בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

Abstract

הפיתוח וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה (AR) באמצעות מיקרוביוטה הקשורה לגופי מים מתוקים הוא דאגה בריאותית עולמית מרכזית. במחקר הנוכחי, דגימות מים מתוקים נאספו ונותחו ביחס למגוון החיידקים הכולל ולגנים של AR (ARGs) תוך שימוש הן בטכניקות קונבנציונליות מבוססות תרבית והן בגישה מטגנומית בלתי תלויה בתרבית בתפוקה גבוהה. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לספירה של החיידקים הכוללים והעמידים לאנטיביוטיקה מדגימות מים מתוקים ולקביעת עמידות פנוטיפית וגנוטיפית במבודדים הניתנים לתרבות. יתר על כן, אנו מדווחים על שימוש באנליזה מטא-גנומית שלמה של סך הדנ"א המטגנומי המופק מדגימת המים המתוקים לצורך זיהוי מגוון החיידקים הכולל, כולל חיידקים שאינם ניתנים לתרבות, וזיהוי המאגר הכולל של ARGs שונים (התנגדות) בגוף המים. בעקבות הפרוטוקולים המפורטים האלה, ראינו עומס חיידקים גבוה עמיד לאנטיביוטיקה בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 10⁹ CFU/mL. רוב המבודדים היו עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצה שנבדקה, כולל cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, ו ciprofloxacin, עם מספר אינדקסים של עמידות לאנטיביוטיקה (MAR) של ≥0.2, מה שמעיד על רמות גבוהות של עמידות בבידודים. ריצוף 16S rRNA זיהה פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, כגון דלקת ריאות קלבסיאלה, וחיידקים אופורטוניסטיים, כגון Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., ו- Aeromonas spp. האפיון המולקולרי של המבודדים הראה נוכחות של ARGs שונים, כגון blaTEM, blaCTX-M (β-לקטאמים), aadA, aac (6')-Ib (אמינוגליקוזידים) ו-dfr1 (טרימתופרימים), אשר אושרה גם על ידי ניתוח הדנ"א המטגנומי כולו. שכיחות גבוהה של קידוד ARGs אחרים עבור משאבות שטף אנטיביוטיקה-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, הגן כלורמפניקול אצטילטרנספראז catB10, ואת גן עמידות rifampicin rphB-זוהה גם בדנ"א המטגנומי. בעזרת הפרוטוקולים שנדונו במחקר זה, אישרנו את נוכחותם של חיידקי MAR הנישאים במים עם תכונות פנוטיפיות וגנוטיפיות מגוונות של AR. לפיכך, ניתוח דנ"א מטגנומי שלם יכול לשמש כטכניקה משלימה לטכניקות קונבנציונליות המבוססות על תרביות כדי לקבוע את מצב ה-AR הכולל של גוף מים.

Introduction

עמידות מיקרוביאלית (AMR) זוהתה כאחת הבעיות העולמיות הדחופות ביותר. ההתפתחות המהירה של AMR והתפשטותו העולמית הם אחד האיומים הגדולים ביותר על בריאות האדם ועל הכלכלה העולמית במונחים של עלויות הבריאות הכרוכות בו¹. שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה הובילו לעלייה ב-AR. זה הודגש על ידי מגיפת COVID-19, שבמהלכה הטיפול בזיהומים משניים הקשורים, במקרים רבים, נפגע מאוד בגלל AMR בחולים שנפגעו². מלבד השימוש הישיר/שימוש לרעה באנטיביוטיקה על ידי בני אדם, שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בחקלאות ובגידול בעלי חיים והזרמתן הבלתי הולמת לסביבה, כולל גופי מים, הם דאגה מרכזית³. עלייתן של תכונות עמידות חדשות ועמידות רב-ממדית בחיידקים מדגישה בדחיפות את הצורך בהבנה טובה יותר של הגורמים המובילים להתפתחות AR והפצתו. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מרובים, שלעתים קרובות נושאים גנים מרובים של AR (ARGs) על אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, יכולים להעביר את גני העמידות האלה למיקרואורגניזמים שאינם עמידים, כולל פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, ובכך להוביל להופעתם של חיידקי-על שאינם ניתנים לריפוי אפילו עם אנטיביוטיקה של מוצא אחרון⁴. החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה המרובים האלה, אם הם נמצאים במערכות אקולוגיות של מים, יכולים להיכנס ישירות למעי האנושי באמצעות צריכת מזונות מזוהמים על בסיס מים, כגון דגים, סרטנים ורכיכות. מחקרים קודמים הראו כי התפשטות חיידקי AR במערכות מים טבעיות יכולה להגיע גם לאספקת מים אחרת, כולל מי שתייה, ובכך יכולה להיכנס לשרשרת המזון האנושית ^5,6,7.

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול מקיף תוך שימוש בשילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי שלם) כדי לקבל מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים בגוף מים במומבאי, הודו. באופן קונבנציונלי, נעשה שימוש בטכניקות מבוססות תרבית כדי לחקור את מגוון החיידקים בגופי מים. מכיוון שמיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק אחוז קטן מכלל המיקרוביוטה בכל נישה, כדי להבין טוב יותר את המצב הכללי של מגוון החיידקים ואת תכונות העמידות השונות הנפוצות בכל דגימה, יש להשתמש בטכניקות שונות המבוססות על תרבית ובלתי תלויות בתרבית במקביל. טכניקה אחת חזקה ואמינה כזו, שאינה תלויה בתרבות, היא ניתוח דנ"א מטגנומי שלם. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה שימשה בהצלחה במחקרים שונים על מגוון חיידקים או על ביאורים פונקציונליים של ARGs^{שונים 8,9}. טכניקה זו משתמשת במטגנום (החומר הגנטי הכולל בדגימה) כחומר המוצא לניתוחים שונים, ולכן היא בלתי תלויה בתרבית. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי יכולים לשמש לניתוח דנ"א מטגנומי שלם כדי לקבל מידע על מגוון החיידקים הכולל ועל ARGs (התנגדות) שונים בדגימות מים.

Protocol

1. איסוף ועיבוד דגימות

1. איסוף דגימות
   1. אסוף את הנפח המתאים של דגימת המים במיכלי דגימה סטריליים, וודא שלא יותר מ-3/4 מהמיכל ימולא.
   2. להעביר את הדגימות למעבדה בתנאים אספטיים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף ומיד לעבד אותם.
2. עיבוד דוגמאות
   1. מסננים באופן אספטי את דגימת המים דרך בד מוסלין סטרילי כדי להסיר כל חומר חלקיקי.
   2. לבצע דילולים סדרתיים מתאימים של המים המסוננים לניתוח נוסף.

2. הערכה של עומס החיידקים הכולל וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה

1. קביעת העומס החיידקי הכולל
   1. יש להשהות 18.12 גרם של R2A Agar, אבקה מעובדת ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ולהמיס את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 °C, 15 psi במשך 20 דקות. הכן R2A Agar, צלחות מותאמות על ידי מזיגת הכמות המתאימה של תערובת autoclaved לתוך צלחות פטרי סטריליות (למשל, להוסיף כ 20 מ"ל של מדיום סטרילי autoclaved לצלחת פטרי סטרילית 90 מ"מ).
   2. מפזרים באופן שווה 100 μL של דילולים מתאימים של דגימת המים המסוננים על R2A Agar, צלחת שונה ברגע שהמדיום מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
   3. דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות (לשנות את הטמפרטורה ואת זמן הדגירה בהתאם למדיה המשמשת לבידוד).
   4. בטא את העומס החיידקי הכולל במונחים של יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL) באמצעות משוואה (1):
      (1)
2. קביעת ספירת חיידקי AR
   1. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.4. עם זאת, במקום R2A Agar, צלחות מעובדות, השתמש R2A Agar, צלחות מותאמות בתוספת בנפרד עם חמש אנטיביוטיקות שונות, כלומר cefotaxime (3 מיקרוגרם / מ"ל), ciprofloxacin (0.5 מיקרוגרם / מ"ל), אריתרומיצין (20 מיקרוגרם / מ"ל), kanamycin (15 מיקרוגרם / מ"ל) ו vancomycin (3 מיקרוגרם / מ"ל).
   2. הוסף את האנטיביוטיקה בנפרד לתוך צינורות המכילים 20 מ"ל של R2A Agar מותך סטרילי, שונה (עם הטמפרטורה של R2A Agar מותך, שונה ב ≤40 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את הריכוז האנטיביוטי הסופי כאמור בשלב 2.2.1.
   3. מערבלים לערבוב אחיד ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. בצע את הניסוי בכפילות.
   4. דגירה של כל הלוחות הנ"ל ב 35-37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (אם משתמשים במדיה אחרת, הטמפרטורה וזמן הדגירה עשויים להשתנות).
   5. לצורך בקרת איכות ובדיקת יעילות האנטיביוטיקה, יש למרוח 100 μL של תרחיפים חיידקיים של זני Escherichia coli ATCC 25922 ו-Staphylococcus aureus ATCC 29213 על גבי R2A Agar המכילים אנטיביוטיקה בהתאמה, צלחות מותאמות (ודא שצפיפות התרבית הטרייה המשמשת לחיסון היא OD = 0.5 ב-600 ננומטר).
   6. קבע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה במונחים של CFU/mL כמתואר בשלב 2.1.4.
3. מלאי גליצרול של המבודדים
   1. בחר מושבות AR מובחנות מבחינה מורפולוגית.
   2. להשעות מושבה בודדת בודדת ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, אם נבחרה מושבה מתוך צלחת המכילה cefotaxime, לחסן את המושבה משלב 2.3.1 במרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל cefotaxime בריכוזו המתאים).
   3. לדגום את הצינורות המחוסנים ב 37 מעלות צלזיוס ב 80 סל"ד עד OD₆₀₀ מגיע 0.5.
   4. הכינו מלאי גליצרול של המבודדים על ידי ערבוב 750 μL של מתלי התרבית משלב 2.3.3 ל-250 μL של 100% גליצרול סטרילי בתנאים אספטיים.
   5. יש לאחסן את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 80°C- עד לניתוח נוסף.
      הערה: להחייאת התרביות ממניות הגליצרול, הפשירו את מלאי הגליצרול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לחסן לולאה של מלאי זה לתוך 2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני סטרילי המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ולאפשר לגדול.

3. זיהוי חיידקים הניתנים להתרבות על ידי ריצוף גנים 16S rRNA

1. הכנת תבנית דנ"א מהמבודדים ל-PCR
   הערה: הפרוטוקול המתואר להכנת תבנית דנ"א עבור PCR לבידוד דנ"א גולמי מהחיידק ניתן על ידי Carlson et ^al.10.
   1. בעזרת קיסם סטרילי, קחו מושבה אחת, מבודדת וטהורה של המבודד הגדל על צלחת פטרי. להשעות את מושבת החיידקים ב 100 μL של מים סטריליים מזוקקים פעמיים בצינור microcentrifuge סטרילי להרתיח במשך 10 דקות.
   2. צנטריפוגה את המתלים ב 10,000 × גרם למשך 2 דקות כדי לזרוק את הפסולת, ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי טרי לשימוש כתבנית DNA גולמי.
2. הגברה ממוקדת של PCR של אזור V3 בגן 16S rRNA וריצוף
   1. הכן 40 μL של תערובת התגובה בצינור PCR להגברת PCR, כאמור בטבלה 1.
      הערה: הכנת הדנ"א צריכה להתבצע על גוש קרח תוך מזעור הסיכוי לזיהום (ללבוש כפפות בעת הטיפול בריאגנטים, ולנקות את משטח העבודה ביסודיות עם 70% אתנול).
   2. הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR. ראו טבלה 2 עבור תנאי מחזור ה-PCR המתוקננים ומידע הפריימר להגברה של אזורי V3 של הגנים 16S rRNA.
   3. לפתרון אמפליקונים והדמיה, לבצע אלקטרופורזה ג'ל agarose (AGE). יש לערבב 10 μL של מוצר ה-PCR המוגבר ו-2 μL של מאגר העמסת ג'ל 6x (טבלה 3), ולהעמיס תערובת זו לתוך בארות על 1.5% ג'ל אגרוז (להמיס 1.5 גרם של אבקת אגרוז ב-100 מ"ל של 1x TAE buffer [טבלה 3]) המכיל 5 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד (EtBr) לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל EtBr ב-100 מ"ל של ג'ל האגרוז.
      אזהרה: EtBr הוא חומר מסרטן רב עוצמה. יש ללבוש את הכפפות בכל עת בעת הטיפול ב- EtBr ובג'לים המכילים EtBr.
   4. הוסף סולם DNA להערכת גודל האמפליקונים.
   5. בצע אלקטרופורזה של הג'ל בחיץ טנק TAE ב 80-100 V.
   6. לאחר שצבע המעקב פועל 3/4 מהג'ל, עצרו את האלקטרופורזה, ודמיינו את רצועות האמפליקון מתחת לטרנסילומינטור UV.
   7. השתמש במוצר PCR (amplicon) לריצוף גנים 16S rRNA כדי לזהות את המבודד.
   8. כימות האמפליקון על ידי הכפפתו לאנליזה ספקטרופוטומטרית באמצעות משוואה (2).
      (2)
   9. כדי לבדוק את טוהר הדנ"א, חשב את היחס בין A260/A280.
      הערה: באופן אידיאלי, מספר זה צריך להיות מעל 1.5, ועדיף, בין 1.8 ל 2.0.
   10. כדי לזהות את המבודדים, השווה את הרצפים המתקבלים עם מסדי נתונים של רצפים באמצעות כלי חיפוש יישור מתאים.

4. איתור עמידות לאנטיביוטיקה במבודדים באמצעות בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השיטה לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי דיפוזיה של דיסק. נעשה שימוש בדיסקי האנטיביוטיקה הבאים: cefotaxime (5 מיקרוגרם), אמפיצילין (10 מיקרוגרם), לבופלוקסצין (5 מיקרוגרם), כלוראמפניקול (30 מיקרוגרם), טיגציקלין (15 מיקרוגרם), צפטריקסון (30 מיקרוגרם), אימיפנם (10 מיקרוגרם), גנטמיצין (10 מיקרוגרם), נאומיצין (10 מיקרוגרם), טרימתופרים (5 מיקרוגרם) וציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם).

1. הכנת האינוקולום ל- AST
   1. לחסן באופן אספטי מושבת AR יחידה, מבודדת ומטוהרת באמצעות לולאה סטרילית ב-2 מ"ל של מדיום סטרילי לא סלקטיבי, כגון מרק לוריא-ברטני (ללא כל אנטיביוטיקה), ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-80 סל"ד למשך הלילה.
   2. יש להשהות את השימוש ב-100-150 מיקרוליטר של התרבית שגדלה בן לילה (בערך, OD 600 = 1.8-2.0) ב-2 מ"ל של מרק לוריא-ברטני טרי ולא סלקטיבי ולדגור במשך 2-4 שעות (עד שה-OD₆₀₀ מגיע ל-0.4-0.5).
   3. לדלל את מתלה התרבית הטרי הזה באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 0.85% כך שצפיפות התרבית שווה לתקן מקפרלנד 0.5 (בערך, OD₆₀₀ = 0.1), אשר מתאים בערך ל 1-2 × 10⁸ תאים / מ"ל.
   4. ערבבו בעדינות את תרחיף החיידקים לחלוקת תאים אחידה.
   5. השתמש במתלה הנ"ל תוך 15 דקות מרגע הדילול.
2. חיסון צלחות האגר
   1. הכינו צלחות מולר-הינטון אגר (MHA) לביצוע ה-AST על ידי ערבוב 38 גרם של MHA ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, והמיסו את התערובת על ידי חימום. Autoclave את התערובת מומסת ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך 15 דקות.
   2. ודא כי עומק MHA בצלחות הוא 4 מ"מ (25 מ"ל של בינוני לכל צלחת).
   3. במקביל, מוציאים את דיסקיות האנטיביוטיקה מהמקפיא ומחממות אותן לטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להפשיר בהדרגה את הדיסקים האנטיביוטיים על ידי הפשרה ראשונית של הדיסקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומאוחר יותר בטמפרטורת החדר כדי להפחית כל סכנה פוטנציאלית של עיבוי על הדיסקים, אשר עלולה להשפיע לאחר מכן על אזור העיכוב (ZOI).
   4. בתנאים אספטיים, טבלו צמר גפן סטרילי לתוך האינוקולום שהוכן בשלב 4.1, והסירו את עודפי ההשעיה כדי למנוע חיסון יתר של הצלחות.
   5. פזרו את התרבית באופן שווה על הצלחות, החל מהחלק העליון של צלחת ה-MHA והמשיכו קדימה ואחורה מקצה לקצה. סובבו את הצלחת ב-60° תוך כדי התנדנדות.
3. יישום הדיסקים האנטיביוטיים
   1. בעזרת מלקחיים מעוקרים בלהבה, מעבירים באופן אספטי את הדיסקים האנטיביוטיים על לוחות ה-MHA המחוסנים, ולוחצים בעדינות על הדיסקים כדי להבטיח מגע מלא עם האגר.
      הערה: הליך זה צריך להיעשות תוך 15 דקות מחיסון התרבית על הצלחות.
   2. מקם את המספר המתאים של דיסקים אנטיביוטיים על צלחת אגר על ידי התחשבות האורגניזם, האנטיביוטיקה בשימוש, ואת גודל הצלחת כדי למנוע חפיפה של אזורי העיכוב.
      הערה: ניתן לאכלס ארבעה עד חמישה דיסקים על לוח עגול בקוטר 90 מ"מ.
4. דגירה של הצלחות
   1. תוך 15 דקות מיישום הדיסקים האנטיביוטיים, הופכים את הצלחות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. פרשנות התוצאות
   1. מודדים את קוטר ה-ZOI במילימטרים (מ"מ), ומפרשים לפי ערכי נקודת השבירה שניתנו על ידי EUCAST¹¹. ראה את שתי הדוגמאות המובאות להלן.
      1. נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין (5 מיקרוגרם) עבור Enterobacterales היא S ≥ 25 ו- R < 22, כלומר היא נחשבת רגישה (S) אם ZOI ≥ 25 מ"מ, בעוד שהיא עמידה (R) אם ZOI < 22 מ"מ. אם קוטר ה-ZOI נופל בין 22 ל-25, המבודד נחשב לבינוני (I).
      2. נקודת השבירה בקוטר האזור (מ"מ) עבור דיסק אנטיביוטי כלורמפניקול (30 מיקרוגרם) עבור סטפילוקוקוס spp. היא S ≥ 18 ו- R < 18, כלומר היא נחשבת רגישה אם ZOI ≥ 18 מ"מ, בעוד שהיא עמידה אם ZOI < 18 מ"מ.
   2. קבע את מדד עמידות לאנטיביוטיקה מרובה (MAR) על ידי מציאת היחס בין מספר האנטיביוטיקה שאליה עמיד המבודד למספר הכולל של האנטיביוטיקה שאליה נחשף המבודד.
      הערה: עבור בקרת איכות, E. coli ATCC 25922 ו - S. אוראוס ATCC 29213 משמשים כזני ייחוס בהתאם לפרוטוקול כמו בשלב 4.

5. זיהוי מבוסס PCR של גנים עמידים לאנטיביוטיקה במבודדים

1. השתמש בפרוטוקול PCR סטנדרטי לזיהוי ARGs במבודדים. הכן את תבנית הדנ"א באמצעות הפרוטוקול שניתן בשלב 3.1.
   הערה: תנאי מחזור ה-PCR ששימשו במחקר זה היו 94 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, חישול במשך 30 שניות בטמפרטורה המתאימה (כפי שנקבע עבור כל ערכת פריימר), הארכה ב-72 °C למשך 40 שניות, והארכה סופית ב-72 °C למשך 5 דקות. תערובת התגובה מתוארת בטבלה 4. רשימת ה-ARGs, הפריימרים וטמפרטורות החישול מופיעה בטבלה 5.
2. כדי לפתור, לדמיין ולבדוק את טוהר האמפליקונים, בצע את השלבים 3.2.3-3.2.10.

6. ניתוח דנ"א מטגנומי שלם לזיהוי מגוון החיידקים הכולל וזיהוי ARGs במטגנום

1. מיצוי הדנ"א הכולל (מטגנום) מדגימת המים
   1. חלצו את הדנ"א המטגנומי מדגימות המים המסוננים.
      הערה: במחקר הנוכחי, הדנ"א המטגנומי (סך הדנ"א) הופק מדגימות המים המסוננים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א המוזכרת בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת החומרים).
   2. בדוק את איכות הדנ"א על ידי טעינת 3 μL של הדנ"א המטגנומי המופק על ג'ל אגרוז של 0.8%, והפעל את הג'ל ב-80-110 וולט למשך כ-30 דקות.
   3. בדוק את נוכחותה של רצועה שלמה אחת.
   4. בדוק את ריכוז הדנ"א באמצעות פלואורומטר.
2. קביעת מגוון חיידקים וזיהוי ARGs באמצעות ריצוף DNA מטאגנומי שלם
   1. הכנת ספרייה והגברת PCR:
      1. הכינו ספריית ריצוף צמודה באמצעות ערכת ההכנה של ספריית הדנ"א שאליה יש הפניה (ראו טבלת חומרים).
      2. הכן את הדנ"א לקשירת מתאם על ידי לקיחת 200 ננוגרם של דנ"א והטיה מכנית שלו למקטעים קטנים יותר, ולאחר מכן שלב רציף של תיקון קצה שבו "A" מתווסף לקצוות 3 '.
      3. בהתאם לפלטפורמה המשמשת לריצוף, ליגייט מתאמים ספציפיים לשני הקצוות של מקטעי הדנ"א.
         הערה: רצפים חיוניים לקשירת ספריות עם ברקוד כפול לתא זרימה לצורך ריצוף נמצאים במתאמים אלה. זה מאפשר הגברה PCR של שברים קשירה מתאם וקשירת פריימרים ריצוף סטנדרטיים.
      4. כדי לבדוק את האיכות והכמות, נתחו את הספרייה המוגברת באמצעות שבב DNA בעל רגישות גבוהה בהתאם להוראות היצרן.
   2. יצירת אשכולות וריצוף:
      1. טען את הספרייה המוגברת על פלטפורמת הריצוף המתאימה ליצירת אשכולות ולריצוף שלאחר מכן.
         הערה: מולקולות הספרייה נקשרות לאוליגוס המתאם המשלים בתא הזרימה הזוגי. במהלך הרצף, הגדילים הקדמיים נבקעים באופן סלקטיבי לאחר סינתזה מחדש של הגדיל ההפוך. גדיל הפוך מועתק זה מרוצף מהקצה הנגדי של הקטע.
   3. ניתוח ביואינפורמטי:
      1. צור פיגומים מהנתונים האיכותיים באמצעות הפלטפורמה המתאימה.
      2. הכפיף פיגומים אלה לניתוח ביואינפורמטיקה לצורך סיווג טקסונומי וזיהוי של ה- ARGs.
         הערה: תהליך העבודה של כל ניתוח הדנ"א המטגנומי לזיהוי המגוון הכולל של החיידקים ולזיהוי ה-ARGs במטגנום ניתן באיור 1. גיליון זרימה של המתודולוגיה המלאה המתוארת בכתב היד מובא באיור 2.

תוצאות

סך כל עומס החיידקים וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה (AR)
הספירה של עומס החיידקים הכולל בוצעה על ידי פיזור 10−⁴ עד 10⁻⁶ דילולים של דגימות המים על R2A Agar, מדיום שונה. לצורך הספירה של ספירת חיידקי ה-AR, 10−³ עד 10⁻⁶ דילולים של פי 6 הופצו על לוחות מדיה המכילים אנטי...

Discussion

איסוף הדגימות ועיבודן ממלאים תפקיד משמעותי ועשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות של המחקר. לפיכך, כדי לשלול שונות בדגימות, חשוב לבצע דיגום במספר מוקדים של גוף המים המתוקים הנחקרים. שמירה על תנאי סביבה אספטיים נאותים בעת טיפול בדגימות כאלה יכולה למנוע זיהום. יתר על כן, כדי למנוע שינויים בהרכב ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Himedia	MBT049-50LN	For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix	HiMedia	MBT061-50R	For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator	GS-192, Gayatri Scientific	NA	For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer	HiMedia	ML015-1ML	Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder	Himedia	MB229-50G	For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc	HiMedia	SD002	For performing AST
Autoclave	Equitron	NA	Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc	HiMedia	SD295E-5VL	For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder	HiMedia	TC352-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc	HiMedia	SD065	For performing AST
Centrifuge Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc	HiMedia	SD006-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD060-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder	HiMedia	TC447-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter	Quest	NA	For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database			functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator	BTL41 Allied Scientific	NA	For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit	NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NA	Paired-end sequencing library preparation
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus	TechResource	15 cm gel casting tray	For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis
Electrophoresis Power pack with electrodes	Genei	NA	For running the AGE
Erythromycin antibiotic disc	HiMedia	SD222-5VL	For performing AST
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	CMS528-1G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	TC024-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide	HiMedia	MB071-1G	Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer	Qubit 2.0	NA	For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System	BioRad		Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc	HiMedia	SD170-5x50DS	For performing AST
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS119-500ML	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol	HiMedia	GRM1027-500ML	For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc	HiMedia	SD073	For performing AST
Kaiju Database	NA	NA	For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc	HiMedia	SD017-5x50DS	For performing AST
Kanamycin antibiotic powder	HiMedia	MB105-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD216-5VL	For performing AST
Luria Bertani broth	Himedia	M1245-500G	For enrichment of cultures
McFarland Standards	Himedia	R092-1No	To compare density of culture suspension
Molecular Biology water	HiMedia	TCL018-500ML	For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)	HiMedia	M173-500G	For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc	HiMedia	SD731-5x50DS	For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers	Xcelris	NA	For PCR amplication
R2A Agar, Modified	HiMedia	M1743	For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	For generation of scaffolds
Sequencer	Illumina platform (2 x 150 bp chemistry)	NA	Sequencing of amplified library
Sodium Chloride	HiMedia	TC046-500G	For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit	Xcelgen	NA	For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification	Kaiju ioinformatics tool	NA	For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)	NA	NA	For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc	HiMedia	SD278	For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc	HiMedia	SD039-5x50DS	For performing AST
Tris base	HiMedia	TC072-500G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder	HiMedia	CMS217	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA - Not Applicable