Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici trasportati dall'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di batteri resistenti agli antibiotici dall'acqua e la caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici (ARG). L'uso di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica) fornisce informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti nelle acque dolci di Mumbai, in India.

Abstract

Lo sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici (AR) attraverso il microbiota associato ai corpi d'acqua dolce è una delle principali preoccupazioni per la salute globale. Nel presente studio, sono stati raccolti e analizzati campioni di acqua dolce rispetto alla diversità batterica totale e ai geni AR (ARG) utilizzando sia tecniche convenzionali basate sulla coltura che un approccio metagenomico indipendente dalla coltura ad alto rendimento. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per l'enumerazione dei batteri coltivabili totali e resistenti agli antibiotici da campioni di acqua dolce e la determinazione della resistenza fenotipica e genotipica negli isolati coltivabili. Inoltre, riportiamo l'uso dell'intera analisi metagenomica del DNA metagenomico totale estratto dal campione di acqua dolce per l'identificazione della diversità batterica complessiva, compresi i batteri non coltivabili, e l'identificazione del pool totale di diversi ARG (resistoma) nel corpo idrico. Seguendo questi protocolli dettagliati, abbiamo osservato un elevato carico di batteri resistenti agli antibiotici nell'intervallo di 9,6 × 10 5-1,2 × 10⁹ CFU / ml. La maggior parte degli isolati erano resistenti ai molteplici antibiotici testati, tra cui cefotaxime, ampicillina, levofloxacina, cloramfenicolo, ceftriaxone, gentamicina, neomicina, trimetoprim e ciprofloxacina, con indici multipli di resistenza agli antibiotici (MAR) di ≥0,2, indicando alti livelli di resistenza negli isolati. Il sequenziamento dell'rRNA 16S ha identificato potenziali patogeni umani, come Klebsiella pneumoniae, e batteri opportunisti, come Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. La caratterizzazione molecolare degli isolati ha mostrato la presenza di vari ARG, quali blaTEM, blaCTX-M (β-lattamici), aadA, aac (6')-Ib (aminoglicosidi) e dfr1 (trimetoprims), confermata anche dall'analisi metagenomica del DNA. Nel DNA metagenomico è stata rilevata anche un'elevata prevalenza di altri ARG che codificano per le pompe di efflusso antibiotico - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lattamasi - SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, il gene cloramfenicolo acetiltransferasi catB10 e il gene di resistenza alla rifampicina rphB - . Con l'aiuto dei protocolli discussi in questo studio, abbiamo confermato la presenza di batteri MAR trasportati dall'acqua con diversi tratti fenotipici e genotipici dell'AR. Pertanto, l'analisi metagenomica del DNA completo può essere utilizzata come tecnica complementare alle tecniche convenzionali basate sulla coltura per determinare lo stato complessivo di AR di un corpo idrico.

Introduzione

La resistenza antimicrobica (AMR) è stata identificata come uno dei problemi globali più urgenti. La rapida evoluzione della resistenza antimicrobica e la sua diffusione a livello mondiale rappresentano una delle maggiori minacce per la salute umana e l'economia globale in termini di costi sanitari ad essa associati¹. L'uso eccessivo e l'abuso di antibiotici hanno portato ad un aumento dell'AR. Ciò è stato evidenziato dalla pandemia di COVID-19, durante la quale il trattamento delle infezioni secondarie associate, in molti casi, è stato enormemente compromesso a causa della resistenza antimicrobica nei pazienti colpiti². Oltre all'uso/abuso diretto di antibiotici da parte dell'uomo, l'uso eccessivo e improprio di antibiotici in agricoltura e zootecnia e il loro scarico improprio nell'ambiente, compresi i corpi idrici, costituiscono una delle principali preoccupazioni³. L'aumento di nuovi tratti di resistenza e resistenza multifarmaco nei batteri evidenzia urgentemente la necessità di una migliore comprensione dei fattori che portano allo sviluppo dell'AR e alla sua diffusione. Più batteri resistenti agli antibiotici, che spesso trasportano più geni AR (ARG) su elementi genetici mobili come i plasmidi, possono trasferire questi geni di resistenza a microrganismi non resistenti, compresi potenziali agenti patogeni umani, portando così alla comparsa di superbatteri che non sono trattabili anche con antibiotici di ultima istanza⁴. Questi molteplici batteri resistenti agli antibiotici, se presenti negli ecosistemi acquatici, possono entrare direttamente nell'intestino umano attraverso il consumo di alimenti contaminati a base d'acqua come pesci, granchi e molluschi. Studi precedenti hanno dimostrato che la diffusione dei batteri AR nei sistemi idrici presenti in natura può raggiungere anche altre riserve idriche, compresa l'acqua potabile, e, quindi, può entrare nella catena alimentare umana ^5,6,7.

Lo scopo del presente studio è quello di fornire un protocollo completo utilizzando una combinazione di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica completa) per ottenere informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti in un corpo idrico a Mumbai, in India. Convenzionalmente, sono state utilizzate tecniche basate sulla coltura per studiare la diversità batterica nei corpi idrici. Poiché i microrganismi coltivabili costituiscono solo una piccola percentuale del microbiota totale in qualsiasi nicchia, per avere una migliore comprensione dello stato generale della diversità batterica e dei vari tratti resistenti prevalenti in qualsiasi campione, devono essere utilizzate in tandem varie tecniche basate sulla coltura e indipendenti dalla coltura. Una di queste tecniche robuste e affidabili indipendenti dalla coltura è l'analisi del DNA metagenomico completo. Questo metodo ad alto rendimento è stato utilizzato con successo in vari studi sulla diversità batterica o nelle annotazioni funzionali di vari ARG ^8,9. Questa tecnica utilizza il metagenoma (il materiale genetico totale in un campione) come materiale di partenza per varie analisi e, quindi, è indipendente dalla coltura. I protocolli del presente studio possono essere utilizzati per l'analisi dell'intero DNA metagenomico per ottenere informazioni sulla diversità batterica totale e vari ARG (resistoma) in campioni di acqua.

Protocollo

1. Raccolta ed elaborazione dei campioni

1. Raccolta di campioni
   1. Raccogliere il volume appropriato del campione d'acqua in contenitori sterili, assicurandosi che non siano riempiti più di 3/4 del contenitore.
   2. Trasportare i campioni in laboratorio in condizioni asettiche il più presto possibile dopo la raccolta e trattarli immediatamente.
2. Elaborazione dei campioni
   1. Filtrare asetticamente il campione d'acqua attraverso un panno di mussola sterile per rimuovere qualsiasi particella.
   2. Effettuare adeguate diluizioni seriali dell'acqua filtrata per ulteriori analisi.

2. Stima della carica batterica totale e del conteggio dei batteri resistenti agli antibiotici

1. Determinazione della carica batterica totale
   1. Sospendere 18,12 g di Agar R2A, polvere modificata in 1.000 ml di acqua bidistillata e sciogliere la miscela riscaldando. Autoclavare la miscela disciolta a 121 °C, 15 psi per 20 min. Preparare le piastre R2A Agar, Modified versando la quantità appropriata della miscela autoclavata in piastre di Petri sterili (ad esempio, aggiungere circa 20 ml di terreno sterile autoclavato a una piastra di Petri sterile di 90 mm).
   2. Distribuire uniformemente 100 μL delle diluizioni appropriate del campione di acqua filtrata sulla piastra R2A Agar, modificata una volta che il mezzo si solidifica. Esegui l'esperimento in duplicato.
   3. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35-37 °C per 48 h (variare la temperatura e il tempo di incubazione a seconda del mezzo utilizzato per l'isolamento).
   4. Esprimere la carica batterica totale in termini di unità formanti colonie per millilitro (CFU/ml) usando l'equazione (1):
      (1)
2. Determinazione della carica batterica AR
   1. Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.4. Tuttavia, invece di R2A Agar, piastre modificate, utilizzare R2A Agar, piastre modificate integrate individualmente con cinque diversi antibiotici, vale a dire cefotaxime (3 μg / mL), ciprofloxacina (0,5 μg / mL), eritromicina (20 μg / mL), kanamicina (15 μg / mL) e vancomicina (3 μg / mL).
   2. Aggiungere gli antibiotici separatamente in provette contenenti 20 mL di agar R2A fuso sterile, modificato (con la temperatura dell'agar R2A fuso, modificato a ≤40 °C) per ottenere la concentrazione finale di antibiotico come indicato al punto 2.2.1.
   3. Agitare per una miscelazione uniforme e versare su piastre di Petri sterili prima che l'agar si solidifichi. Esegui l'esperimento in duplicato.
   4. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35-37 °C per 48 h (se si utilizza un mezzo diverso, la temperatura e il tempo di incubazione possono variare).
   5. Per il controllo di qualità e la verifica dell'efficacia degli antibiotici, distribuire 100 μL di sospensioni batteriche dei ceppi di Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 sui rispettivi ceppi di Agar R2A contenente antibiotici, piastre modificate (assicurarsi che la densità della coltura fresca utilizzata per l'inoculazione sia OD = 0,5 a 600 nm).
   6. Determinare la conta batterica resistente agli antibiotici in termini di CFU/ml come descritto al punto 2.1.4.
3. Scorte di glicerolo degli isolati
   1. Selezionare colonie AR morfologicamente distinte.
   2. Sospendere una singola colonia isolata in 2 ml di brodo Luria-Bertani sterile contenente il rispettivo antibiotico (ad esempio, se una colonia è stata selezionata da una piastra contenente cefotaxime, inoculare la colonia dal punto 2.3.1 in brodo sterile di Luria-Bertani contenente cefotaxime alla rispettiva concentrazione).
   3. Incubare le provette inoculate a 37 °C a 80 giri/min fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,5.
   4. Preparare le scorte di glicerolo degli isolati mescolando 750 μL della sospensione di coltura dalla fase 2.3.3 in 250 μL di glicerolo sterile al 100% in condizioni asettiche.
   5. Conservare le scorte di glicerolo a -80 °C fino a ulteriori analisi.
      NOTA: Per la rinascita delle colture dalle scorte di glicerolo, scongelare le scorte di glicerolo a 4 °C. Inoculare un ciclo di questo stock in 2 ml di brodo Luria-Bertani sterile contenente il rispettivo antibiotico e lasciare crescere.

3. Identificazione di batteri coltivabili mediante sequenziamento del gene 16S rRNA

1. Preparazione del modello di DNA dagli isolati per PCR
   NOTA: Il protocollo descritto per la preparazione del modello di DNA per la PCR per l'isolamento del DNA grezzo dai batteri è dato da Carlson et ^al.10.
   1. Usando uno stuzzicadenti sterile, prendi una singola colonia isolata e pura dell'isolato che cresce su una piastra di Petri. Sospendere la colonia batterica in 100 μL di acqua sterile bidistillata in una provetta sterile per microcentrifuga e far bollire per 10 minuti.
   2. Centrifugare la sospensione a 10.000 × g per 2 minuti per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga sterile fresca da utilizzare come modello di DNA grezzo.
2. Amplificazione PCR mirata della regione V3 del gene rRNA 16S e sequenziamento
   1. Preparare 40 μL della miscela di reazione in una provetta PCR per l'amplificazione della PCR, come indicato nella Tabella 1.
      NOTA: La preparazione del DNA deve essere effettuata su un blocco di ghiaccio riducendo al minimo la possibilità di contaminazione (indossare guanti durante la manipolazione dei reagenti e pulire accuratamente la superficie di lavoro con etanolo al 70%).
   2. Posizionare il tubo nel blocco termico ed eseguire il programma appropriato nel termociclatore PCR. Vedere la Tabella 2 per le condizioni di ciclo standardizzate della PCR e le informazioni di primer per l'amplificazione delle regioni V3 dei geni rRNA 16S.
   3. Per risolvere gli ampliconi e la visualizzazione, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE). Mescolare 10 μL del prodotto PCR amplificato e 2 μL di tampone caricante gel 6x (Tabella 3) e caricare questa miscela in pozzetti su gel di agarosio all'1,5% (sciogliere 1,5 g di polvere di agarosio in 100 mL di 1x tampone TAE [Tabella 3]) contenente 5 μL di 10 mg/mL di bromuro di etidio (EtBr) ad una concentrazione finale di 0,5 μg/mL di EtBr in 100 mL di gel di agarosio.
      ATTENZIONE: EtBr è un potente cancerogeno. I guanti devono essere indossati in ogni momento durante la manipolazione di EtBr e gel contenenti EtBr.
   4. Aggiungi la scala del DNA per la stima della dimensione degli ampliconi.
   5. Effettuare l'elettroforesi del gel in un tampone serbatoio TAE a 80-100 V.
   6. Una volta che il colorante tracciante esegue 3/4 del gel, interrompere l'elettroforesi e visualizzare le bande di amplicone sotto un transilluminatore UV.
   7. Utilizzare il prodotto PCR (amplicone) per il sequenziamento del gene rRNA 16S per identificare l'isolato.
   8. Quantificare l'amplicone sottoponendolo ad analisi spettrofotometrica utilizzando l'equazione (2).
      (2)
   9. Per verificare la purezza del DNA, calcolare il rapporto A260/A280.
      NOTA: Idealmente, questo numero dovrebbe essere superiore a 1,5 e, preferibilmente, compreso tra 1,8 e 2,0.
   10. Per identificare gli isolati, confrontare le sequenze ottenute con i database di sequenze utilizzando uno strumento di ricerca di allineamento appropriato.

4. Rilevazione della resistenza agli antibiotici negli isolati mediante test di sensibilità agli antibiotici

NOTA: Questo protocollo descrive il metodo per i test di sensibilità agli antibiotici (AST) mediante diffusione del disco. Sono stati utilizzati i seguenti dischi antibiotici: cefotaxime (5 μg), ampicillina (10 μg), levofloxacina (5 μg), cloramfenicolo (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxone (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprim (5 μg) e ciprofloxacina (5 μg).

1. Preparazione dell'inoculo per l'AST
   1. Inocula asetticamente una singola colonia di AR purificata isolata utilizzando un'ansa sterile in 2 ml di un mezzo sterile non selettivo, come il brodo di Luria-Bertani (senza alcun antibiotico), e incubare a 37 °C a 80 giri/min durante la notte.
   2. Risospendere prelevando 100-150 μL della coltura coltivata durante la notte (approssimativamente, OD 600 = 1,8-2,0) in 2 ml di terreno di brodo fresco non selettivo Luria-Bertani e incubare per 2-4 ore (fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,4-0,5).
   3. Diluire questa sospensione di coltura appena coltivata utilizzando una soluzione salina sterile allo 0,85% in modo tale che la densità della coltura sia pari allo standard di 0,5 McFarland (approssimativamente, OD₆₀₀ = 0,1), che corrisponde approssimativamente a 1-2 × 10⁸ cellule / ml.
   4. Mescolare delicatamente la sospensione batterica per una distribuzione uniforme delle cellule.
   5. Utilizzare la sospensione di cui sopra entro 15 minuti dalla diluizione.
2. Inoculo delle piastre di agar
   1. Preparare le piastre Mueller-Hinton Agar (MHA) per eseguire l'AST mescolando 38 g di MHA in 1.000 ml di acqua bidistillata e sciogliere la miscela riscaldando. Autoclavare la miscela disciolta a 121 °C, 15 psi per 15 min.
   2. Assicurarsi che la profondità di MHA nelle piastre sia di 4 mm (25 ml di terreno per piastra).
   3. Contemporaneamente, rimuovere i dischi di antibiotico dal congelatore e riscaldarli a temperatura ambiente.
      NOTA: I dischi antibiotici devono essere gradualmente scongelati scongelando inizialmente i dischi a 4 °C e successivamente a temperatura ambiente per ridurre qualsiasi potenziale pericolo di condensa sui dischi, che può successivamente influenzare la zona di inibizione (ZOI).
   4. In condizioni asettiche, immergere un batuffolo di cotone sterile nell'inoculo preparato al punto 4.1 e rimuovere la sospensione in eccesso per evitare un'eccessiva inoculazione delle piastre.
   5. Distribuire uniformemente la coltura sui piatti, partendo dalla parte superiore della piastra MHA e andando avanti e indietro da un bordo all'altro. Ruotare la piastra di 60° durante il tampone.
3. Applicazione dei dischi antibiotici
   1. Con l'aiuto di una pinza sterilizzata a fiamma, trasferire asetticamente i dischi antibiotici sulle piastre MHA inoculate e premere delicatamente i dischi per garantire un contatto completo con l'agar.
      NOTA: Questa procedura deve essere eseguita entro 15 minuti dall'inoculazione della coltura sulle piastre.
   2. Posizionare il numero appropriato di dischi di antibiotico sulla piastra di agar tenendo conto dell'organismo, dell'antibiotico utilizzato e delle dimensioni della piastra per evitare sovrapposizioni delle zone di inibizione.
      NOTA: da quattro a cinque dischi possono essere alloggiati su una piastra circolare da 90 mm.
4. Incubazione delle piastre
   1. Entro 15 minuti dall'applicazione dei dischi antibiotici, capovolgere le piastre e incubare a 37 °C durante la notte.
5. Interpretazione dei risultati
   1. Misurare il diametro ZOI in millimetri (mm) e interpretare in base ai valori di breakpoint forniti da EUCAST¹¹. Vedi i due esempi riportati di seguito.
      1. Il punto di rottura del diametro della zona (mm) per un disco antibiotico di ciprofloxacina (5 μg) per Enterobacterales è S ≥ 25 e R < 22, il che significa che è considerato sensibile (S) se ZOI ≥ 25 mm, mentre è resistente (R) se ZOI < 22 mm. Se il diametro ZOI scende tra 22 e 25, l'isolato è considerato intermedio (I).
      2. Il punto di rottura del diametro della zona (mm) per un disco antibiotico cloramfenicolo (30 μg) per Staphylococcus spp. è S ≥ 18 e R < 18, il che significa che è considerato sensibile se ZOI ≥ 18 mm, mentre è resistente se ZOI < 18 mm.
   2. Determinare l'indice di resistenza agli antibiotici multipli (MAR) trovando il rapporto tra il numero di antibiotici a cui l'isolato è resistente e il numero totale di antibiotici a cui l'isolato è esposto.
      NOTA: Per il controllo di qualità, E. coli ATCC 25922 e S. aureo Gli ATCC 29213 sono utilizzati come ceppi di riferimento seguendo il protocollo come nella fase 4.

5. Rilevazione basata sulla PCR di geni di resistenza agli antibiotici negli isolati

1. Utilizzare un protocollo PCR standard per l'identificazione degli ARG negli isolati. Preparare il modello di DNA utilizzando il protocollo indicato al punto 3.1.
   NOTA: Le condizioni di ciclo della PCR utilizzate in questo studio erano 94 °C per 10 minuti, seguite da 35 cicli di 94 °C per 30 s, ricottura per 30 s alla temperatura appropriata (come standardizzato per ciascun set di primer), estensione a 72 °C per 40 s e estensione finale a 72 °C per 5 minuti. La miscela di reazione è descritta nella tabella 4. L'elenco degli ARG, dei primer e delle temperature di ricottura è riportato nella tabella 5.
2. Per risolvere, visualizzare e verificare la purezza degli ampliconi, seguire i passaggi 3.2.3-3.2.10.

6. Analisi del DNA metagenomico integrale per l'identificazione della diversità batterica totale e la rilevazione di ARG nel metagenoma

1. Estrazione del DNA totale (metagenoma) dal campione d'acqua
   1. Estrarre il DNA metagenomico dai campioni di acqua filtrata.
      NOTA: Nel presente studio, il DNA metagenomico (DNA totale) è stato estratto dai campioni di acqua filtrata utilizzando il kit di isolamento del DNA di riferimento seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   2. Controllare la qualità del DNA caricando 3 μL del DNA metagenomico estratto su un gel di agarosio allo 0,8% e far scorrere il gel a 80-110 V per circa 30 minuti.
   3. Verificare la presenza di una singola banda intatta.
   4. Controllare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorometro.
2. Determinazione della diversità batterica e rilevazione di ARG mediante sequenziamento dell'intero DNA metagenomico
   1. Preparazione della libreria e amplificazione PCR:
      1. Preparare una libreria di sequenziamento con estremità accoppiate utilizzando il kit di preparazione della libreria del DNA di riferimento (vedere la tabella dei materiali).
      2. Preparare il DNA per la legatura dell'adattatore prendendo 200 ng di DNA e tagliandolo meccanicamente in frammenti più piccoli, seguito da una fase continua di riparazione finale in cui viene aggiunta una "A" alle estremità 3'.
      3. A seconda della piattaforma utilizzata per il sequenziamento, applicare adattatori specifici a entrambe le estremità dei frammenti di DNA.
         NOTA: in questi adattatori sono presenti sequenze cruciali per l'associazione di librerie con doppio codice a barre a una cella di flusso per il sequenziamento. Ciò consente l'amplificazione PCR dei frammenti legati all'adattatore e il legame dei primer di sequenziamento standard.
      4. Per verificare la qualità e la quantità, analizzare la libreria amplificata utilizzando un chip DNA ad alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore.
   2. Generazione e sequenziamento dei cluster:
      1. Caricare la libreria amplificata sulla piattaforma di sequenziazione appropriata per la generazione e la successiva sequenziazione dei cluster.
         NOTA: Le molecole di libreria si legano agli oligo adattatori complementari sulla cella di flusso accoppiata. Durante il sequenziamento, i filamenti anteriori vengono selettivamente scissi dopo la risintesi del filamento inverso. Questo filamento inverso copiato viene quindi sequenziato dall'estremità opposta del frammento.
   3. Analisi bioinformatica:
      1. Genera scaffold dai dati di alta qualità utilizzando la piattaforma appropriata.
      2. Sottoporre questi scaffold ad analisi bioinformatica per la classificazione tassonomica e l'identificazione degli ARG.
         NOTA: Il flusso di lavoro per l'analisi dell'intero DNA metagenomico per l'identificazione della diversità batterica totale e la rilevazione di ARG nel metagenoma è riportato nella Figura 1. Un foglio di flusso della metodologia completa descritta nel manoscritto è riportato nella Figura 2.

Risultati

Carica batterica totale e conteggio dei batteri resistenti agli antibiotici (AR)
Il calcolo della carica batterica totale è stato effettuato diffondendo da 10⁻⁴ a 10⁻⁶ diluizioni dei campioni d'acqua su R2A Agar, mezzo modificato. Per l'enumerazione della conta dei batteri AR, sono state distribuite diluizioni da 10−³ a 10⁻⁶ volte su piastre contenenti antibiotici (Figura 3). I conteggi totali e dei batteri AR sono stat...

Discussione

La raccolta e l'elaborazione dei campioni svolgono un ruolo significativo e potrebbero influenzare i risultati e l'interpretazione dello studio. Pertanto, per escludere la variabilità nei campioni, è importante effettuare campionamenti in più punti del corpo d'acqua dolce studiato. Mantenere condizioni ambientali asettiche adeguate durante la manipolazione di tali campioni può prevenire la contaminazione. Inoltre, per evitare cambiamenti nella composizione batterica che possono influenzare la qualità e la quantità ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Himedia	MBT049-50LN	For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix	HiMedia	MBT061-50R	For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator	GS-192, Gayatri Scientific	NA	For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer	HiMedia	ML015-1ML	Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder	Himedia	MB229-50G	For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc	HiMedia	SD002	For performing AST
Autoclave	Equitron	NA	Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc	HiMedia	SD295E-5VL	For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder	HiMedia	TC352-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc	HiMedia	SD065	For performing AST
Centrifuge Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc	HiMedia	SD006-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD060-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder	HiMedia	TC447-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter	Quest	NA	For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database			functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator	BTL41 Allied Scientific	NA	For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit	NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NA	Paired-end sequencing library preparation
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus	TechResource	15 cm gel casting tray	For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis
Electrophoresis Power pack with electrodes	Genei	NA	For running the AGE
Erythromycin antibiotic disc	HiMedia	SD222-5VL	For performing AST
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	CMS528-1G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	TC024-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide	HiMedia	MB071-1G	Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer	Qubit 2.0	NA	For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System	BioRad		Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc	HiMedia	SD170-5x50DS	For performing AST
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS119-500ML	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol	HiMedia	GRM1027-500ML	For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc	HiMedia	SD073	For performing AST
Kaiju Database	NA	NA	For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc	HiMedia	SD017-5x50DS	For performing AST
Kanamycin antibiotic powder	HiMedia	MB105-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD216-5VL	For performing AST
Luria Bertani broth	Himedia	M1245-500G	For enrichment of cultures
McFarland Standards	Himedia	R092-1No	To compare density of culture suspension
Molecular Biology water	HiMedia	TCL018-500ML	For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)	HiMedia	M173-500G	For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc	HiMedia	SD731-5x50DS	For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers	Xcelris	NA	For PCR amplication
R2A Agar, Modified	HiMedia	M1743	For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	For generation of scaffolds
Sequencer	Illumina platform (2 x 150 bp chemistry)	NA	Sequencing of amplified library
Sodium Chloride	HiMedia	TC046-500G	For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit	Xcelgen	NA	For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification	Kaiju ioinformatics tool	NA	For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)	NA	NA	For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc	HiMedia	SD278	For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc	HiMedia	SD039-5x50DS	For performing AST
Tris base	HiMedia	TC072-500G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder	HiMedia	CMS217	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA - Not Applicable