikroskop, PCLS'deki pulmoner SMC'lerin Ca²⁺ sinyal tahlilinde uygulanabilir.
4. SMC'lerde Ca²⁺ floresansını ölçün.
   1. Kaydedilen görüntü dizisini FIJI'ye yükleyin ve 8 bit gri tonlamalı Görüntü > Türü>nü seçin.
   2. Araç çubuğunda Dikdörtgen Seçimi'ni seçin ve düz bir kas hücresinde 5 piksel x 5 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
   3. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla > Ca ²⁺ floresan yoğunluğunu temsil eden Ortalama gri değer'i seçin.
   4. Bir yatırım getirisinin konumu SMC daralmasıyla birlikte değişirse, Ca²⁺ floresan yoğunluğunu kare kare ölç > Analiz Et'i seçin.
   5. SMC'nin yatırım getirisi bir görüntü yığınında benzer bir konumda kalırsa, Görüntü > Yığınları > Ca ²⁺ floresan yoğunluğunun yığınını ölç'ü seçin.
      NOT: Özel olarak yazılmış bir makro, bir görüntü yığınında daralma ile hareket ettiğinde SMC içindeki YG'yi izlemek için takılabilir ve YG'nin Ca²⁺ yoğunluğunu (gri değer) kare kare otomatik olarak ölçer.

Sonuçlar

Bozulmamış intrapulmoner hava yollarını ve arterleri koruyan fare PCLS preparatı
Ters faz kontrast mikroskobu altında 150 μm kalınlığında bir PCLS gözlendi. Fare akciğerlerinde, iletken hava yollarına, hilustan periferik akciğere uzanan intrapulmoner arterler eşlik eder. Bir fare PCLS'sinde temsili bir pulmoner hava yolu-arter demeti Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu, lümenin iç yüzeyini kaplayan aktif siliyal atımlı küboidal epitel hücreleri...

Tartışmalar

PCLS'nin hazırlanması birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, doku sertliğinin düzensiz agaroz dağılımından değişmesini önlemek için akciğer lobunu homojen olarak şişirmek esastır. Sıvı agaroz, 37 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta ince kateterlerde veya hava yollarında hızla jelleştikçe, distal akciğer alanında ortaya çıkan dolgu defekti, akciğer dokusu sertliğinin eşitsizliğini artırabilir ve vibratom kesiti sırasında doku yırtılmasına neden olabilir. Bu nedenle, düşük erim...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter