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Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.
L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de décès dans le monde, ce qui crée un besoin pressant de meilleurs modèles précliniques du cœur humain. L’ingénierie tissulaire est cruciale pour la recherche fondamentale en cardiologie. La culture de cellules humaines in vitro élimine les différences interspécifiques des modèles animaux, tandis qu’un environnement 3D plus semblable à celui des tissus (par exemple, avec une matrice extracellulaire et un couplage hétérocellulaire) simule les conditions in vivo dans une plus grande mesure que la culture bidimensionnelle traditionnelle sur des boîtes de Pétri en plastique. Cependant, chaque système modèle nécessite un équipement spécialisé, par exemple des bioréacteurs conçus sur mesure et des dispositifs d’évaluation fonctionnelle. De plus, ces protocoles sont souvent compliqués, laborieux et en proie à la défaillance des petits tissus délicats.
Cet article décrit un processus de génération d’un système modèle robuste de tissu cardiaque artificiel (hECT) utilisant des cardiomyocytes pluripotents induits dérivés de cellules souches pour la mesure longitudinale de la fonction tissulaire. Six hECT avec une géométrie linéaire de bande sont cultivés en parallèle, chaque hECT étant suspendu à une paire de poteaux en polydiméthylsiloxane (PDMS) à détection de force fixés à des racks PDMS. Chaque poste est recouvert d’un suivi de poste stable PDMS (SPoT) noir, une nouvelle fonctionnalité qui améliore la facilité d’utilisation, le débit, la rétention des tissus et la qualité des données. La forme permet un suivi optique fiable des déviations des poteaux, ce qui permet d’améliorer les tracés de la force de contraction avec une tension active et passive absolue. La géométrie du capuchon élimine les défaillances tissulaires dues au glissement des hECT des poteaux, et comme ils impliquent une deuxième étape après la fabrication du rack PDMS, les SPoT peuvent être ajoutés aux conceptions PDMS existantes basées sur les poteaux sans modifications majeures du processus de fabrication du bioréacteur.
Le système est utilisé pour démontrer l’importance de mesurer la fonction hECT à des températures physiologiques et montre une fonction tissulaire stable pendant l’acquisition des données. En résumé, nous décrivons un système modèle de pointe qui reproduit les conditions physiologiques clés pour faire progresser la biofidélité, l’efficacité et la rigueur des tissus cardiaques modifiés pour des applications in vitro .
Les modèles de tissus cardiaques modifiés se présentent sous la forme d’un large éventail de géométries et de configurations permettant de récapituler divers aspects de la niche cardiaque native qui sont difficiles à atteindre avec la culture cellulaire bidimensionnelle traditionnelle. L’une des configurations les plus courantes est la bande de tissu linéaire, avec des ancrages flexibles à chaque extrémité pour induire l’auto-assemblage des tissus et fournir au tissu une précharge définie et une lecture des forces de contraction résultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. La force générée peut être déterminée de manière robuste grâce au suivi optique du raccourcissement des tissus et à l’utilisation de la théorie des faisceaux élastiques pour calculer la force à partir des flèches mesurées et de la constante de ressort des ancrages 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Cependant, l’ingénierie des tissus cardiaques est encore un domaine en constante évolution, et certains défis demeurent. Des équipements spécialisés, tels que des bioréacteurs sur mesure et des dispositifs d’évaluation fonctionnelle, sont nécessaires pour chaque système modèle 10,29,30,31. La taille et la complexité du microenvironnement de ces constructions sont souvent limitées par un faible débit en raison de protocoles à forte intensité de main-d’œuvre, d’un nombre élevé de cellules et de la fragilité des tissus. Pour y remédier, certains groupes se sont tournés vers la fabrication de microtissus ne contenant que des centaines ou des milliers de cellules afin de faciliter les tests à haut débit utiles à la découverte de médicaments. Cependant, cette échelle réduite complique l’évaluation précise de la fonction12, élimine des aspects clés de la niche cardiaque native (tels que les gradients de diffusion des nutriments et de l’oxygène et l’architecture complexe36) et limite la quantité de matériel disponible pour l’analyse moléculaire et structurale ultérieure (nécessitant souvent la mise en commun des tissus). Le tableau 1 résume certaines des configurations des modèles linéaires de bandelettes tissulaires dans la littérature 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Groupe | Cellules par tissu | Mouchoirs par plaque | Format de la plaque | Fonction d’ancrage | Procédé d’acquisition de données fonctionnelles | Bain multimédia partagé ? | Mesure fonctionnelle in situ ? | ||||
Yoshida (ECT)38 | 4 millions | 6 | Plaque modifiée à 6 puits* | capteur de force | Mesure directe de la force | Non | Non | ||||
Chan (hESC-CM-ECTs)26 | 310 millier | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Poteaux PDMS | Mesure directe de la force | oui | Non | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 million | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Fil PDMS | forme des tissus | Non | oui | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 millier | 8 | fil polymère | Forme du fil | oui | oui | |||||
Costa (hECT simple)1, 2 | 1 à 2 millions | 4** | Boîte de Pétri de 10 cm** | Poteaux PDMS | Déviation optique (suivi des bords/objets) | oui | oui | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 k-1 million | 6 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS | Déviation optique (suivi des bords/objets) | oui | oui | ||||
Costa (multi-hECT avec SPoT) | 1 million | 6 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS avec capuchons noirs | Déviation optique (suivi d’objet) | oui | oui | ||||
Passier (EHT)17 | 245 millier | 36 | Plaque à 12 puits | Poteaux PDMS avec capuchons noirs | Déviation optique (suivi d’objet) | oui | oui | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 million | 12 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS avec capuchons | Déviation optique (détection des bords) | oui | oui | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPilier)14 | 550 millier | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Poteaux PDMS avec capuchons | déviation optique (suivi d’objet) ; Imagerie calcique | Non | oui | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 million | 12 | Plaque à 12 puits | Poteaux PDMS avec capuchons | déviation optique (détection des bords de la déviation post) ; Imagerie calcique | Non | oui | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25 à 150 milles | 96 | Plaque à 96 puits | Poteaux PDMS avec crochets | Déviation optique (détection des bords) | Non | oui | ||||
Murry23, 24 | 900 millier | 24 | Plaque à 24 puits | Poteaux PDMS avec capuchons, aimant intégré | Capteur magnétique | Non | oui | ||||
Reich (μTUG)11, 12, 25 | indéfini | 156 | Antenne parabolique à 156 puits | Poteaux PDMS avec capuchons, aimant intégré | Suivi optique (bille fluorescente) | oui | oui |
Tableau 1 : Caractéristiques de certains modèles linéaires de tissus cardiaques dans la littérature. Les modèles linéaires de tissus cardiaques varient en termes de taille, de débit, de conception des caractéristiques d’ancrage et de facilitation des bains moyens partagés, ainsi que des exigences d’un système de bain musculaire séparé pour la caractérisation fonctionnelle. * Les chercheurs ont utilisé un système de tissus artificiels disponible dans le commerce basé sur les dimensions d’une plaque standard à 6 puits. ** Un système modulaire dans lequel des bioréacteurs à tissu unique sont ancrés à n’importe quelle boîte de culture en plastique dans le nombre et l’emplacement souhaités.
Cet article décrit le dernier protocole pour la fabrication de notre modèle établi de tissu cardiaque linéaire d’ingénierie humaine (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 et des méthodes d’évaluation de la fonction contractile de l’hECT. Chaque bioréacteur multi-tissus peut accueillir jusqu’à six hECT dans un bain de milieu partagé et est composé de deux pièces « rack » en polydiméthylsiloxane élastomère de silicone (PDMS) montées sur un châssis rigide en polysulfone. Chaque rack PDMS contient six poteaux flexibles intégrés à détection de force de 0,5 mm de diamètre et de 3,25 mm de long, et ensemble, deux racks fournissent six paires de poteaux, chacun contenant un hECT. L’inversion du bioréacteur permet de surmonter tout obstacle à la visualisation des hECTs par le bas en raison de la condensation de l’eau du milieu de culture ou des distorsions du ménisque de l’interface air-liquide. Chaque contraction d’un hECT provoque une déviation des bornes intégrées, et la mesure optique du signal de déviation est traitée en un traçage de la force en fonction du temps représentant la fonction contractile de l’hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Par rapport aux bioréacteurs à tissu unique généralement utilisés pour les tissus de cette taille, la conception multi-tissus améliore le débit expérimental et permet l’étude de la signalisation paracrine entre des tissus adjacents de composition cellulaire potentiellement différente. Ce système a été validé dans des études publiées décrivant des applications dans la modélisation des maladies 4,8, la signalisation paracrine 6,7, la culture hétérocellulaire 5,9 et le criblage thérapeutique 7,9.
Dans ce système, les hECT sont conçus pour avoir une longueur d’environ 6 mm et un diamètre de 0,5 mm afin de faciliter un suivi optique robuste des mesures de force avec un faible bruit. De plus, les aspects de la complexité tissulaire tels que les gradients de diffusion et l’organisation cellulaire sont équilibrés avec un besoin gérable de 1 million de cellules par tissu. Avec la technologie de caméra CCD standard, des forces aussi faibles que 1 μN (représentant moins de 5 μm après la déviation) génèrent un signal clair, garantissant que même une fonction contractile extrêmement faible, telle qu’observée avec certains modèles de maladie hECT, peut être mesurée avec précision. Cela facilite également l’analyse détaillée de la courbe de force de contraction, permettant ainsi l’analyse à haut contenu d’un maximum de 16 paramètres de contractilité41, y compris la force développée, les taux de contraction (+dF/dt) et de relaxation (−dF/dt), et la variabilité de la vitesse de battement.
Ce protocole commence par des instructions pour la fabrication des composants du bioréacteur. Une attention particulière est accordée aux étapes permettant de maximiser le rendement de l’hECT, de réduire la variabilité technique de la fonction tissulaire et d’optimiser la qualité et la profondeur de l’évaluation tissulaire. La plupart des études d’ingénierie des tissus cardiaques ne font pas état de taux de perte de tissus au cours de la fabrication et des tests à long terme, bien qu’il s’agisse d’un défi bien connu sur le terrain et qu’il réduise le débit et l’efficacité des études27. Les méthodes d’ingénierie tissulaire décrites ici ont été affinées au fil des ans pour assurer la rétention de tous les hECT dans la plupart des bioréacteurs (quelle que soit la façon dont les racks PDMS sont fabriqués). Cependant, même une perte de 5 à 20 % de tissus peut affecter considérablement la puissance statistique, en particulier dans les petites expériences limitées par le nombre de cardiomyocytes disponibles (par exemple, en raison de problèmes de différenciation avec certaines lignées cellulaires malades4 ou en raison du coût élevé des cardiomyocytes achetés dans le commerce), ou par les conditions de traitement (par exemple, la disponibilité limitée ou le coût élevé de divers composés de traitement).
Ce protocole décrit la fabrication de trackers de poteaux stables (SPoT), une nouvelle fonctionnalité des racks PDMS, qui fonctionnent comme des capuchons aux extrémités des poteaux de détection de force qui maintiennent les hECT27. Il est démontré comment la géométrie du capuchon réduit considérablement la perte d’hECT due à la chute ou à l’arrachement des poteaux, ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour la culture d’hECT avec une plus grande variété de rigidités et de tensions, qui sont difficiles à cultiver sur des poteaux non coiffés. De plus, les SPoT fournissent un objet à contraste élevé pour améliorer le suivi optique de la contraction de l’hECT grâce à une forme cohérente et bien définie27. Ceci est suivi d’une description de la culture des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) et de la différenciation des cardiomyocytes basée sur des protocoles publiés antérieurement 3,42,43 et d’une explication de la fabrication, de la culture et des mesures fonctionnelles de l’hECT.
Cet article traite également de la nécessité de mesurer la fonction tissulaire à la température physiologique. Le myocarde humain (tissus sains et malades du fœtus et de l’adulte), ainsi que le tissu cardiaque d’un large éventail d’espèces animales (y compris les rats, les chats, les souris, les furets et les lapins)44,45, présentent une augmentation marquée de la force de contraction adaptée à la fréquence à des températures de 28 °C à 32 °C par rapport à la température physiologique - un phénomène connu sous le nom d’inotropie hypothermique45, Chapitre 46. Cependant, les effets de la température sur la fonction du tissu myocardique artificiel restent peu étudiés. De nombreux modèles récents de tissus cardiaques modifiés dans la littérature sont conçus pour être évalués fonctionnellement à 37 °C afin de se rapprocher des conditions physiologiques 13,14,37. Cependant, à notre connaissance, les effets dépendants de la température sur la force générée par les tissus cardiaques modifiés n’ont pas été systématiquement étudiés. Ce protocole décrit une conception d’électrode de stimulation qui minimise les pertes de chaleur pendant les essais, tout en permettant l’incorporation d’un élément chauffant isolé dans l’installation pour les mesures fonctionnelles, ce qui peut maintenir les hECT à la température physiologique sans compromettre la stérilité27. Nous rapportons ensuite certains des effets observés de la température sur la fonction hECT, y compris sur la force développée, la fréquence des battements spontanés, +dF/dt et −dF/dt. Dans l’ensemble, cet article fournit les détails nécessaires à la fabrication de ce système de bioréacteur multi-tissu à détection de force pour fabriquer des tissus cardiaques modifiés chez l’homme et pour évaluer leur fonction contractile, et un ensemble de données est présenté qui fournit une base de comparaison pour les mesures à température ambiante et à 37 °C27.
Ce protocole utilisait une lignée anonymisée de CSPi, SkiPS 31.3 (reprogrammée à l’origine à l’aide de fibroblastes dermiques provenant d’un homme de 45 ans en bonne santé)47, et était donc exempté de l’approbation spécifique du comité d’examen institutionnel, conformément aux lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur des êtres humains de l’établissement. Effectuez toutes les manipulations de cellules et d’hECT dans des conditions aseptiques dans une enceinte de sécurité biologique de classe II filtrée HEPA ou un banc de travail à flux laminaire. Stériliser toutes les solutions non stériles par filtration à travers un filtre de 0,22 μm, et maintenir toutes les cellules et les hECT dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité relative et 5 % de CO2.
1. Fabrication de bioréacteurs
Figure 1 : Composants du bioréacteur hECT. (A) Vue de dessus (à gauche) et vue latérale (à droite) de la plaque de base en PTFE avec six puits régulièrement espacés pour former des hECT (flèches blanches). (B) Vue latérale (à gauche) et vue de dessus (à droite) des moulages principaux négatifs en aluminium pour les racks PDMS avec six poteaux régulièrement espacés (pointes de flèches magenta) et trois espaces pour la fixation au châssis du bioréacteur (astérisques verts). (C) Vue latérale (à gauche) et vue de dessous (à droite) des cadres en polysulfone pour les racks PDMS avec trois supports de cadre régulièrement espacés (astérisques verts) correspondant aux supports de cadre dans le rack PDMS cast (panneau B). (D) Vue de dessus (en haut) et vue latérale (en bas) du support en fonte d’aluminium avec quatre fentes pour les moulages en rack PDMS, chacune avec une étagère triangulaire de 0,25 mm de haut (l’étagère la plus à gauche surlignée en orange). Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : hECT = tissu cardiaque modifié par l’homme ; Ø = diamètre ; PTFE = polytétrafluoroéthylène ; PDMS = polydiméthylsiloxane ; R = rayon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Fabrication des racks PDMS. (A) Les rendus CAO montrent une vue oblique de l’appareil de coulée. (I) Un moulage principal négatif du rack PDMS est inséré dans chacune des quatre fentes du support de coulée avec les trous qui forment les poteaux PDMS (pointes de flèche magenta) placés sur l’espace mort opposé à l’étagère triangulaire (Figure 1D, triangle orange). (II) Le PDMS est versé dans chaque cavité de la coulée maîtresse négative. (III) Des billes colorées sont ajoutées au PDMS non polymérisé en tant que système d’identification à code couleur. (B) Photo montrant l’appareil de coulée en rack PDMS assemblé, qui est serré de chaque côté avec deux supports imprimés en 3D maintenus en place par une pince à vis et enveloppés d’une feuille de silicone de 0,5 mm d’épaisseur (flèches blanches) pour sceller les côtés serrés. Les perles colorées sont placées de manière à ne pas recouvrir les trous de 0,5 mm de diamètre qui forment les poteaux (pointes de flèches magenta). (C) Une fois le PDMS durci, le moulage est retiré du porte-moulage. (I) Une lame de rasoir émoussée en acier inoxydable ou un outil métallique mince similaire est inséré entre la fonte et le porte-fonte pour faire levier sur la fonte du porte-pièce (II). (III) Le film (supports turquoises) formé par le PDMS s’écoulant à travers les trous des poteaux est fixé aux extrémités des poteaux et doit être coupé à l’aide d’une lame tranchante (IV,V). (D) Le rack PDMS est séparé de la fonte. (E) Photos montrant des vues obliques (en haut), latérales (au milieu) et inférieures (en bas) du rack PDMS avec une bille de verre incrustée dans le corps pour l’identification (flèche bleue). Les extrémités des poteaux (pointes de flèches orange) ont été marquées à l’encre noire. Barre d’échelle = 1 cm. Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : CAO = conception assistée par ordinateur ; PDMS = polydiméthylsiloxane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Fabrication du SPoT. (A) Rendus CAO indiquant les dimensions clés de la base (I) et (II) de la pièce à trois branches du gabarit de coulée SPoT. Les dimensions des formulaires SPoT circulaires (AI, flèches noires) sont définies comme suit : 0,2 mm de profondeur x 1,2 mm de diamètre, et chacune d’entre elles contient le PDMS noir d’un SPoT individuel. L’étagère de 11,1 mm x 27 mm que l’on voit sur la vue de dessus (AII, en haut, rectangle turquoise) est abaissée de 0,4 mm (comme on le voit sur la vue latérale ci-dessous) pour maintenir le rack PDMS en place pendant le durcissement. (B) Rendu CAO montrant l’assemblage de l’appareil de coulée SPoT. (C) Une photo de l’appareil de coulée SPoT assemblé. (D) Une fois le PDMS durci, le gabarit à trois dents est glissé sous les racks PDMS, et les SPoT sont libérés de leurs puits à l’aide d’une pince fine. (E) Photos du rack PDMS sans (en haut) et avec (en bas) SPoT. Les encarts montrent des vues agrandies des poteaux. Barres d’échelle = 1 cm (E), 2,5 cm (images agrandies dans E). Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : CAO = conception assistée par ordinateur ; Ø = diamètre ; PDMS = polydiméthylsiloxane ; R = rayon ; SPoT = suivi de poste stable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Culture cellulaire
3. Culture de l’hECT
Composant | Volume (μL) | |||||||
distillé H2O | 13.442 | 2,9 mg/mL de solution de collagène | « Mélange ECM » | mélange final de cellules hECT | ||||
NaOH 1N | 0.638 | |||||||
PBS 10x | 4.4 | |||||||
5 mg/mL de bouillon de collagène | 25.52 | |||||||
0,2 N pH 9 HEPES | 5.5 | |||||||
10x MEM | 5.5 | |||||||
Volume de mélange ECM à transférer dans la pastille cellulaire | 35.2 | |||||||
Volume de Matrigel | 4.4 |
Tableau 2 : Réactifs hECT. Les composants doivent être ajoutés dans l’ordre indiqué et conservés sur la glace.
Figure 4 : Assemblage du bioréacteur et fabrication de l’hECT. (A) (I) Deux racks PDMS (à gauche, bleu clair) montés sur le cadre en polysulfone (à droite, beige). (II) La plaque de base en PTFE (noire, à gauche) s’adapte ensuite au cadre (à droite) de manière à ce que chaque paire de poteaux s’insère dans un puits de la plaque de base. (B) (I) Quarante-quatre microlitres de suspension de cardiomyocytes dans une matrice extracellulaire à base de collagène sont ajoutés à chacun des six puits de la plaque de base. (II, III) Le cadre avec racks PDMS est pressé sur la plaque de base. Après 1 à 4 jours, les hECT peuvent être retirés de la plaque de base. (IV) Tout d’abord, le bioréacteur est inversé avant que (V) la plaque de base ne soit soulevée du châssis. (VI) Vue latérale du bioréacteur avec six hECT. Encart : vue agrandie montrant la position de l’hECT sur les poteaux par rapport aux SPoT (médaillon). (C) Rendu CAO montrant trois niveaux de compactage hECT ([I] faible, [II] moyen et [III] élevé) vus à travers l’espace dans le cadre en polysulfone. Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : CAO = conception assistée par ordinateur ; PDMS = polydiméthylsiloxane ; PTFE = polytétrafluoroéthylène ; SPoT = suivi de poste stable ; hECT = tissu cardiaque modifié par l’homme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Équipement de stimulation hECT
Figure 5 : Gaine en acrylique pour l’isolation de la platine en verre chauffé. Images CAO montrant les dimensions clés des pièces de la gaine acrylique conçue pour la table en verre. (A) Le panneau supérieur est percé d’un trou de 27 cm x 18,5 cm pour permettre à la parabole du bioréacteur de reposer sur l’élément chauffant. Les rectangles orange dans les coins indiquent l’emplacement suggéré de petites pièces d’espacement pour fournir de l’espace entre le haut de la veste et l’élément chauffant. (B) La partie inférieure de la veste comporte deux découpes pour permettre aux pieds de la scène chauffée de glisser (astérisques verts). (C&D) Deux panneaux latéraux s’insèrent sous la pièce supérieure. (D) Le panneau latéral gauche comprend une découpe de 3 cm x 0,3 cm (encart) pour le cordon d’alimentation de la scène. (E) De longs panneaux s’adaptent à l’avant et à l’arrière. (F) Des inserts sont ajoutés pour combler les espaces une fois que la table est à l’intérieur. (G) (I) Les panneaux latéraux et arrière sont fixés à la pièce inférieure, puis (II) le panneau supérieur est ajouté. (III) La table en verre est glissée dans la gaine (flèches magenta). (IV) Les inserts sont fixés entre les pieds de la table, et le dos s’insère sur l’ouverture pour fermer la boîte. (V) L’assemblage de la gaine terminé. Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : CAO = conception assistée par ordinateur ; R = rayon ; Ø = diamètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Acquisition des données de la contraction de l’hECT. (A) (I) Photos des électrodes découpées dans des barres de graphite. Les flèches magenta indiquent les trous pour fixer les fils en acier inoxydable. Barre d’échelle = 1 cm. (II) Vue oblique (à gauche) et vue de dessus (à droite) montrant l’emplacement des électrodes en graphite dans le bioréacteur. Les électrodes occupent l’espace entre le bioréacteur de 25 mm de large et la paroi de la boîte pour assurer une distance constante entre les électrodes. Les fils sont pliés pour permettre la fermeture du couvercle de la vaisselle. (B) Photo de la configuration de stimulation hECT à l’intérieur du banc de nettoyage à flux laminaire - tout l’équipement est placé sur la table d’isolation des vibrations pour réduire le bruit de vibration du banc propre. Le bioréacteur (pointe de flèche magenta) se trouve sur la scène chauffée chemisée, éclairée par une source de lumière LED par le haut. Le microscope à dissection est pointé horizontalement vers un miroir à angle droit (astérisque orange) pour voir le bioréacteur d’en bas et est équipé d’une caméra CCD (à gauche). Le support turquoise indique un bain-marie pour une surveillance continue de la température afin de fournir un retour d’information au contrôleur de scène chauffé en boucle fermée. Ce chiffre a été modifié à partir de van Neste27. Abréviations : hECT = tissu cardiaque modifié par l’homme ; LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Mesures fonctionnelles hECT
Figure 7 : Interface d’acquisition des données après la déflexion. (A) Bouton d’exécution du logiciel. (B) Barre d’outils contenant les outils ligne et rectangle pour les mesures de longueur et la sélection d’objets, respectivement. (C) Commandes d’étalonnage de distance. (D) Outils de mesure de la section transversale hECT en trois points différents. (E) Commutateur de seuillage et curseur (F) pour convertir le flux vidéo en images à contraste élevé en temps réel. (G) Un SPoT visible dans la fenêtre d’aperçu. (H) Outils de sélection des SPoT. (I) Curseur pour filtrer les objets par taille. (J) Graphique montrant la distance mesurée entre les objets suivis en temps réel. (K) Options de sélection du répertoire d’enregistrement des fichiers de sortie. (L) Options de réglage de la plage de fréquences, de l’intervalle de fréquence, de la durée d’enregistrement et de la durée de réglage entre les enregistrements pour le programme de post-suivi (M). (N) Sortie graphique de la transformation de Fourier de la courbe de déviation du dernier enregistrement sauvegardé. (O) Programme pour trouver la tension minimale requise pour stimuler les hECTs. (P) Programme de calcul des flèches maximales et minimales des poteaux. Abréviations : hECT = tissu cardiaque modifié par l’homme ; SPoT = suivi de poste stable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Mesures du rack PDMS
7. Traitement fonctionnel des données à l’aide de scripts d’analyse personnalisés
Figure 8 : Calculs de la courbe de force de contraction. (A) L’exécution du fichier « AnalyzeLogsGUI.m » dans le logiciel de traitement des données ouvre la fenêtre de l’interface graphique. (I) La zone Log Selection permet à l’utilisateur de sélectionner le répertoire du dossier contenant les données fonctionnelles hECT. Le champ Nombre de jours est automatiquement renseigné à partir du titre du fichier récapitulatif créé à l’étape de protocole 7.1. L’hECT à traiter est sélectionné à l’aide du menu déroulant Tissu. (II) La zone Entrées de données contient des informations sur la paire de poteaux PDMS qui supportent l’hECT, telles que la distance à vide (obtenue à l’étape 6.1 du protocole) et le rayon du poteau (0,25 mm). (III) La case Contraintes d’analyse permet à l’utilisateur de choisir les fréquences à omettre ou à inclure et de découper les enregistrements. (IV) La zone des paramètres du filtre contient les options permettant de choisir le mode de filtrage de la courbe de force de contraction brute. L’ordre polynomial et la taille de l’image modifient le niveau de lissage pendant le processus de filtrage. Le curseur Seuil de détection des pics détermine la taille minimale des pics qui sera reconnue par les scripts. L’option Suppression des pointes coupe les pics élevés causés par des artefacts. (V) Les options supplémentaires incluent l’analyse post-déflexion, qui exécute un algorithme de détection de pic supplémentaire, la mise à l’échelle automatique de l’axe Y sur les tracés de zoom, qui agit sur la courbe de force de contraction, l’enregistrement des courbes de trace de force, qui enregistre les chiffres de force de contraction, et l’enregistrement des données de force-temps, qui enregistre les données de force de contraction tracées. (B) Exemple de la courbe de force de contraction d’un enregistrement de 30 s d’un hECT rythmé à 1 Hz produit par la capture d’écran de l’interface graphique du panneau A. La courbe rouge de la force de contraction montre la force filtrée produite par les paramètres de l’AIV, superposée à la courbe de force de contraction brute (courbe bleu foncé, apparaît lorsque l’option Afficher les données non filtrées dans AV est sélectionnée). Abréviations : hECT = tissu cardiaque modifié par l’homme ; GUI = interface utilisateur graphique ; PDMS = polydiméthylsiloxane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Suivant le protocole ci-dessus, les cardiomyocytes ont été générés à partir d’une lignée iPSC saine utilisée précédemment par notre groupe 9,15 et transformés en ECTh après 8 à 61 jours de culture. La figure 9A montre des images représentatives des hECT vues du bas, qui ont été créées sans (en haut) et avec (en bas) SPoT. Les mesures fonctionnelles ont été effectuées à température ambiante (23 °C) et à temp...
Il existe de nombreux modèles linéaires de tissus cardiaques modifiés publiés dans la littérature, dont certains sont décrits dans le tableau 1. Certains modèles impliquent la mesure directe de la force tissulaire, mais ceux-ci nécessitent généralement de transférer la construction dans un bain musculaire séparé38. La plupart des modèles sont conçus avec les tissus ancrés en permanence aux deux extrémités, le plus souvent aux poteaux PDMS ...
K.D.C. est cofondateur et directeur scientifique de Novoheart et détient une participation dans la société de portefeuille Medera Biopharmaceutical. Novoheart n’a pas contribué au financement, à la planification ou à l’exécution de cette étude ; cependant, les résultats de l’étude pourraient potentiellement avoir un impact financier sur Novoheart et Medera. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Les auteurs remercient le Dr Timothy Cashman pour ses travaux antérieurs sur cette méthode. Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 et K01 HL133424) et le programme des réseaux d’excellence internationaux de la Fondation Leducq (CURE-PLaN).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 - 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |
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