Collecte de sperme et analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes dans le modèle téléostéen japonais Medaka (Oryzias latipes)

Résumé

Cet article décrit deux méthodes rapides et efficaces pour collecter le sperme du petit poisson modèle medaka (Oryzias latipes), ainsi qu’un protocole pour évaluer de manière fiable la qualité du sperme à l’aide de l’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA).

Résumé

Le médaka japonais (Oryzias latipes) est un poisson téléostéen et un modèle vertébré émergent pour la recherche en écotoxicologie, développement, génétique et physiologie. Medaka est également largement utilisé pour étudier la reproduction des vertébrés, qui est une fonction biologique essentielle car elle permet à une espèce de se perpétuer. La qualité du sperme est un indicateur important de la fertilité masculine et, par conséquent, du succès de la reproduction. Les techniques d’extraction du sperme et d’analyse du sperme sont bien documentées pour de nombreuses espèces, y compris les poissons téléostéens. La collecte de sperme est relativement simple chez les gros poissons, mais peut être plus compliquée chez les petits poissons modèles car ils produisent moins de spermatozoïdes et sont plus délicats. Cet article décrit donc deux méthodes de collecte de sperme chez le petit poisson modèle, le médaka japonais: la dissection des testicules et le massage abdominal. Cet article démontre que les deux approches sont réalisables pour le medaka et montre que le massage abdominal peut être effectué un nombre répété de fois car les poissons se remettent rapidement de la procédure. Cet article décrit également un protocole d’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes en medaka pour évaluer objectivement plusieurs indicateurs importants de la qualité du sperme medaka (motilité, progressivité, durée de motilité, concentration relative). Ces procédures, spécifiées pour ce modèle utile de petits téléostéens, amélioreront grandement la compréhension des facteurs environnementaux, physiologiques et génétiques influençant la fertilité chez les mâles vertébrés.

Introduction

Le medaka japonais est un petit poisson téléostéen d’eau douce pondeur originaire d’Asie de l’Est. Medaka est devenu un excellent système modèle de vertébrés pour l’écotoxicologie, la génétique du développement, la génomique et les études de biologie et de physiologie évolutives ^1,2. Semblables au poisson zèbre populaire, ils sont relativement faciles à élever et très résistants à de nombreuses maladies courantes^des poissons ^1,2. L’utilisation de medaka comme modèle présente plusieurs avantages, notamment un temps de génération court, des embryons transparents ^1,2 et un génome séquencé³. Contrairement au poisson zèbre, le médaka a un gène déterminant le sexe 4 ainsi qu’une tolérance élevée à la température (de⁴ à 40 °C) et à la salinité (espèces euryhalines)⁵. En outre, de nombreux outils génétiques et anatomiques, ainsi que les protocoles 6,7,8,9,10,11,12^, ont été développés en medaka pour faciliter l’étude de sa biologie.

La reproduction est une fonction physiologique essentielle car elle permet à une espèce de se perpétuer. La reproduction des vertébrés nécessite une myriade d’événements orchestrés avec précision, y compris la production d’ovocytes chez les femelles et la production de spermatozoïdes chez les mâles. Les spermatozoïdes sont des cellules uniques, produites par le processus complexe de la spermatogenèse, dans lequel un certain nombre de points de contrôle sont en place pour garantir la livraison d’un produit de haute qualité¹³. La qualité des gamètes est devenue une priorité dans les études sur l’aquaculture et les populations de poissons en raison de son impact sur le succès de la fertilisation et la survie des larves. La qualité du sperme est donc un indicateur important de la fertilité masculine chez les vertébrés.

Trois facteurs utiles pour évaluer la qualité du sperme de poisson sont la motilité, la progressivité et la longévité. Le pourcentage de motilité et la motilité progressive sont des indicateurs courants de la qualité du sperme, car un mouvement progressif est nécessaire et fortement corrélé avec le succès de la fécondation^14,15. La durée du mouvement est également un indicateur important chez les poissons, car les spermatozoïdes restent complètement mobiles pendant moins de 2 minutes chez la plupart des espèces de téléostéens et la trajectoire des spermatozoïdes est généralement moins linéaire que chez les^{mammifères15}. Cependant, de nombreuses études évaluant la motilité des spermatozoïdes dans le passé reposaient sur des méthodes subjectives ou semi-quantitatives d’analyse des spermatozoïdes^15,16. Par exemple, la motilité des spermatozoïdes dans le médaka a été estimée dans le passé visuellement au microscope¹⁷. Il a également été estimé en enregistrant le mouvement des spermatozoïdes et en utilisant un logiciel d’imagerie pour fusionner les images et mesurer la trajectoire de nage et la vitesse^18,19,20. De telles approches manquent souvent de robustesse, fournissant des résultats différents selon la personne effectuant l’analyse^15,21.

L’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA) a été initialement développée pour les mammifères. CASA est une méthode quantitative rapide pour évaluer la qualité du sperme en enregistrant et en mesurant la vitesse et la trajectoire de manière automatisée¹⁵. Chez les poissons, il a été utilisé chez différentes espèces pour surveiller les effets de plusieurs polluants de l’eau sur la qualité du sperme, pour identifier des progéniteurs intéressants pour améliorer le stock de géniteurs, pour améliorer l’efficacité de la cryoconservation et du stockage, et pour optimiser les conditions de fécondation¹⁵. Par conséquent, il s’agit d’un outil puissant pour évaluer de manière fiable la qualité des spermatozoïdes chez différentes espèces de vertébrés. Cependant, en raison de la diversité importante des stratégies de reproduction entre les poissons, le sperme des poissons téléostéens diffère de celui des mammifères et d’une espèce de poisson à l’autre. Les poissons téléostéens, qui fécondent principalement les œufs à l’extérieur en libérant des gamètes dans l’eau, ont des spermatozoïdes très concentrés dont la structure est relativement simple sans acrosome, contrairement aux mammifères, qui fertilisent à l’intérieur et n’ont donc pas à compenser la dilution dans l’eau, mais doivent résister à des fluides plus visqueux¹⁴. De plus, les spermatozoïdes de la plupart des poissons se déplacent rapidement mais sont complètement mobiles pendant moins de 2 minutes après l’activation, bien qu’il y ait plusieurs exceptions^15,22. Étant donné que la motilité peut diminuer rapidement chez la plupart des poissons, il convient d’être extrêmement prudent avec le moment de l’analyse après l’activation lors de la détermination d’un protocole d’analyse du sperme pour les poissons.

La reproduction est l’un des domaines de la biologie dans lequel les téléostéens et les médakas ont été largement utilisés comme organismes modèles. En effet, les mâles medaka montrent des comportements reproductifs et sociaux intéressants, tels que la garde du partenaire^23,24. De plus, plusieurs lignées transgéniques existent pour étudier le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez cette espèce^25,26,27. L’échantillonnage du sperme, une procédure relativement simple chez les gros poissons, peut être plus compliqué chez les petits poissons modèles car ils produisent moins de spermatozoïdes et sont plus délicats. Pour cette raison, la plupart des études impliquant l’échantillonnage de sperme dans medaka extraient de la laitance (sperme de poisson) par écrasement de testicules disséqués 17,28,29,30. Quelques études utilisent également un massage abdominal modifié pour exprimer la laitance directement dans le milieu activateur^18,19,20; Cependant, avec cette méthode, il est difficile de visualiser la quantité et la couleur de la laitance extraite. Chez le poisson zèbre, le massage abdominal est couramment utilisé pour exprimer la laitance, qui est immédiatement recueillie dans un tube capillaire^31,32,33. Cette méthode permet d’estimer le volume de laitance, ainsi que d’observer la couleur de l’éjaculat, qui est un indicateur rapide et simple de la qualité du sperme^32,33. Par conséquent, il manque un protocole clair et bien décrit pour la collecte et l’analyse du sperme pour medaka.

Cet article décrit donc deux méthodes de collecte de sperme chez le petit modèle de poisson japonais médaka : la dissection testiculaire et le massage abdominal avec tubes capillaires. Il démontre que les deux approches sont réalisables pour le medaka et montre que le massage abdominal peut être effectué un nombre répété de fois car le poisson se remet rapidement de la procédure. Il décrit également un protocole d’analyse assistée par ordinateur du sperme dans medaka pour mesurer de manière fiable plusieurs indicateurs importants de la qualité du sperme medaka (motilité, progressivité, longévité et concentration relative de spermatozoïdes). Ces procédures, spécifiées pour ce modèle utile de petits téléostéens, amélioreront grandement la compréhension des facteurs environnementaux, physiologiques et génétiques influençant la fertilité chez les mâles vertébrés.

Protocole

Toutes les expériences et manipulations des animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être animal expérimental à l’Université norvégienne des sciences de la vie (NMBU). Les expériences ont été réalisées en utilisant des medakas japonais mâles adultes (âgés de 6 à 9 mois) (souche Hd-rR) élevés à la NMBU (Ås, Norvège). Les méthodes ont également été brièvement testées sur un medaka japonais mâle (souche CAB) âgé de 9 mois élevé à l’Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement (INRAE, Rennes, France).

1. Préparation de l’instrument et de la solution

1. Préparer la solution mère d’anesthésique (0,6% de tricaïne).
   1. Diluer 0,6 g de tricaïne (MS-222) dans 100 mL de 10x Phosphate Buffer Saline (PBS).
   2. Aliquote 2 mL de la solution mère d’anesthésique dans 50 tubes en plastique de 2 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation pour l’anesthésie ou l’euthanasie.
2. Préparer l’eau de récupération (solution de chlorure de sodium [NaCl] à 0,9 %).
   1. Ajouter 27 g de NaCl dans 3 L d’eau d’aquarium.
   2. Conserver la solution à température ambiante (TR) jusqu’à utilisation.
3. Ajustez le milieu d’activation si nécessaire (solution saline équilibrée de Hank [HBSS]).
   NOTE: HBSS peut être acheté dans le commerce ou fabriqué en laboratoire (Tableau des matériaux).
   1. Mesurez le pH de l’HBSS à l’aide d’un pH-mètre. Ajustez le pH si nécessaire, en utilisant de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium, de sorte que le pH final soit de 7,1 à 7,3.
   2. Mesurer l’osmolalité de l’HBSS à l’aide d’un osmomètre pour les rapports futurs.
      NOTE: La gamme sur le produit commercial est de 266-294 mOsmol / kg; dans la présente étude, l’osmolalité était de 287 mOsmol/kg. Il peut être dilué avec de l’eau distillée pour réduire l’osmolalité si vous le souhaitez, mais cela n’est pas nécessaire car il n’y a pas une grande différence dans l’activation des spermatozoïdes medaka dans 150-300 mOsmol / kg HBSS.
   3. Conservez la solution chez RT jusqu’à utilisation.
4. Préparez l’éponge de maintien.
   1. Coupez une éponge douce pour l’adapter parfaitement dans une boîte de Pétri.
   2. Coupez une ligne droite au milieu de l’éponge qui est assez longue pour recevoir le poisson (3-4 cm) et environ 1 cm de profondeur (Figure 1A). Cette fente dans l’éponge maintiendra le côté ventral du poisson vers le haut pour exposer le cloaque.

2. Collecte de sperme

REMARQUE: La collecte de sperme peut être réalisée par deux méthodes différentes: massage abdominal ou dissection testiculeuse.

1. Collecte de sperme par massage abdominal
   1. Préparer une solution anesthésique à 0,03 % en diluant un tube de bouillon de Tricaïne (0,6 %) dans 38 mL d’eau d’aquarium dans un récipient en verre de 100 mL.
   2. Préparez les instruments, y compris les pinces lisses à extrémité émoussée et une micropipette en verre étalonné jetable de 10 μL et un tube d’aspiration (Figure 1A). Humidifier l’éponge de maintien préparée à l’étape 1.4 avec la solution anesthésique.
   3. Préparer les tubes avec 36 μL de la solution d’activation pour une analyse immédiate. Préchauffer la solution activatrice dans un bain-marie ou un incubateur réglé à 27 °C pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Bien que les échantillons puissent être analysés à partir de poissons individuels, les variations individuelles peuvent être réduites en regroupant des échantillons de plusieurs mâles dans la même solution d’activation. Lorsque vous mettez en commun des échantillons de plusieurs poissons, utilisez 36 μL de solution activatrice par poisson. Cette dilution peut devoir être ajustée en fonction de la souche ou des conditions d’élevage du médaka utilisé, car ces facteurs peuvent avoir un impact sur la concentration et le volume des spermatozoïdes. Le programme CASA indiquera si la concentration est trop élevée pour identifier les spermatozoïdes.
   4. Anesthésiez le poisson en le mettant dans une solution anesthésiante pendant 30-90 s.
      NOTE: La durée de l’anesthésie doit être adaptée car elle varie en fonction de la taille du poisson. Pour vous assurer que le poisson est complètement anesthésié, pincez doucement le pédoncule caudale avec une pince. Si le poisson ne réagit pas, le massage peut être commencé.
   5. Sortez le poisson de la solution anesthésique et utilisez une serviette en papier ou essuyez doucement pour sécher l’abdomen du poisson. Placer le poisson dans l’auge de l’éponge humide de maintien côté ventral vers le haut afin que ses branchies soient exposées à la solution anesthésique contenue dans l’éponge (figure 1B).
   6. Si la zone autour du cloaque est humide, séchez doucement le dessous du poisson avec une lingette jetable.
   7. Placer le poisson dans l’éponge de maintien sous un microscope à dissection et placer la micropipette à l’aide d’un tube d’aspiration fixé contre le cloaque du poisson (figure 1C).
   8. Massez l’abdomen du poisson en pressant doucement avec une pince lisse à extrémité émoussée dans un mouvement rostral à caudale tout en suçant simultanément pour recueillir la laitance expulsée dans la pipette (Figure 1D).
   9. Relâchez les poissons de l’éponge dans l’eau de récupération. Laissez-les récupérer dans la solution pendant au moins 15 minutes avant de les remettre dans le système de l’aquarium.
   10. Transférer la laitance dans un tube préparé avec une solution d’activation préchauffée et pipeter plusieurs fois de haut en bas en aspirant et en soufflant sur l’ensemble du tube d’aspirateur.
   11. Homogénéiser doucement le sperme dilué en agitant les tubes avant l’analyse.
       REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, analysez les échantillons immédiatement (p. ex., 5 s) après l’activation. Dans medaka, l’analyse peut être retardée, si nécessaire, car les spermatozoïdes restent mobiles pendant plusieurs heures, mais le temps doit rester constant entre les échantillons car la motilité diminue avec le temps.
2. Collecte de spermatozoïdes par dissection testiculaire
   1. Préparer la solution d’euthanasie à 0,08 % en diluant deux tubes de bouillon de tricaïne (0,6 %) dans 26 ml d’eau d’aquarium dans un contenant en verre de 100 ml.
   2. Préparer les outils de dissection, y compris les pinces émoussées et fines et les petits ciseaux à dissection (figure 1E).
   3. Préparer un tube pour chaque échantillon avec 120 μL de solution activatrice pour une analyse immédiate. Préchauffer la solution activatrice dans un bain-marie ou un incubateur réglé à 27 °C pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Bien que les échantillons puissent être analysés à partir de poissons individuels, les variations individuelles peuvent être réduites en regroupant des échantillons de plusieurs mâles dans la même solution d’activation. Pour la mise en commun d’échantillons provenant de plusieurs poissons, utilisez 120 μL de solution activatrice par poisson. Cette dilution peut devoir être ajustée en fonction de la souche ou des conditions d’élevage du médaka utilisé, car ces facteurs peuvent avoir un impact sur la concentration et le volume des spermatozoïdes. Le programme CASA indiquera si la concentration est trop élevée pour identifier les spermatozoïdes.
   4. Euthanasier le poisson en le mettant dans la solution anesthésiante à 0,08% pendant 30-90 s.
      NOTE: La durée dépend de la taille du poisson. Pour vous assurer que le poisson est euthanasié, attendez que les mouvements de l’opercule cessent. Le poisson ne doit pas réagir au contact des forceps.
   5. Retirez le poisson de la solution d’euthanasie et séchez-le doucement avec une serviette en papier ou essuyez-le doucement.
      NOTE: À cette étape, le poisson peut être pesé pour calculer ultérieurement l’indice gonadosomatique (ISG, poids gonadique / poids corporel).
   6. Placer le poisson sous un microscope à dissection avec son côté latéral gauche tourné vers le haut (Figure 1F).
   7. À l’aide de petits ciseaux à dissection, couper un volet dorsale du cloaque, puis traverser les côtes jusqu’aux branchies pour exposer les organes internes (figure 1G).
   8. Localisez les testicules, coupez l’accessoire aux deux extrémités avec une pince fine et retirez les testicules (Figure 1H).
      REMARQUE: Pour calculer le GSI, les testicules peuvent être pesés à cette étape. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement des tissus.
   9. Transférer les testicules dans un tube préparé avec la solution d’activation préchauffée.
   10. Utilisez une pince pour écraser les testicules plusieurs fois contre le côté du tube afin de libérer le sperme. La libération de spermatozoïdes peut généralement être visualisée et rendra la solution légèrement trouble.
   11. Homogénéiser doucement le sperme dilué en agitant les tubes avant l’analyse.
       REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, analysez les échantillons immédiatement (p. ex., 5 s) après l’activation. Dans medaka, l’analyse peut être retardée, si nécessaire, car les spermatozoïdes restent mobiles pendant plusieurs heures, mais le temps doit rester constant entre les échantillons car la motilité diminue avec le temps.

Figure 1 : Prélèvement de laitance par massage abdominal (A-D) et dissection testiculaire (E-H). (A) Instruments pour massage abdominal: éponge de maintien, pinces lisses émoussées et micropipette en verre calibrée jetable de 10 μL avec tube d’aspiration; B) Position des poissons dans l’éponge de stockage, les branchies exposées à l’anesthésie dans l’éponge et le cloaque étant orientés vers le haut; C) Position d’une pince lisse et émoussée sur l’abdomen et d’une micropipette contre le cloaque; (D) Laitance à la micropipette après massage doux et succion. E) Instruments pour la dissection des testicules: pinces contondantes, pinces fines et petits ciseaux à dissection; (F) Position du poisson pour la dissection des testicules; G) Vue latérale des organes internes; (H) Retirer les testicules en coupant l’attache aux deux extrémités avec une pince fine. Barre d’échelle: 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Analyse du sperme avec le système CASA

1. Le système CASA (SCA Evolution) doit être configuré conformément au manuel avec un microscope utilisant un filtre vert et un objectif 10x avec contraste de phase.
2. Préparer des lames jetables de chambre de comptage de 20 μm en les préchauffant sur une plaque chauffante ou dans un incubateur réglé à 27 °C pendant au moins 5 min.
3. Ouvrez le logiciel d’analyse du sperme et sélectionnez le module de motilité.
4. Définissez la configuration du medaka comme illustré à la figure 2B.
5. Placer une lame de chambre de comptage jetable préchauffée de 20 μm sous le microscope sur une platine chauffée réglée à 27 °C.
6. Introduire l’échantillon dans la chambre sur la lame jusqu’à ce qu’il remplisse la chambre sans trop remplir. Essuyez soigneusement les échantillons excédentaires de l’entrée de la chambre avec une pointe en coton ou essuyez doucement pour éviter les cellules flottantes.
7. Sélectionnez Analyser pour examiner l’échantillon au microscope.
   REMARQUE: Si l’icône du microscope est rouge, l’éclairage du microscope doit être ajusté pour que le programme suive le sperme avec précision. Ajustez la luminosité du microscope afin que le mouvement de la queue du sperme soit clairement visible. L’icône doit être bleue.
8. Assurez-vous que le microscope est focalisé et sélectionnez Analyser à nouveau pour enregistrer le sperme sur le terrain. Déplacez la diapositive de sorte qu’une nouvelle zone de l’échantillon se trouve dans le cadre et répétez la page pour capturer 3 à 5 champs de vision différents. Évitez les champs avec des bulles d’air, des masses cellulaires ou des artefacts.
9. Sélectionnez Résultats pour afficher les résultats.
   Remarque : Si les champs de la page de résultats sont indiqués en rouge, suivez les invites du système pour supprimer les champs dont la concentration ou la motilité varie trop.
10. Double-cliquez sur un champ pour afficher les résultats du champ individuel ou pour vérifier manuellement les spermatozoïdes mal étiquetés ou non suivis. Faites un clic droit sur les spermatozoïdes individuels pour renommer la motilité, si nécessaire (Figure 2A).

Figure 2 : Capture d’écran du logiciel SCA Evolution. (A) Résultats du suivi du sperme pour un champ. Affichez les données de terrain sur le côté droit et double-cliquez sur les spermatozoïdes pour afficher les données individuelles; (B) Résumé des résultats pour tous les champs avec menu de configuration ouvert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Type de données obtenues
L’analyse de la motilité des spermatozoïdes du logiciel SCA Evolution fournit des données sur la motilité (pourcentage de spermatozoïdes mobiles et immotiles), ainsi que sur la progressivité (pourcentage de spermatozoïdes progressifs et non progressifs) et la vitesse (pourcentage de spermatozoïdes rapides, moyens et lents). Il combine également progressivité et vélocité (rapide progressif, moyen progressif, non progressif). Ces étiquettes sont basées sur des m...

Discussion

L’osmolalité est un facteur important dans l’activation des spermatozoïdes de poisson^36,37. En général, les spermatozoïdes sont immotiles dans les testicules et deviennent mobiles dans les milieux hyperosmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons marins, et hypo-osmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons d’eau douce³⁷. Comme dans le sang, le plasma séminal chez les poissons d’eau douce est g?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040