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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.

Abstract

Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) sonda l'accessibilità dell'acido desossiribonucleico (DNA) utilizzando la trasposasi Tn5 iperattiva. Tn5 taglia e lega gli adattatori per il sequenziamento ad alta produttività all'interno di regioni di cromatina accessibili. Nelle cellule eucariotiche, il DNA genomico è impacchettato in cromatina, un complesso di DNA, istoni e altre proteine, che funge da barriera fisica al meccanismo trascrizionale. In risposta a segnali estrinseci, i fattori di trascrizione reclutano complessi di rimodellamento della cromatina per consentire l'accesso al meccanismo trascrizionale per l'attivazione genica. Pertanto, l'identificazione delle regioni aperte della cromatina è utile quando si monitorano le attività del potenziatore e del promotore genico durante eventi biologici come la progressione del cancro. Poiché questo protocollo è facile da usare e ha un basso requisito di input cellulare, ATAC-seq è stato ampiamente adottato per definire regioni aperte della cromatina in vari tipi di cellule, comprese le cellule tumorali. Per una corretta acquisizione dei dati, è necessario considerare diversi parametri durante la preparazione delle librerie ATAC-seq. Tra questi, la scelta del tampone di lisi cellulare, la titolazione dell'enzima Tn5 e il volume iniziale delle cellule sono cruciali per la preparazione della libreria ATAC-seq nelle cellule tumorali. L'ottimizzazione è essenziale per generare dati di alta qualità. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei metodi di ottimizzazione ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.

Introduzione

L'accessibilità della cromatina è un requisito chiave per la regolazione dell'espressione genica su scala genomica1. I cambiamenti nell'accessibilità della cromatina sono frequentemente associati a diversi stati patologici, incluso il cancro 2,3,4. Nel corso degli anni, sono state sviluppate numerose tecniche per consentire ai ricercatori di sondare il paesaggio della cromatina mappando le regioni di accessibilità della cromatina. Alcuni di essi includono DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7 e il focus di questo articolo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mappa le regioni accessibili impiegando una caratteristica chiave della DNasi, vale a dire la digestione preferenziale del DNA nudo privo di istoni e altre proteine come i fattori di trascrizione5. FAIRE-seq, simile a ChIP-seq, utilizza la reticolazione e la sonicazione della formaldeide, tranne che non è coinvolta alcuna immunoprecipitazione e le regioni prive di nucleosomi sono isolate mediante estrazione fenolo-cloroformio6. Il metodo MAPit utilizza una metiltransferasi GC per sondare la struttura della cromatinaalla risoluzione 7 della singola molecola. ATAC-seq si basa sulla trasposasi iperattiva, Tn58. La trasposasi Tn5 si lega preferenzialmente alle regioni aperte della cromatina e inserisce adattatori di sequenziamento in regioni accessibili. Tn5 opera attraverso un meccanismo "taglia e incolla" mediato dal DNA, in base al quale la trasposasi precaricata con adattatori si lega ai siti aperti della cromatina, taglia il DNA e lega gli adattatori8. Le regioni legate a Tn5 vengono recuperate mediante amplificazione PCR utilizzando primer che ricottura a questi adattatori. FAIRE-seq e DNase-seq richiedono una grande quantità di materiale di partenza (~ 100.000 celle a 225.000 celle) e una fase di preparazione della libreria separata prima del sequenziamento9. D'altra parte, il protocollo ATAC-seq è relativamente semplice e richiede un piccolo numero di cellule (<50.000 cellule)10. A differenza delle tecniche FAIRE-seq e DNase-seq, la preparazione della libreria di sequenziamento di ATAC-seq è relativamente semplice, poiché il campione di DNA isolato viene già taggato con gli adattatori di sequenziamento da Tn5. Pertanto, è necessaria solo la fase di amplificazione PCR con primer appropriati per completare la preparazione della libreria e non è necessario eseguire le fasi di elaborazione precedenti come la riparazione finale e la legatura dell'adattatore, risparmiando così tempo11. In secondo luogo, ATAC-seq evita la necessità di conversione, clonazione e amplificazione del bisolfito con primer specifici per regione richiesti per MAPit7. Grazie a questi vantaggi, ATAC-seq è diventato un metodo estremamente popolare per definire regioni di cromatina aperte. Sebbene il metodo ATAC-seq sia semplice, più passaggi richiedono l'ottimizzazione per ottenere dati di alta qualità e riproducibili. Questo manoscritto discute le procedure di ottimizzazione per la preparazione della libreria ATAC-seq standard, evidenziando in particolare tre parametri: (1) composizione del tampone di lisi, (2) concentrazione di Tn5 trasposasi e (3) numero di cellule. Inoltre, questo documento fornisce dati di esempio dalle condizioni di ottimizzazione utilizzando cellule epiteliali aderenti sia cancerose che non cancerose.

Protocollo

1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento

  1. Preparare la scorta tampone di lisi.
    NOTA: il buffer di isolamento nucleare ottimale può essere diverso per ogni tipo di cella. Si consiglia di testare sia il tampone ipotonico utilizzato nell'articolo originale8 che un tampone CSK12,13 per ciascun tipo di cellula utilizzando la colorazione blu tripano.
    1. Per preparare il tampone ipotonico (tampone Greenleaf), mescolare 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.
    2. Per preparare il tampone CSK, miscelare 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM saccarosio, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.
  2. Assicurarsi che le condizioni della coltura cellulare siano ottimali; Esaminare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che non ci siano livelli elevati di apoptosi.
  3. Accendere la centrifuga per farla raggiungere i 4 °C.

2. Prelievo cellulare

  1. Aspirare il mezzo da una coltura di cellule al <80% di confluenza. Le cellule vengono tipicamente coltivate in un piatto da 35 mm o 60 mm, in base al numero di cellule necessarie, ai trattamenti, ecc.
  2. Lavare le cellule con 1 mL o 3 mL di PBS.
  3. Aggiungere 0,5 ml o 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti (a seconda dei tipi di cellule). Utilizzare con cautela una pipetta da 1 mL per miscelare bene.
  4. Aggiungere 1 mL o 2 mL di supporto alla piastra e mescolare bene. Trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare le celle in una provetta da 15 ml per 3 minuti a 300 x g.
    NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle.
  5. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL o 2 mL di terreno.
    NOTA: È fondamentale preparare una soluzione unicellulare omogenea. Per i tessuti, un omogeneizzatore Dounce può essere utilizzato per omogeneizzare i tessuti e ridurre al minimo i grumi o gli aggregati di grandi cellule. Alcuni tessuti richiedono filtrazione (ad esempio, filtri cellulari) e / o selezione cellulare FACS per isolare le cellule vitali e ottenere una soluzione a singola cellula.
  6. Contare le celle usando un contatore di celle.
    NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un contatore automatico di celle (Table of Materials).
  7. Centrifugare il volume cellulare richiesto (ad esempio, un volume contenente 1 x 106 cellule in base alla conta cellulare) a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
  8. Risospendere il pellet cellulare contenente 1 x 106 cellule in 1 mL di PBS freddo.
    NOTA: Se il numero di cellule è inferiore a 1 x 10 6 cellule, diminuire il volume di PBS freddo per preparare la soluzione cellulare alla stessa concentrazione (1 x 106 cellule/ml).

3. Lisi cellulare

  1. Trasferire 25 μL (= 2,5 x 104 celle) in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml. Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare accuratamente il surnatante
    NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate.
  2. Aggiungere 25 μL di tampone di lisi e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato su e giù. Incubare su ghiaccio per 5 minuti
  3. Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare con cautela il surnatante.
    NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate.

4. Tagmentazione Tn5

  1. Risospendere immediatamente il pellet in 25 μL di miscela di reazione Tn5. La miscela di reazione Tn5 è la seguente: 12,5 μL di 2x tampone DNA di Tagmentazione (tampone TD), 1,25-5 μL di Tn5 trasposasi e 11,25-7,5 μL di acqua priva di nucleasi.
    NOTA: La concentrazione standard di Tn5 è di 2,5 μL per 2,5 x 104 cellule.
  2. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
    NOTA: Mescolare la soluzione ogni 10 minuti.

5. Purificazione del DNA

NOTA: La purificazione è necessaria prima dell'amplificazione. La purificazione del DNA viene eseguita utilizzando il kit di purificazione MinElute PCR (Table of Materials).

  1. Aggiungere 5 μL di acetato di sodio 3 M (pH 5,2).
  2. Aggiungere immediatamente 125 μL di Buffer PB e mescolare bene.
  3. Seguire il protocollo del kit di purificazione PCR a partire dal passaggio 2.
    1. Posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 ml.
    2. Applicare il campione alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.
    3. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.
    4. Aggiungere 750 μL di Buffer PE alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.
    5. Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.
    6. Centrifugare la colonna di centrifuga per 5 minuti per asciugare completamente la membrana.
    7. Scartare il flusso passante e posizionare la colonna di rotazione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.
    8. Eluire i frammenti di DNA con 10 μL di Buffer EB.
    9. Lasciare riposare la colonna per 1 minuto a RT.
    10. Centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT per eluire il DNA.

6. Amplificazione PCR

NOTA: l'amplificazione PCR dei DNA trasposti (taggati) è necessaria per il sequenziamento. In questo esempio sono stati utilizzati adattatori del kit Nextera (Table of Materials). I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.

  1. Impostare la seguente reazione PCR in provette da 200 μL di PCR (50 μL per ciascun campione). La miscela di reazione PCR è la seguente: 10 μL di DNA eluito (fase 5.), 2,5 μL di 25 mM Adapter 1, 2,5 μL di 25 mM Adapter 2, 25 μL di 2x PCR master mix e 10 μL di acqua priva di nucleasi
  2. Eseguire il programma di amplificazione PCR parte 1 (Tabella 2).
    NOTA: Per l'amplificazione iniziale, le stesse condizioni vengono utilizzate per tutti i campioni che utilizzano un termociclatore standard.
  3. QPCR in tempo reale (totale di 14,5 μL per campione)
    1. Utilizzando 5 μL del prodotto dall'amplificazione PCR parte 1 (fase 6.2.), impostare la seguente reazione, questa volta includendo SYBR gold e il rilevamento in una macchina PCR in tempo reale.
    2. Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 5 μL di prodotto PCR dalla fase 6.2., 0,75 μL di oro SYBR (1000x diluito), 5 μL di 2x miscela master PCR e 3,75 μL di acqua priva di nucleasi.
      NOTA: I numeri di ciclo precisi per l'amplificazione della libreria prima di raggiungere la saturazione per ciascun campione sono determinati da qPCR (Tabella 3) per ridurre la distorsione GC e dimensionale nella PCR10. SYBR Gold è stato diluito con acqua priva di nucleasi. Per ottenere la soluzione diluita, 1 μL di SYBR Gold (concentrazione di riserva 10.000x) è stato aggiunto a 999 μL di acqua priva di nucleasi. Il tempo di esecuzione di RT-qPCR menzionato nella Tabella 3 è di circa 60 minuti.
  4. Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione del passaggio 6.3.
    1. Numero di cicli = 1/4 di intensità di fluorescenza massima (satura) (tipicamente 3 o 4 cicli PCR)
  5. Programma di amplificazione PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabella 4): Una volta determinato il numero di ciclo, impostare PCR con cicli aggiuntivi calcolati al punto 6.4.1. Ad esempio, se il numero di cicli calcolato è 3, impostare 3 cicli nel programma seguente. I cicli totali sarebbero 8 (5 nel passo 6.2., più 3 cicli aggiuntivi nel passo 6.5.)

7. Purificazione delle perline

NOTA: Qui sono state utilizzate perline AMPure XP (Table of Materials).

  1. Ai prodotti PCR amplificati nella fase precedente, aggiungere 150 μL di perline a RT.
    NOTA: Le perline AMPure fatte in casa14 possono essere utilizzate in questo processo.
  2. Incubare per 15 minuti a RT.
  3. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per 5 minuti.
  4. Rimuovere con attenzione il surnatante.
  5. Lavare le perle con 200 μL di etanolo all'80%.
    NOTA: l'80% di etanolo deve essere preparato fresco.
  6. Ripetere il passaggio 7.4.
  7. Rimuovere completamente l'etanolo.
  8. Asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a RT.
  9. Risospendere con 50 μL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Ripetere la purificazione delle perline (passaggi 7.1.-7.9.) per ridurre ulteriormente la contaminazione del primer.

8. Concentrazione del DNA e controllo di qualità

  1. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un kit di quantificazione dell'acido nucleico (Table of Materials).
  2. Controllare i frammenti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel utilizzando SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% gel di agarosio) o un sistema di elettroforesi automatizzato (ad esempio, TapeStation, bioanalizzatore).

9. Sequenziamento

  1. Eseguire il sequenziamento ad alta produttività utilizzando i campioni di DNA amplificati12,13.
    NOTA: i campioni di DNA amplificato sono pronti per il sequenziamento ad alta produttività. Per conservare le informazioni sui frammenti di DNA nucleosomiali, si raccomanda il sequenziamento a estremità accoppiata rispetto al sequenziamento a estremità singola. Entrambe le estremità dei frammenti di DNA indicano dove si lega la trasposasi. Per mappare le regioni aperte della cromatina, 30 milioni di letture/campione sono in genere sufficienti.

10. Analisi dei dati

  1. Filtraggio dei dati in base alla qualità della chiamata di base: imposta il punteggio medio minimo di qualità di base su 20 (precisione del 99%).
  2. Rifilatura adattatore: rimuovere le sequenze dell'adattatore utilizzando uno strumento appropriato.
    NOTA: lo strumento avvolgitore Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) è stato utilizzato per rimuovere le sequenze dell'adattatore. Per le librerie ATAC-seq preparate da Illumina Tn5, la seguente sequenza viene utilizzata come sequenza adattatore: CTGTCTCTTATACACATCT. La lunghezza minima della sequenza per riconoscere la contaminazione dell'adattatore è impostata su 5.
  3. Mappatura del genoma: mappare le letture al genoma appropriato con Bowtie utilizzando i seguenti parametri "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Di seguito è riportato un esempio di qualità della mappatura delle cellule di carcinoma mammario basale MDA-MB-231:
    Leggi con almeno un allineamento segnalato: 52,79%
    Letture che non sono riuscite ad allinearsi: 13,10%
    Letture con allineamenti soppressi a causa di -m: 34,11%
  4. Deduplicazione: contrassegnare i duplicati PCR con gli strumenti Picard16.
  5. Generazione di un file di copertura del genoma per la visualizzazione dei dati: convertire le letture accoppiate deduplicate in frammenti di lettura single-end. Le tracce di copertura del genoma sono ottenute utilizzando genomeCoverageBed da bedtools17.

Risultati

Per ottenere dati ATAC-seq di successo e di alta qualità, è importante ottimizzare le condizioni sperimentali. La preparazione della libreria ATAC-seq può essere suddivisa nelle cinque fasi principali (Figura 1), vale a dire lisi cellulare, tagmentazione (frammentazione e inserimento dell'adattatore da parte di Tn5), purificazione del DNA genomico, amplificazione PCR e analisi dei dati. Come processo iniziale, il tampone di lisi cellulare (isolamento nucleare) deve essere prima ottimizzat...

Discussione

ATAC-seq è stato ampiamente utilizzato per mappare regioni di cromatina aperte e attive. La progressione delle cellule tumorali è spesso guidata da alterazioni genetiche e riprogrammazione epigenetica, con conseguente alterazione dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica. Un esempio di questa riprogrammazione è visto durante la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e il suo processo inverso, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che sono noti per essere processi chiave di riprogrammazio...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo documento.

Riconoscimenti

Riconosciamo con gratitudine la struttura UND Genomics Core per l'eccezionale assistenza tecnica.

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] e dai fondi start-up forniti dalla University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [to M.T.].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

Riferimenti

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