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Résumé

Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.

Résumé

L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de décès dans le monde, ce qui crée un besoin pressant de meilleurs modèles précliniques du cœur humain. L’ingénierie tissulaire est cruciale pour la recherche fondamentale en cardiologie. La culture de cellules humaines in vitro élimine les différences interspécifiques des modèles animaux, tandis qu’un environnement 3D plus semblable à celui des tissus (par exemple, avec une matrice extracellulaire et un couplage hétérocellulaire) simule les conditions in vivo dans une plus grande mesure que la culture bidimensionnelle traditionnelle sur des boîtes de Pétri en plastique. Cependant, chaque système modèle nécessite un équipement spécialisé, par exemple des bioréacteurs conçus sur mesure et des dispositifs d’évaluation fonctionnelle. De plus, ces protocoles sont souvent compliqués, laborieux et en proie à la défaillance des petits tissus délicats.

Cet article décrit un processus de génération d’un système modèle robuste de tissu cardiaque artificiel (hECT) utilisant des cardiomyocytes pluripotents induits dérivés de cellules souches pour la mesure longitudinale de la fonction tissulaire. Six hECT avec une géométrie linéaire de bande sont cultivés en parallèle, chaque hECT étant suspendu à une paire de poteaux en polydiméthylsiloxane (PDMS) à détection de force fixés à des racks PDMS. Chaque poste est recouvert d’un suivi de poste stable PDMS (SPoT) noir, une nouvelle fonctionnalité qui améliore la facilité d’utilisation, le débit, la rétention des tissus et la qualité des données. La forme permet un suivi optique fiable des déviations des poteaux, ce qui permet d’améliorer les tracés de la force de contraction avec une tension active et passive absolue. La géométrie du capuchon élimine les défaillances tissulaires dues au glissement des hECT des poteaux, et comme ils impliquent une deuxième étape après la fabrication du rack PDMS, les SPoT peuvent être ajoutés aux conceptions PDMS existantes basées sur les poteaux sans modifications majeures du processus de fabrication du bioréacteur.

Le système est utilisé pour démontrer l’importance de mesurer la fonction hECT à des températures physiologiques et montre une fonction tissulaire stable pendant l’acquisition des données. En résumé, nous décrivons un système modèle de pointe qui reproduit les conditions physiologiques clés pour faire progresser la biofidélité, l’efficacité et la rigueur des tissus cardiaques modifiés pour des applications in vitro .

Introduction

Les modèles de tissus cardiaques modifiés se présentent sous la forme d’un large éventail de géométries et de configurations permettant de récapituler divers aspects de la niche cardiaque native qui sont difficiles à atteindre avec la culture cellulaire bidimensionnelle traditionnelle. L’une des configurations les plus courantes est la bande de tissu linéaire, avec des ancrages flexibles à chaque extrémité pour induire l’auto-assemblage des tissus et fournir au tissu une précharge définie et une lecture des forces de contraction résultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,

Protocole

Ce protocole utilisait une lignée anonymisée de CSPi, SkiPS 31.3 (reprogrammée à l’origine à l’aide de fibroblastes dermiques provenant d’un homme de 45 ans en bonne santé)47, et était donc exempté de l’approbation spécifique du comité d’examen institutionnel, conformément aux lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur des êtres humains de l’établissement. Effectuez toutes les manipulations de cellules et d’hECT dans des conditions aseptiques dans une enceinte de sécurité biologique de classe II filtrée HEPA ou un banc de travail à flux laminaire. Stériliser toutes les solutions non stériles par filtration à travers un filtre de

Résultats

Suivant le protocole ci-dessus, les cardiomyocytes ont été générés à partir d’une lignée iPSC saine utilisée précédemment par notre groupe 9,15 et transformés en ECTh après 8 à 61 jours de culture. La figure 9A montre des images représentatives des hECT vues du bas, qui ont été créées sans (en haut) et avec (en bas) SPoT. Les mesures fonctionnelles ont été effectuées à température ambiante (23 °C) et à temp...

Discussion

Il existe de nombreux modèles linéaires de tissus cardiaques modifiés publiés dans la littérature, dont certains sont décrits dans le tableau 1. Certains modèles impliquent la mesure directe de la force tissulaire, mais ceux-ci nécessitent généralement de transférer la construction dans un bain musculaire séparé38. La plupart des modèles sont conçus avec les tissus ancrés en permanence aux deux extrémités, le plus souvent aux poteaux PDMS ...

Déclarations de divulgation

K.D.C. est cofondateur et directeur scientifique de Novoheart et détient une participation dans la société de portefeuille Medera Biopharmaceutical. Novoheart n’a pas contribué au financement, à la planification ou à l’exécution de cette étude ; cependant, les résultats de l’étude pourraient potentiellement avoir un impact financier sur Novoheart et Medera. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Timothy Cashman pour ses travaux antérieurs sur cette méthode. Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 et K01 HL133424) et le programme des réseaux d’excellence internationaux de la Fondation Leducq (CURE-PLaN).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel WireMcMaster Carr6517K61 
0.25% trypsin-EDTAGibco25200056
1.7 mL MicrotubesAxygenMCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)Corning353003
10 mL Serological PipetteDrummond6-000-010
10 N NaOHFisher ScientificSS225-1dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle MediumSigma AldrichM0275
20 - 200 μL MicropipetteEppendorf3123000055
200 μL MicroPipette TipsVWR76322-150
5 mL Serological PipetteDrummond6-000-005
50 mL Conical Centrifuge TubesFalcon352070
6 cm Petri DishCorning353002
6 Watt LED Dual Gooseneck IlluminatorAmScope LED-6W 
6-Well PlatesCorning353046
90 degree angle mirrorEdmund Optics45-594
Acrylic bonding glueSCIGRIP#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jackFisher Scientific14-673-50
Aluminum 6061McMaster Carr9008K82
A-Plan 10X Objective LensZEISS1020-863
Autoclave BagsPropper21002
B-27 supplementThermoFisher17504044
B-27 supplement (without insulin)ThermoFisherA1895601
Benchtop CentrifugeEppendorf5810 R
Black ABSUltimaker2.85 mm wide
Bovine Collagen IGibcoA1064401
CHIR99021Tocris4423
Class II Biosafety CabinetLabconco3430009
Clear Acrylic Sheetingestreetplastics10025024366.25 mm thick
CNC Vertical MillHaasVF-1
Conductive Graphite BarsMcMaster Carr1763T33
Dissection microscopeOlympusSZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient MixThermoFisher11330032
EthanolFisher ScientificA4094Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counterNanoEntekE1000
EVE Cell Counting SlideNanoEntekEVS-050
Fetal Bovine SerumLife Technologies10438026
Fine Curved ForcepsFine Science Tools11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Electron Corporation3110AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 softwareAutodeskAKA "CAD software"
Glass HemocytometerReichert14750.1 mm deep
HEPESSigma AldrichH3784
hESC qualified matrigelCorning354277AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD CameraPixelLINKP7410
Inverted MicroscopeCarl Zeiss WerkAxiovert 40 CFL10X phase contrast objective
IWR-1Selleck ChemS7086
LabView SoftwareNational Instruments2016
Laminar flow clean benchNuAireNU-201-330necessary for hECT functional analysis
LaptopAsusTekStrixIntel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting MachineEpilogHelix 24
Magnification headsetExcelBlades70020Recommended for steps requiring fine manipulations
MatlabMathworksVersion 2019b or laterAKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm bladeWPI Instruments501839
Microscope Boom StandOlympusSZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solutionThermoFisher1514012210,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cationsSigma AldrichP3813Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette ControllerDrummond4-000-100
PixelLINK Capture OEMPixelLINK10.2.1.6AKA "Camera Software"
PolysulfoneMcMaster Carr86735K73translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)McMaster Carr8545K176 Black, molded
ReLeSRStem Cell Technologies5872AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 MediaThermoFisher11875135
Silicone SheetingSMI manufacturingglossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed BeadsMichael'scolor should withstand autoclaving
SpatulaFisher Scientific14-373used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator Astro-Med / Grass TechnologiesS88X
Stainless Steel RazobladesGEM62-0179-CTNpreferred over non-stainless steel due to lower hardness
StemflexThermoFisherA3349401AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled waterThermoFisher5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg KitDowDOWSIL 170 2LB KITAKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb KitDowDC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KITAKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stageOkolabH401-HG-SMUSet height to 10 cm
Thermoplastic 3D printerUltimakerUltimaker 3
ThiazovivinSelleck ChemS1459
Trypan BlueNanoEntekEBT-001
Vacuum ChamberBel-Art PartsF42027-0000
Variable Speed Mini Band SawMicro-Mark82203
Variable Speed Miniature Drill PressMicro-Mark82959
Vibration Isolation TableLabconco3618000
Weighing BoatsVWR10803-140
Talon Cylinder Bench ClampVWR97035-528AKA screw clamp

Références

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Turnbull, I. C., et al.

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