Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus Wasser und die molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene (ARGs) vor. Die Verwendung von kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (metagenomischen Analysen) Techniken liefert vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs, die in Süßgewässern aus Mumbai, Indien, vorhanden sind.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen (AR) durch Mikrobiota in Verbindung mit Süßwasserkörpern ist ein großes globales Gesundheitsproblem. In der vorliegenden Studie wurden Süßwasserproben gesammelt und in Bezug auf die gesamte bakterielle Diversität und AR-Gene (ARGs) analysiert, wobei sowohl konventionelle kulturbasierte Techniken als auch ein kulturunabhängiger metagenomischer Ansatz mit hohem Durchsatz verwendet wurden. Dieser Artikel stellt ein systematisches Protokoll für die Zählung der gesamten und antibiotikaresistenten kultivierbaren Bakterien aus Süßwasserproben und die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Resistenz in den kultivierbaren Isolaten vor. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung der gesamten metagenomischen Analyse der gesamten metagenomischen DNA, die aus der Süßwasserprobe extrahiert wurde, zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Vielfalt, einschließlich nicht kultivierbarer Bakterien, und zur Identifizierung des gesamten Pools verschiedener ARGs (Resistome) im Gewässer. Nach diesen detaillierten Protokollen beobachteten wir eine hohe Antibiotika-resistente Bakterienlast im Bereich von 9,6 × 10 5-1,2 × 10⁹ KBE/ml. Die meisten Isolate waren resistent gegen die mehrfach getesteten Antibiotika, darunter Cefotaxim, Ampicillin, Levofloxacin, Chloramphenicol, Ceftriaxon, Gentamicin, Neomycin, Trimethoprim und Ciprofloxacin, mit multiplen Antibiotikaresistenzindizes (MAR) von ≥0,2, was auf eine hohe Resistenz der Isolate hinweist. Die 16S-rRNA-Sequenzierung identifizierte potenzielle humanpathogene wie Klebsiella pneumoniae und opportunistische Bakterien wie Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. und Aeromonas spp. Die molekulare Charakterisierung der Isolate zeigte das Vorhandensein verschiedener ARGs, wie blaTEM, blaCTX-M (β-Lactame), aadA, aac (6')-Ib (Aminoglykoside) und dfr1 (Trimethoprims), was auch durch die gesamte metagenomische DNA-Analyse bestätigt wurde. Eine hohe Prävalenz anderer ARGs, die für antibiotische Ausflusspumpen kodieren - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-Lactamasen-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen catB10 und das Rifampicin-Resistenzgen rphB- wurde ebenfalls in der metagenomischen DNA nachgewiesen. Mit Hilfe der in dieser Studie diskutierten Protokolle bestätigten wir das Vorhandensein von wasserbürtigen MAR-Bakterien mit verschiedenen phänotypischen und genotypischen Merkmalen von AR. Daher kann die gesamte metagenomische DNA-Analyse als komplementäre Technik zu herkömmlichen kulturbasierten Techniken verwendet werden, um den gesamten AR-Status eines Gewässers zu bestimmen.

Einleitung

Antimikrobielle Resistenzen (AMR) wurden als eines der drängendsten globalen Probleme identifiziert. Die rasche Entwicklung antimikrobieller Resistenzen und ihre weltweite Ausbreitung sind eine der größten Bedrohungen für die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft in Bezug auf die damit verbundenen Gesundheitskosten¹. Der übermäßige Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika haben zu einer Zunahme von AR geführt. Dies wurde durch die COVID-19-Pandemie unterstrichen, bei der die Behandlung von assoziierten Sekundärinfektionen in vielen Fällen aufgrund von AMR bei den betroffenen Patienten stark beeinträchtigt war². Ne....

Protokoll

1. Probenentnahme und -verarbeitung

1. Musterkollektion
   1. Sammeln Sie das entsprechende Volumen der Wasserprobe in sterilen Probenbehältern und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 3/4 des Behälters gefüllt ist.
   2. Transportieren Sie die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme unter aseptischen Bedingungen ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort.
2. Probenbearbeitung
   1. Filtern Sie die Wasserprobe aseptisch durch ein steriles Musselintuch, um Partikel zu entfernen.
   2. Führen Sie geeignete serielle Verdünnungen des gefilterten Wassers zur weiteren Analyse durch.

Ergebnisse

Gesamtkeimbelastung und Anzahl der antibiotikaresistenten (AR) Bakterien
Die Zählung der Gesamtbakterienbelastung erfolgte durch Verteilen von 10−⁴- bis 10^−6-fachen Verdünnungen der Wasserproben auf R2A-Agar, modifiziertes Medium. Für die Zählung der ^{AR-Bakterienzahl} wurden 10−3- bis 10^−6-fache Verdünnungen auf antibiotikahaltige Medienplatten aufgetragen (Abbildung 3). Die Gesamt- und AR-Bakterienzahlen wurden als .......

Diskussion

Die Probenentnahme und -verarbeitung spielt eine wichtige Rolle und kann die Ergebnisse und die Interpretation der Studie beeinflussen. Um eine Variabilität der Proben auszuschließen, ist es daher wichtig, die Probenahme an mehreren Stellen des untersuchten Süßwasserkörpers durchzuführen. Die Aufrechterhaltung geeigneter aseptischer Umgebungsbedingungen bei der Handhabung solcher Proben kann eine Kontamination verhindern. Um Veränderungen in der Bakterienzusammensetzung zu vermeiden, die die Qualität und Quantit?.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	Himedia	MBT049-50LN	For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix	HiMedia	MBT061-50R	For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator	GS-192, Gayatri Scientific	NA	For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer	HiMedia	ML015-1ML	Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder	Himedia	MB229-50G	For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc	HiMedia	SD002	For performing AST
Autoclave	Equitron	NA	Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc	HiMedia	SD295E-5VL	For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder	HiMedia	TC352-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc	HiMedia	SD065	For performing AST
Centrifuge Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc	HiMedia	SD006-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD060-5x50DS	For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder	HiMedia	TC447-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter	Quest	NA	For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database			functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator	BTL41 Allied Scientific	NA	For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit	NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NA	Paired-end sequencing library preparation
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus	TechResource	15 cm gel casting tray	For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis
Electrophoresis Power pack with electrodes	Genei	NA	For running the AGE
Erythromycin antibiotic disc	HiMedia	SD222-5VL	For performing AST
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	CMS528-1G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder	HiMedia	TC024-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide	HiMedia	MB071-1G	Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer	Qubit 2.0	NA	For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System	BioRad		Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc	HiMedia	SD170-5x50DS	For performing AST
Glacial Acetic Acid	HiMedia	AS119-500ML	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol	HiMedia	GRM1027-500ML	For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc	HiMedia	SD073	For performing AST
Kaiju Database	NA	NA	For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc	HiMedia	SD017-5x50DS	For performing AST
Kanamycin antibiotic powder	HiMedia	MB105-5G	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc	HiMedia	SD216-5VL	For performing AST
Luria Bertani broth	Himedia	M1245-500G	For enrichment of cultures
McFarland Standards	Himedia	R092-1No	To compare density of culture suspension
Molecular Biology water	HiMedia	TCL018-500ML	For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)	HiMedia	M173-500G	For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc	HiMedia	SD731-5x50DS	For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers	Xcelris	NA	For PCR amplication
R2A Agar, Modified	HiMedia	M1743	For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	For generation of scaffolds
Sequencer	Illumina platform (2 x 150 bp chemistry)	NA	Sequencing of amplified library
Sodium Chloride	HiMedia	TC046-500G	For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit	Xcelgen	NA	For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification	Kaiju ioinformatics tool	NA	For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)	NA	NA	For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc	HiMedia	SD278	For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc	HiMedia	SD039-5x50DS	For performing AST
Tris base	HiMedia	TC072-500G	For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder	HiMedia	CMS217	For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA - Not Applicable