Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus Wasser und die molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene (ARGs) vor. Die Verwendung von kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (metagenomischen Analysen) Techniken liefert vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs, die in Süßgewässern aus Mumbai, Indien, vorhanden sind.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen (AR) durch Mikrobiota in Verbindung mit Süßwasserkörpern ist ein großes globales Gesundheitsproblem. In der vorliegenden Studie wurden Süßwasserproben gesammelt und in Bezug auf die gesamte bakterielle Diversität und AR-Gene (ARGs) analysiert, wobei sowohl konventionelle kulturbasierte Techniken als auch ein kulturunabhängiger metagenomischer Ansatz mit hohem Durchsatz verwendet wurden. Dieser Artikel stellt ein systematisches Protokoll für die Zählung der gesamten und antibiotikaresistenten kultivierbaren Bakterien aus Süßwasserproben und die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Resistenz in den kultivierbaren Isolaten vor. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung der gesamten metagenomischen Analyse der gesamten metagenomischen DNA, die aus der Süßwasserprobe extrahiert wurde, zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Vielfalt, einschließlich nicht kultivierbarer Bakterien, und zur Identifizierung des gesamten Pools verschiedener ARGs (Resistome) im Gewässer. Nach diesen detaillierten Protokollen beobachteten wir eine hohe Antibiotika-resistente Bakterienlast im Bereich von 9,6 × 10 5-1,2 × 10⁹ KBE/ml. Die meisten Isolate waren resistent gegen die mehrfach getesteten Antibiotika, darunter Cefotaxim, Ampicillin, Levofloxacin, Chloramphenicol, Ceftriaxon, Gentamicin, Neomycin, Trimethoprim und Ciprofloxacin, mit multiplen Antibiotikaresistenzindizes (MAR) von ≥0,2, was auf eine hohe Resistenz der Isolate hinweist. Die 16S-rRNA-Sequenzierung identifizierte potenzielle humanpathogene wie Klebsiella pneumoniae und opportunistische Bakterien wie Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. und Aeromonas spp. Die molekulare Charakterisierung der Isolate zeigte das Vorhandensein verschiedener ARGs, wie blaTEM, blaCTX-M (β-Lactame), aadA, aac (6')-Ib (Aminoglykoside) und dfr1 (Trimethoprims), was auch durch die gesamte metagenomische DNA-Analyse bestätigt wurde. Eine hohe Prävalenz anderer ARGs, die für antibiotische Ausflusspumpen kodieren - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-Lactamasen-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen catB10 und das Rifampicin-Resistenzgen rphB- wurde ebenfalls in der metagenomischen DNA nachgewiesen. Mit Hilfe der in dieser Studie diskutierten Protokolle bestätigten wir das Vorhandensein von wasserbürtigen MAR-Bakterien mit verschiedenen phänotypischen und genotypischen Merkmalen von AR. Daher kann die gesamte metagenomische DNA-Analyse als komplementäre Technik zu herkömmlichen kulturbasierten Techniken verwendet werden, um den gesamten AR-Status eines Gewässers zu bestimmen.

Einleitung

Antimikrobielle Resistenzen (AMR) wurden als eines der drängendsten globalen Probleme identifiziert. Die rasche Entwicklung antimikrobieller Resistenzen und ihre weltweite Ausbreitung sind eine der größten Bedrohungen für die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft in Bezug auf die damit verbundenen Gesundheitskosten¹. Der übermäßige Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika haben zu einer Zunahme von AR geführt. Dies wurde durch die COVID-19-Pandemie unterstrichen, bei der die Behandlung von assoziierten Sekundärinfektionen in vielen Fällen aufgrund von AMR bei den betroffenen Patienten stark beeinträchtigt war². Neben der direkten Verwendung/dem Missbrauch von Antibiotika durch den Menschen sind der übermäßige Einsatz und Missbrauch von Antibiotika in der Landwirtschaft und Tierhaltung und ihre unsachgemäße Einleitung in die Umwelt, einschließlich der Gewässer, ein^{großes Problem 3}. Das Aufkommen neuer Resistenzmerkmale und Multiresistenzen bei Bakterien unterstreicht dringend die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der Faktoren, die zur Entwicklung von AR und ihrer Verbreitung führen. Mehrere antibiotikaresistente Bakterien, die oft mehrere AR-Gene (ARGs) auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden tragen, können diese Resistenzgene auf nicht-resistente Mikroorganismen, einschließlich potenzieller humaner Krankheitserreger, übertragen, was zur Entstehung von Superbugs führt, die selbst mit Antibiotika als letztes Mittel nicht behandelbar sind⁴. Diese multiplen antibiotikaresistenten Bakterien können, wenn sie in Wasserökosystemen vorkommen, direkt über den Verzehr von kontaminierten wasserbasierten Lebensmitteln wie Fischen, Krabben und Weichtieren in den menschlichen Darm gelangen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Ausbreitung von AR-Bakterien in natürlich vorkommenden Wassersystemen auch andere Wasservorräte, einschließlich Trinkwasser, erreichen und so in die menschliche Nahrungskette gelangen kann ^5,6,7.

Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, ein umfassendes Protokoll zu erstellen, das eine Kombination aus kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (gesamte metagenomische Analyse) Techniken verwendet, um vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs in einem Gewässer in Mumbai, Indien, zu erhalten. Herkömmlicherweise wurden kulturbasierte Techniken verwendet, um die bakterielle Vielfalt in Gewässern zu untersuchen. Da kultivierbare Mikroorganismen nur einen kleinen Prozentsatz der gesamten Mikrobiota in jeder Nische ausmachen, müssen verschiedene kulturbasierte und kulturunabhängige Techniken gleichzeitig eingesetzt werden, um den Gesamtstatus der bakteriellen Vielfalt und die verschiedenen Resistenzmerkmale in jeder Probe besser zu verstehen. Eine solche robuste und zuverlässige kulturunabhängige Technik ist die gesamte metagenomische DNA-Analyse. Diese Hochdurchsatzmethode wurde erfolgreich in verschiedenen Studien zur bakteriellen Diversität oder den funktionellen Annotationen verschiedener ARGs ^8,9 eingesetzt. Diese Technik nutzt das Metagenom (das gesamte Erbgut einer Probe) als Ausgangsmaterial für verschiedene Analysen und ist somit kulturunabhängig. Die Protokolle in der vorliegenden Studie können für die gesamte metagenomische DNA-Analyse verwendet werden, um Informationen über die gesamte bakterielle Diversität und verschiedene ARGs (Resistome) in Wasserproben zu erhalten.

Protokoll

1. Probenentnahme und -verarbeitung

1. Musterkollektion
   1. Sammeln Sie das entsprechende Volumen der Wasserprobe in sterilen Probenbehältern und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 3/4 des Behälters gefüllt ist.
   2. Transportieren Sie die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme unter aseptischen Bedingungen ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort.
2. Probenbearbeitung
   1. Filtern Sie die Wasserprobe aseptisch durch ein steriles Musselintuch, um Partikel zu entfernen.
   2. Führen Sie geeignete serielle Verdünnungen des gefilterten Wassers zur weiteren Analyse durch.

2. Abschätzung der Gesamtkeimbelastung und der Keimzahl der Antibiotikaresistenzen

1. Bestimmung der Gesamtkeimbelastung
   1. 18,12 g R2A-Agar, modifiziertes Pulver, in 1.000 ml doppelt destilliertem Wasser suspendieren und die Mischung durch Erhitzen auflösen. Das gelöste Gemisch wird bei 121 °C, 15 psi für 20 Minuten autoklaviert. Bereiten Sie R2A-Agar, modifizierte Platten vor, indem Sie die entsprechende Menge des autoklavierten Gemisches in sterile Petriplatten gießen (z. B. etwa 20 ml autoklaviertes steriles Medium zu einer 90 mm sterilen Petriplatte).
   2. Verteilen Sie gleichmäßig 100 μL der entsprechenden Verdünnungen der gefilterten Wasserprobe auf die R2A-Agar-modifizierte Platte, sobald das Medium erstarrt ist. Führen Sie das Experiment doppelt durch.
   3. Alle oben genannten Platten werden 48 Stunden lang bei 35-37 °C inkubiert (je nach verwendetem Medium variieren Temperatur und Inkubationszeit).
   4. Drücken Sie die Gesamtbakterienbelastung in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) unter Verwendung von Gleichung (1) aus:
      (1)
2. Bestimmung der AR-Keimzahl
   1. Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.4. Anstelle von R2A-Agar verwenden modifizierte Platten jedoch R2A-Agar, modifizierte Platten, die einzeln mit fünf verschiedenen Antibiotika ergänzt werden, nämlich Cefotaxim (3 μg / ml), Ciprofloxacin (0,5 μg / ml), Erythromycin (20 μg / ml), Kanamycin (15 μg / ml) und Vancomycin (3 μg / ml).
   2. Die Antibiotika werden separat in Röhrchen gegeben, die 20 ml steriles geschmolzenes R2A-Agar, modifiziert (mit der Temperatur des geschmolzenen R2A-Agars, modifiziert bei ≤40 °C), enthalten, um die endgültige Antibiotikakonzentration gemäß Schritt 2.2.1 zu erreichen.
   3. Zum gleichmäßigen Mischen schwenken und auf sterile Petriplatten gießen, bevor der Agar erstarrt. Führen Sie das Experiment doppelt durch.
   4. Inkubieren Sie alle oben genannten Platten bei 35-37 °C für 48 h (bei Verwendung eines anderen Mediums können Temperatur und Inkubationszeit variieren).
   5. Zur Qualitätskontrolle und Überprüfung der Wirksamkeit der Antibiotika verteilen Sie 100 μL Bakteriensuspensionen der Stämme Escherichia coli ATCC 25922 und Staphylococcus aureus ATCC 29213 auf ihre jeweiligen antibiotikahaltigen R2A-Agar, modifizierte Platten (stellen Sie sicher, dass die Dichte der für die Impfung verwendeten Frischkultur OD = 0,5 bei 600 nm beträgt).
   6. Die Anzahl der antibiotikaresistenten Keime in KBE/ml wird bestimmt, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben.
3. Glycerinvorräte der Isolate
   1. Wählen Sie morphologisch unterschiedliche AR-Kolonien aus.
   2. Eine einzelne isolierte Kolonie wird in 2 ml steriler Luria-Bertani-Bouillon suspendiert, die das entsprechende Antibiotikum enthält (z. B. wenn eine Kolonie aus einer Platte ausgewählt wurde, die Cefotaxim enthält, wird die Kolonie aus Schritt 2.3.1 in steriler Luria-Bertani-Bouillon, die Cefotaxim in ihrer jeweiligen Konzentration enthält, beimpft).
   3. Die beimpften Röhrchen werden bei 37 °C bei 80 U/min inkubiert, bis der OD₆₀₀ 0,5 erreicht.
   4. Glycerinvorräte der Isolate werden hergestellt, indem 750 μL der Kultursuspension aus Schritt 2.3.3 unter aseptischen Bedingungen in 250 μL steriles 100%iges Glycerin gemischt werden.
   5. Lagern Sie die Glycerinvorräte bis zur weiteren Analyse bei −80 °C.
      HINWEIS: Zur Wiederbelebung der Kulturen aus den Glycerinvorräten die Glycerinvorräte bei 4 °C auftauen. Eine Schleife voll dieser Brühe in 2 ml sterile Luria-Bertani-Bouillon mit dem jeweiligen Antibiotikum einimpfen und wachsen lassen.

3. Identifizierung kultivierbarer Bakterien durch 16S-rRNA-Gensequenzierung

1. Herstellung eines DNA-Templates aus den Isolaten für die PCR
   ANMERKUNG: Das beschriebene Protokoll für die Herstellung einer DNA-Vorlage für die PCR zur Isolierung von Roh-DNA aus den Bakterien wird von Carlson et ^al.10 gegeben.
   1. Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne, isolierte, reine Kolonie des Isolats, das auf einer Petriplatte wächst. Die Bakterienkolonie in 100 μL sterilem, doppelt destilliertem Wasser in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen suspendieren und 10 min kochen lassen.
   2. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 10.000 × g für 2 Minuten, um die Trümmer zu pelletieren, und überführen Sie den Überstand in ein frisches steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das als rohe DNA-Vorlage verwendet wird.
2. Gezielte PCR-Amplifikation der V3-Region des 16S-rRNA-Gens und Sequenzierung
   1. 40 μL des Reaktionsgemisches werden in einem PCR-Röhrchen für die PCR-Amplifikation hergestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben.
      HINWEIS: Die DNA-Präparation sollte auf einem Eisblock durchgeführt werden, wobei die Gefahr einer Kontamination minimiert werden sollte (tragen Sie Handschuhe bei der Handhabung der Reagenzien und reinigen Sie die Arbeitsfläche gründlich mit 70% Ethanol).
   2. Legen Sie das Röhrchen in den Thermoblock und führen Sie das entsprechende Programm im PCR-Thermocycler aus. Siehe Tabelle 2 für die standardisierten PCR-Zyklusbedingungen und die Primer-Informationen für die Amplifikation der V3-Regionen der 16S-rRNA-Gene.
   3. Zur Auflösung der Amplikone und Visualisierung wird eine Agarose-Gelelektrophorese (AGE) durchgeführt. Mischen Sie 10 μL des amplifizierten PCR-Produkts und 2 μL 6x Gelbeladungspuffer (Tabelle 3) und laden Sie dieses Gemisch in Vertiefungen auf 1,5%igem Agarosegel (lösen Sie 1,5 g Agarosepulver in 100 mL 1x TAE-Puffer [Tabelle 3]), das 5 μL 10 mg/ml Ethidiumbromid (EtBr) enthält, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml EtBr in 100 ml des Agarosegels.
      VORSICHT: EtBr ist ein starkes Karzinogen. Beim Umgang mit EtBr und Gelen, die EtBr enthalten, sollten immer Handschuhe getragen werden.
   4. Fügen Sie eine DNA-Leiter hinzu, um die Größe der Amplikonen abzuschätzen.
   5. Elektrophorese des Gels in einem TAE-Tankpuffer bei 80-100 V durchführen.
   6. Sobald der Tracking-Farbstoff 3/4 des Gels verläuft, stoppen Sie die Elektrophorese und visualisieren Sie die Amplikonbänder unter einem UV-Transilluminator.
   7. Verwenden Sie das PCR-Produkt (Amplicon) für die 16S-rRNA-Gensequenzierung, um das Isolat zu identifizieren.
   8. Quantifizieren Sie das Amplikon, indem Sie es einer spektralphotometrischen Analyse mit Gleichung (2) unterziehen.
      (2)
   9. Um die Reinheit der DNA zu überprüfen, berechnen Sie das Verhältnis von A260 zu A280.
      HINWEIS: Idealerweise sollte diese Zahl über 1,5 und vorzugsweise zwischen 1,8 und 2,0 liegen.
   10. Um die Isolate zu identifizieren, vergleichen Sie die erhaltenen Sequenzen mit Sequenzdatenbanken mithilfe eines geeigneten Alignment-Suchwerkzeugs.

4. Nachweis von Antibiotikaresistenzen in den Isolaten mittels Antibiotika-Empfindlichkeitstests

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Methode für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Bandscheibendiffusion. Folgende antibiotische Bandscheiben wurden verwendet: Cefotaxim (5 μg), Ampicillin (10 μg), Levofloxacin (5 μg), Chloramphenicol (30 μg), Tigecyclin (15 μg), Ceftriaxon (30 μg), Imipenem (10 μg), Gentamicin (10 μg), Neomycin (10 μg), Trimethoprim (5 μg) und Ciprofloxacin (5 μg).

1. Vorbereitung des Inokulums für die AST
   1. Eine einzelne, isolierte, gereinigte AR-Kolonie wird unter Verwendung einer sterilen Schleife in 2 ml eines sterilen, nicht selektiven Mediums, wie z. B. Luria-Bertani-Bouillon (ohne Antibiotikum), aseptisch beimpft und über Nacht bei 37 °C bei 80 U/min inkubiert.
   2. Resuspendieren, indem 100-150 μL der über Nacht gewachsenen Kultur (ca. OD 600 = 1,8-2,0) in 2 ml frischem, nicht selektivem Luria-Bertani-Brühmedium entnommen und 2-4 h inkubiert werden (bis der OD₆₀₀ 0,4-0,5 erreicht).
   3. Diese frisch gezüchtete Kultursuspension wird mit steriler 0,85%iger Kochsalzlösung so verdünnt, dass die Dichte der Kultur dem McFarland-Standard von 0,5 entspricht (ungefähr OD₆₀₀ = 0,1), was ungefähr 1-2 × 10⁸ Zellen/ml entspricht.
   4. Mischen Sie die Bakteriensuspension vorsichtig für eine gleichmäßige Zellverteilung.
   5. Verwenden Sie die obige Suspension innerhalb von 15 Minuten nach der Verdünnung.
2. Beimpfung der Agarplatten
   1. Bereiten Sie Müller-Hinton-Agarplatten (MHA) für die Durchführung der AST vor, indem Sie 38 g MHA in 1.000 ml doppelt destilliertem Wasser mischen und die Mischung durch Erhitzen auflösen. Das gelöste Gemisch wird bei 121 °C, 15 psi für 15 min autoklaviert.
   2. Stellen Sie sicher, dass die MHA-Tiefe in den Platten 4 mm beträgt (25 ml Medium pro Platte).
   3. Nehmen Sie gleichzeitig die antibiotischen Scheiben aus dem Gefrierschrank und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die antibiotischen Scheiben sollten allmählich aufgetaut werden, indem die Scheiben zunächst bei 4 °C und später bei Raumtemperatur aufgetaut werden, um eine mögliche Kondensationsgefahr auf den Scheiben zu verringern, die sich anschließend auf die Hemmzone (ZOI) auswirken kann.
   4. Unter aseptischen Bedingungen wird ein steriles Wattestäbchen in das in Schritt 4.1 vorbereitete Inokulum getaucht und überschüssige Suspension entfernt, um eine Überbeimpfung der Platten zu vermeiden.
   5. Verteilen Sie die Kultur gleichmäßig auf den Tellern, beginnend mit der Oberseite der MHA-Platte und von Rand zu Rand hin und her. Drehen Sie die Platte beim Abtupfen um 60°.
3. Anwendung der antibiotischen Scheiben
   1. Übertragen Sie die antibiotischen Scheiben mit Hilfe einer flammsterilisierten Pinzette aseptisch auf die inokulierten MHA-Platten und drücken Sie die Scheiben vorsichtig an, um einen vollständigen Kontakt mit dem Agar zu gewährleisten.
      HINWEIS: Dieser Vorgang muss innerhalb von 15 Minuten nach der Beimpfung der Kultur auf den Platten durchgeführt werden.
   2. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Antibiotikascheiben auf die Agarplatte unter Berücksichtigung des Organismus, des verwendeten Antibiotikums und der Größe der Platte, um eine Überlappung der Hemmzonen zu vermeiden.
      HINWEIS: Vier bis fünf Scheiben können auf einer 90 mm Rundplatte untergebracht werden.
4. Inkubation der Platten
   1. Innerhalb von 15 min nach dem Auftragen der antibiotischen Scheiben die Platten umdrehen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
5. Interpretation der Ergebnisse
   1. Messen Sie den ZOI-Durchmesser in Millimetern (mm) und interpretieren Sie gemäß den Haltepunktwerten von EUCAST¹¹. Sehen Sie sich die beiden unten aufgeführten Beispiele an.
      1. Der Bruchpunkt des Zonendurchmessers (mm) für eine Ciprofloxacin-Antibiotikascheibe (5 μg) für Enterobacterales beträgt S ≥ 25 und R < 22, was bedeutet, dass sie als empfindlich (S) gilt, wenn ZOI 25 mm ≥, während sie resistent ist (R), wenn ZOI 22 mm <. Liegt der ZOI-Durchmesser zwischen 22 und 25, gilt das Isolat als intermediär (I).
      2. Der Bruchpunkt des Zonendurchmessers (mm) für eine Chloramphenicol-Antibiotikascheibe (30 μg) für Staphylococcus spp. ist S ≥ 18 und R < 18, was bedeutet, dass er als empfindlich gilt, wenn ZOI 18 mm ≥, während er resistent ist, wenn ZOI 18 mm <.
   2. Bestimmen Sie den Index der multiplen Antibiotikaresistenz (MAR), indem Sie das Verhältnis der Anzahl der Antibiotika, gegen die das Isolat resistent ist, zur Gesamtzahl der Antibiotika, denen das Isolat ausgesetzt ist, ermitteln.
      HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle E. coli ATCC 25922 und S. aureus ATCC 29213 werden als Referenzstämme gemäß dem Protokoll in Schritt 4 verwendet.

5. PCR-basierter Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen in den Isolaten

1. Verwenden Sie ein Standard-PCR-Protokoll für die Identifizierung von ARGs in den Isolaten. Bereiten Sie die DNA-Vorlage unter Verwendung des in Schritt 3.1 angegebenen Protokolls vor.
   ANMERKUNG: Die in dieser Studie verwendeten PCR-Zyklusbedingungen betrugen 94 °C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, Glühen für 30 s bei der entsprechenden Temperatur (wie für jeden Primer-Satz standardisiert), Dehnung bei 72 °C für 40 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Das Reaktionsgemisch ist in Tabelle 4 beschrieben. Die Liste der ARGs, Primer und Glühtemperaturen ist in Tabelle 5 aufgeführt.
2. Führen Sie die Schritte 3.2.3 bis 3.2.10 aus, um die Reinheit der Amplikonen aufzulösen, zu visualisieren und zu überprüfen.

6. Metagenomische DNA-Analyse zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität und zum Nachweis von ARGs im Metagenom

1. Extraktion der gesamten DNA (Metagenom) aus der Wasserprobe
   1. Extrahieren Sie die metagenomische DNA aus den gefilterten Wasserproben.
      HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die metagenomische DNA (Gesamt-DNA) aus den gefilterten Wasserproben unter Verwendung des referenzierten DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert (siehe Materialtabelle).
   2. Überprüfen Sie die Qualität der DNA, indem Sie 3 μL der extrahierten metagenomischen DNA auf ein 0,8%iges Agarose-Gel laden und das Gel bei 80-110 V für ca. 30 Minuten laufen lassen.
   3. Prüfen Sie, ob ein einzelnes intaktes Band vorhanden ist.
   4. Überprüfen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
2. Bestimmung der bakteriellen Diversität und Detektion von ARGs mittels metagenomischer DNA-Sequenzierung
   1. Bibliotheksvorbereitung und PCR-Amplifikation:
      1. Bereiten Sie eine Paired-End-Sequenzierungsbibliothek mit dem referenzierten DNA-Bibliotheksvorbereitungskit vor (siehe Materialtabelle).
      2. Bereiten Sie die DNA für die Adapterligatur vor, indem Sie 200 ng DNA nehmen und mechanisch in kleinere Fragmente scheren, gefolgt von einem kontinuierlichen Schritt der Endreparatur, bei dem ein "A" an die 3'-Enden angehängt wird.
      3. Abhängig von der Plattform, die für die Sequenzierung verwendet wird, ligieren Sie spezifische Adapter an beiden Enden der DNA-Fragmente.
         HINWEIS: Sequenzen, die für die Bindung von Dual-Barcode-Bibliotheken an eine Flusszelle für die Sequenzierung entscheidend sind, sind in diesen Adaptern vorhanden. Dies ermöglicht die PCR-Amplifikation der adapterligierten Fragmente und die Bindung der Standard-Sequenzierungsprimer.
      4. Um die Qualität und Quantität zu überprüfen, analysieren Sie die amplifizierte Bibliothek mit einem hochempfindlichen DNA-Chip gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Cluster-Generierung und -Sequenzierung:
      1. Laden Sie die erweiterte Bibliothek auf die entsprechende Sequenzierungsplattform für die Clustergenerierung und die anschließende Sequenzierung.
         HINWEIS: Die Bibliotheksmoleküle binden an die komplementären Adapter-Oligos auf der Paired-End-Durchflusszelle. Bei der Sequenzierung werden die Vorwärtsstränge nach der Resynthese des Reversestrangs selektiv gespalten. Dieser kopierte umgekehrte Strang wird dann vom gegenüberliegenden Ende des Fragments sequenziert.
   3. Bioinformatische Analyse:
      1. Generieren Sie aus den hochwertigen Daten Scaffolds mit der entsprechenden Plattform.
      2. Unterziehen Sie diese Gerüste einer bioinformatischen Analyse für die taxonomische Klassifizierung und Identifizierung der ARGs.
         HINWEIS: Der Arbeitsablauf für die gesamte metagenomische DNA-Analyse zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität und zum Nachweis von ARGs im Metagenom ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein Flussdiagramm der vollständigen Methodik, die im Manuskript beschrieben ist.

Ergebnisse

Gesamtkeimbelastung und Anzahl der antibiotikaresistenten (AR) Bakterien
Die Zählung der Gesamtbakterienbelastung erfolgte durch Verteilen von 10−⁴- bis 10^−6-fachen Verdünnungen der Wasserproben auf R2A-Agar, modifiziertes Medium. Für die Zählung der ^{AR-Bakterienzahl} wurden 10−3- bis 10^−6-fache Verdünnungen auf antibiotikahaltige Medienplatten aufgetragen (Abbildung 3). Die Gesamt- und AR-Bakterienzahlen wurden als ...

Diskussion

Die Probenentnahme und -verarbeitung spielt eine wichtige Rolle und kann die Ergebnisse und die Interpretation der Studie beeinflussen. Um eine Variabilität der Proben auszuschließen, ist es daher wichtig, die Probenahme an mehreren Stellen des untersuchten Süßwasserkörpers durchzuführen. Die Aufrechterhaltung geeigneter aseptischer Umgebungsbedingungen bei der Handhabung solcher Proben kann eine Kontamination verhindern. Um Veränderungen in der Bakterienzusammensetzung zu vermeiden, die die Qualität und Quantit?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Himedia	MBT049-50LN	For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix	HiMedia	MBT061-50R	For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator	GS-192, Gayatri Scientific	NA	For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer	HiMedia	ML015-1ML	Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder	Himedia	MB229-50G	For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc	HiMedia	SD002	For performing AST
Autoclave	Equitron	NA	Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc	HiMedia	SD295E-5VL	For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder	HiMedia	TC352-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc	HiMedia	SD065	For performing AST
Centrifuge Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc	HiMedia	SD006-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD060-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder	HiMedia	TC447-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter	Quest	NA	For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database			functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator	BTL41 Allied Scientific	NA	For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit	NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NA	Paired-end sequencing library preparation
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus	TechResource	15 cm gel casting tray	For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis
Electrophoresis Power pack with electrodes	Genei	NA	For running the AGE
Erythromycin antibiotic disc	HiMedia	SD222-5VL	For performing AST
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	CMS528-1G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	TC024-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide	HiMedia	MB071-1G	Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer	Qubit 2.0	NA	For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System	BioRad		Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc	HiMedia	SD170-5x50DS	For performing AST
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS119-500ML	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol	HiMedia	GRM1027-500ML	For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc	HiMedia	SD073	For performing AST
Kaiju Database	NA	NA	For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc	HiMedia	SD017-5x50DS	For performing AST
Kanamycin antibiotic powder	HiMedia	MB105-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD216-5VL	For performing AST
Luria Bertani broth	Himedia	M1245-500G	For enrichment of cultures
McFarland Standards	Himedia	R092-1No	To compare density of culture suspension
Molecular Biology water	HiMedia	TCL018-500ML	For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)	HiMedia	M173-500G	For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc	HiMedia	SD731-5x50DS	For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers	Xcelris	NA	For PCR amplication
R2A Agar, Modified	HiMedia	M1743	For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	For generation of scaffolds
Sequencer	Illumina platform (2 x 150 bp chemistry)	NA	Sequencing of amplified library
Sodium Chloride	HiMedia	TC046-500G	For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit	Xcelgen	NA	For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification	Kaiju ioinformatics tool	NA	For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)	NA	NA	For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc	HiMedia	SD278	For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc	HiMedia	SD039-5x50DS	For performing AST
Tris base	HiMedia	TC072-500G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder	HiMedia	CMS217	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA - Not Applicable