저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

초록

고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용한 트랜스포자제 접근 염색질에 대한 분석은 과민성 Tn5 트랜스포아제를 사용하여 디옥시리보 핵산(DNA) 접근성을 프로브합니다. Tn5는 접근 가능한 염색질 영역 내에서 고처리량 시퀀싱을 위해 어댑터를 절단하고 연결합니다. 진핵 세포에서 게놈 DNA는 DNA, 히스톤 및 기타 단백질의 복합체인 염색질로 포장되어 전사 기계에 대한 물리적 장벽 역할을 합니다. 외적 신호에 반응하여, 전사 인자는 유전자 활성화를 위한 전사 기계에 접근할 수 있도록 염색질 리모델링 복합체를 모집합니다. 따라서, 개방된 염색질 영역을 확인하는 것은 암 진행과 같은 생물학적 사건 동안 인핸서 및 유전자 프로모터 활성을 모니터링할 때 유용하다. 이 프로토콜은 사용하기 쉽고 세포 입력 요구 사항이 낮기 때문에 ATAC-seq는 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 열린 염색질 영역을 정의하는 데 널리 채택되었습니다. 성공적인 데이터 수집을 위해서는 ATAC-seq 라이브러리를 준비할 때 몇 가지 파라미터를 고려해야 합니다. 그 중 세포 용해 완충액의 선택, Tn5 효소의 적정 및 세포의 시작 부피는 암세포에서 ATAC-seq 라이브러리 준비에 중요합니다. 최적화는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적입니다. 여기에서는 상피 세포 유형에 대한 ATAC-seq 최적화 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

서문

염색질 접근성은 게놈전체 규모에서 유전자 발현을 조절하기 위한 핵심 요구 사항입니다1. 염색질 접근성의 변화는 종종 암 2,3,4를 포함한 여러 질병 상태와 관련이 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들이 염색질 접근성 영역을 매핑하여 염색질 환경을 조사할 수 있도록 수많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 일부에는 DNase-seq(DNase I 과민성 부위 시퀀싱)5, FAIRE-seq(조절 요소의 포름알데히드 보조 분리)6, MAPit(개별 템플릿에 대한 메틸트랜스퍼라제 접근성 프로토콜)7 및 이 논문의 초점인 ATAC-seq(전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 분석)8이 포함됩니다. DNase-seq는 DNase의 주요 특징, 즉 히스톤 및 전사 인자5와 같은 기타 단백질이 없는 네이키드 DNA의 우선적 소화를 사용하여 접근 가능한 영역을 매핑합니다. CHIP-seq와 유사한 FAIRE-seq는 면역 침전이 관여하지 않는 것을 제외하고는 포름 알데히드 가교 및 초음파 처리를 사용하며 뉴 클레오 솜이없는 영역은 페놀-클로로포름 추출6에 의해 분리됩니다. MAPit 방법은 GC 메틸트랜스퍼라제를 사용하여 단일 분자 분해능7에서 염색질 구조를 프로브합니다. ATAC-seq는 과민성 전이 효소 Tn58에 의존합니다. Tn5 트랜스포아제는 개방 염색질 영역에 우선적으로 결합하고 시퀀싱 어댑터를 접근 가능한 영역에 삽입합니다. Tn5는 DNA-매개 "잘라내기 및 붙여넣기" 메커니즘을 통해 작동하며, 이에 의해 어댑터가 미리 로드된 트랜스포아제는 염색질 부위를 개방하고, DNA를 절단하고, 어댑터(8)를 결찰한다. Tn5 결합 영역은 이들 어댑터에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 회수된다. FAIRE-seq 및 DNase-seq는 시퀀싱 전에 많은 양의 출발 물질(~100,000 세포 내지 225,000 세포)과 별도의 라이브러리 준비 단계를 필요로 합니다9. 반면에 ATAC-seq 프로토콜은 비교적 간단하며 적은 수의 셀(<50,000개 셀)10이 필요합니다. FAIRE-seq 및 DNase-seq 기술과 달리 ATAC-seq의 시퀀싱 라이브러리 준비는 분리된 DNA 샘플이 이미 Tn5에 의해 시퀀싱 어댑터로 태그되고 있기 때문에 비교적 쉽습니다. 따라서, 라이브러리 준비를 완료하기 위해 적절한 프라이머를 사용한 PCR 증폭 단계만이 필요하며, 최종 수리 및 어댑터 라이게이션과 같은 사전 처리 단계가 수행될 필요가 없으므로, 시간(11)을 절약할 수 있다. 둘째, ATAC-seq는 MAPit7에 필요한 영역 특이적 프라이머를 사용한 중아황산염 전환, 클로닝 및 증폭의 필요성을 방지합니다. 이러한 장점으로 인해 ATAC-seq는 개방 염색질 영역을 정의하는 데 매우 인기 있는 방법이 되었습니다. ATAC-seq 방법은 간단하지만 고품질의 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 여러 단계를 최적화해야 합니다. 이 원고는 표준 ATAC-seq 라이브러리 준비에 대한 최적화 절차에 대해 논의하며, 특히 (1) 용해 완충액 조성, (2) Tn5 트랜스포아제 농도 및 (3) 세포 수의 세 가지 매개변수를 강조합니다. 또한, 이 논문은 암성 및 비암성 부착성 상피 세포를 모두 사용한 최적화 조건의 예제 데이터를 제공합니다.

프로토콜

1. 실험 시작 전 준비

  1. 용해 완충액을 준비하십시오.
    참고: 최적의 핵 분리 버퍼는 각 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 트리판 블루 염색을 사용하여 각 세포 유형에 대해 원본 논문8에 사용된 저장성 완충액과 CSK 완충액12,13을 모두 테스트하는 것이 좋습니다.
    1. 저장성 완충액(그린리프 완충액)을 제조하기 위해, 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 및 0.1% NP-40을 혼합한다.
    2. CSK 완충액을 제조하기 위해, 10 mM 파이프 pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM 수크로스, 3 mMMgCl2, 및 0.1% 트리톤 X-100을 혼합한다.
  2. 세포 배양 조건이 최적인지 확인하십시오. 광학 현미경으로 세포를 검사하여 세포 사멸 수준이 높지 않은지 확인하십시오.
  3. 원심 분리기를 켜서 4 ° C에 도달하도록합니다.

2. 세포 수확

  1. <80% 컨플루언시로 세포 배양에서 배지를 흡인합니다. 세포는 일반적으로 필요한 세포 수, 처리 등에 따라 35mm 또는 60mm 접시에서 성장합니다.
  2. 세포를 1mL 또는 3mL의 PBS로 세척합니다.
  3. 0.5mL 또는 1mL의 트립신을 넣고 2-3분 동안 배양합니다(세포 유형에 따라 다름). 잘 섞기 위해 1mL 피펫을 조심스럽게 사용하십시오.
  4. 1mL 또는 2mL의 배지를 플레이트에 넣고 잘 섞습니다. 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 15mL 튜브에서 세포를 300 x g에서 3분 동안 원심분리합니다 .
    알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다.
  5. 배지를 흡인하고 1mL 또는 2mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
    참고: 균질한 단일 셀 용액을 준비하는 것이 중요합니다. 조직의 경우 Dounce 균질화를 사용하여 조직을 균질화하고 큰 세포 덩어리 또는 응집체를 최소화할 수 있습니다. 일부 조직은 생존 가능한 세포를 분리하고 단일 세포 용액을 얻기 위해 여과 (예를 들어, 세포 스트레이너) 및/또는 FACS 세포 분류를 필요로 한다.
  6. 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.
    참고: 이 연구에서는 자동 셀 카운터(재료 표)를 사용했습니다.
  7. 실온(RT)에서 3분 동안 300 x g에서 필요한 셀 부피(예: 셀 수를 기준으로 1 x 106 셀을 포함하는 부피)를 원심분리합니다.
  8. 1 mL의 차가운 PBS에 1 x 106 세포를 함유하는 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
    참고: 셀 번호가 1 x 10 6 셀 미만인 경우 차가운 PBS 부피를 줄여 동일한 농도(1 x 106 cells/mL)로 셀 용액을 준비합니다.

3. 세포 용해

  1. 25 μL(= 2.5 x 104 개 세포)를 새 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 폐기합니다.
    알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 세포가 버려지지 않도록 약 3μL의 상청액을 남겨 둡니다.
  2. 25μL의 용해 완충액을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 얼음 위에서 5분간 배양
  3. 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 버린다.
    알림: 셀 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 세포가 버려지지 않도록 약 3μL의 상청액을 남겨 둡니다.

4. Tn5 태그

  1. 펠렛을 25 μL의 Tn5 반응 혼합물에 즉시 재현탁시킨다. Tn5 반응 혼합물은 다음과 같다: 12.5 μL의 2x 태그멘테이션 DNA 완충액 (TD 완충액), 1.25-5 μL의 Tn5 트랜스포자제, 및 11.25-7.5 μL의 뉴클레아제-비함유 물.
    참고: Tn5의 표준 농도는 2.5 x 104 셀의 경우 2.5μL입니다.
  2. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    알림: 10분마다 용액을 혼합하십시오.

5. DNA 정제

알림: 증폭하기 전에 정제가 필요합니다. DNA 정제는 MinElute PCR 정제 키트(재료 표)를 사용하여 수행됩니다.

  1. 5 μL의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2)을 첨가하십시오.
  2. 즉시 125μL의 버퍼 PB를 추가하고 잘 혼합합니다.
  3. 2단계부터 PCR 정제 키트 프로토콜을 따릅니다.
    1. 스핀 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
    2. 샘플을 스핀 컬럼에 적용하고 RT에서 17,900 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    3. 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
    4. 750μL의 버퍼 PE를 스핀 컬럼에 추가하고 RT에서 17,900 x g 로 1분 동안 원심분리합니다.
    5. 플로우 스루를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
    6. 스핀 컬럼을 5분 동안 원심분리하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다.
    7. 플로우스루를 버리고 스핀 컬럼을 새 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
    8. 10 μL의 버퍼 EB로 DNA 단편을 용리합니다.
    9. 컬럼을 RT에서 1분 동안 그대로 두십시오.
    10. RT에서 17,900 x g 로 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다.

6. PCR 증폭

참고: 전치된(태깅된) DNA의 PCR 증폭은 시퀀싱에 필요합니다. Nextera 키트 어댑터(재료 표)가 이 예에서 사용되었습니다. 본 연구에 사용된 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.

  1. 200 μL PCR 튜브(각 샘플에 대해 50 μL)에서 다음 PCR 반응을 설정합니다. PCR 반응 혼합물은 다음과 같다: 용리된 DNA 10 μL (단계 5.), 25 mM 어댑터 1 2.5 μL, 25 mM 어댑터 2 2.5 μL, 2x PCR 마스터 믹스 25 μL, 및 뉴클레아제 무함유 물 10 μL
  2. PCR 증폭 프로그램 파트 1(표 2)을 수행한다.
    알림: 초기 증폭의 경우 표준 열 순환기를 사용하는 모든 샘플에 동일한 조건이 사용됩니다.
  3. 실시간 qPCR(샘플당 총 14.5μL)
    1. PCR 증폭 파트 1(단계 6.2)로부터의 생성물 5 μL를 사용하여, 이번에 SYBR 금을 포함하고 실시간 PCR 기계에서 검출하는 다음의 반응을 설정하였다.
    2. 5 μL의 PCR 생성물을 단계 6.2로부터의 PCR 생성물, 0.75 μL의 SYBR 금 (1000x 희석), 5 μL의 2x PCR 마스터 믹스, 및 3.75 μL의 뉴클레아제-없는 물.
      참고: 각 샘플에 대해 포화에 도달하기 전에 라이브러리 증폭을 위한 정확한 주기 번호는 PCR10에서 GC 및 크기 편향을 줄이기 위해 qPCR(표 3)에 의해 결정됩니다. SYBR 골드를 뉴클레아제가 없는 물로 희석하였다. 희석된 용액을 만들기 위해, 1 μL의 SYBR Gold (스톡 농도 10,000x)를 999 μL의 뉴클레아제-없는 물에 첨가하였다. 표 3에 언급된 RT-qPCR의 실행 시간은 약 60분이다.
  4. 6.3단계의 실행 파라미터를 사용하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 결정한다.
    1. 사이클 수 = 1/4 최대(포화) 형광 강도(일반적으로 3 또는 4 PCR 사이클)
  5. PCR 증폭 프로그램 파트 2 (부피 = 45 μL; 표 4): 주기 번호를 결정한 후 6.4.1단계에서 계산된 추가 주기로 PCR을 설정합니다. 예를 들어 계산된 주기 번호가 3인 경우 아래 프로그램에서 3주기를 설정합니다. 총 사이클은 8(6.2단계에서 5, 6.5단계에서 3개의 추가 사이클)입니다.

7. 구슬 정화

참고: 여기에서는 AMPure XP(재료 표) 비드가 사용되었습니다.

  1. 이전 단계에서 증폭된 PCR 산물에 RT에서 150μL의 비드를 추가합니다.
    참고: 이 공정에는 수제 AMPure 비드14 를 사용할 수 있습니다.
  2. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
  3. 튜브를 마그네틱 스탠드에 5분 동안 놓습니다.
  4. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
  5. 비드를 200μL의 80% 에탄올로 세척한다.
    알림: 80 % 에탄올은 신선하게 준비해야합니다.
  6. 7.4단계를 반복합니다.
  7. 에탄올을 완전히 제거하십시오.
  8. RT에서 10분 동안 샘플을 공기 건조합니다.
  9. 50 μL의 용리 완충액(10 mM Tris-HCL pH 8.0)으로 재현탁시킨다.
  10. 비드 정제(단계 7.1.-7.9)를 반복하여 프라이머 오염을 더욱 최소화합니다.

8. DNA 농도 및 품질 검사

  1. DNA 농도는 핵산 정량 키트(Table of Materials)를 이용하여 측정한다.
  2. SYBR Gold (0.5x TBE, 1.5 % 아가 로스 겔) 또는 자동 전기 영동 시스템 (예 : TapeStation, 바이오 분석기)을 사용하여 겔 전기 영동으로 증폭 된 DNA 단편을 확인합니다.

9. 시퀀싱

  1. 증폭된 DNA 샘플(12,13)을 사용하여 고처리량 시퀀싱을 수행한다.
    참고: 증폭된 DNA 샘플은 고처리량 시퀀싱을 위해 준비되었습니다. 뉴 클레오솜 DNA 단편 정보를 유지하려면 단일 말단 시퀀싱보다 쌍단 시퀀싱이 권장됩니다. DNA 단편의 양쪽 끝은 트랜스포아제가 결합하는 위치를 나타냅니다. 열린 염색질 영역을 매핑하려면 일반적으로 3천만 번의 읽기/샘플로 충분합니다.

10. 데이터 분석

  1. 기본 통화 품질에 기반한 데이터 필터링: 최소 평균 기본 품질 점수를 20(99% 정확도)으로 설정합니다.
  2. 어댑터 트리밍: 적절한 도구를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거합니다.
    참고: Trim Galore 래퍼 도구(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 어댑터 시퀀스를 제거했습니다. Illumina Tn5에 의해 준비된 ATAC-seq 라이브러리의 경우, 다음 시퀀스가 어댑터 시퀀스로 사용됩니다: CTGTCTCTTATACACATCT. 어댑터 오염을 인식하는 최소 시퀀스 길이는 5로 설정됩니다.
  3. 게놈 매핑: 다음 매개 변수 "-I 0 -X 2000 -m 1"15를 사용하여 Bowtie를 사용하여 판독값을 적절한 게놈에 매핑합니다. MDA-MB-231 기저 유방암 세포의 매핑 품질의 예는 다음과 같습니다.
    하나 이상의 보고된 정렬이 있는 읽기: 52.79%
    정렬에 실패한 읽기: 13.10%
    -m으로 인해 정렬이 억제된 읽기: 34.11%
  4. 중복 제거: Picard 도구로 PCR 중복 표시16.
  5. 데이터 시각화를 위한 게놈 커버리지 파일 생성: 중복 제거된 쌍단 읽기를 단일 끝 읽기 조각으로 변환합니다. 게놈 커버리지 트랙은 침대 도구17에서 게놈 커버리지 베드를 사용하여 얻습니다.

결과

성공적이고 고품질의 ATAC-seq 데이터를 얻으려면 실험 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. ATAC-seq 라이브러리 준비는 세포 용해, 태그먼트(Tn5에 의한 단편화 및 어댑터 삽입), 게놈 DNA 정제, PCR 증폭 및 데이터 분석의 5가지 주요 단계(그림 1)로 분리할 수 있습니다. 초기 과정으로, 세포 용해 (핵 분리) 완충액은 먼저 각 세포 유형에 대해 최적화되어야합니다. 원래의 ATAC-seq 논?...

토론

ATAC-seq는 개방 및 활성 염색질 영역을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다. 암세포 진행은 종종 유전적 변형과 후성유전학적 재프로그래밍에 의해 주도되어 염색질 접근성과 유전자 발현이 변경됩니다. 이러한 재프로그래밍의 예는 상피-중간엽 전이(EMT) 및 이의 역과정인 중간엽-상피로의 전이(MET) 동안 볼 수 있으며, 이는 종양 전이 동안 주요 세포 재프로그래밍 과정으로 알려져 있다(

공개

저자는이 논문에 설명 된 연구와 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

UND 유전체학 핵심 시설에 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.

이 연구는 국립 보건원 [P20GM104360에서 M.T., P20 GM104360에서 A.D.]과 노스 다코타 대학교 의과 대학 및 건강 과학 대학 생물 의학과에서 제공 한 창업 기금에서 자금을 지원했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

참고문헌

  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
  16. . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유