* Эти авторы внесли равный вклад
Индуцированная стрептозотоцином модель диабетической раны у самцов крыс SD в настоящее время является наиболее широко используемой моделью для изучения заживления ран при сахарном диабете I типа. В этом протоколе описываются методы, используемые для построения этой модели. Он также представляет и решает потенциальные проблемы и исследует прогрессирование и ангиогенные характеристики диабетических ран.
Однократная инъекция стрептозотоцина в высокой дозе с последующим иссечением кожи на всю толщину спины крыс является распространенным методом построения животных моделей диабетических ран 1 типа. Однако неправильные манипуляции могут привести к нестабильности модели и высокой смертности у крыс. К сожалению, существует несколько существующих руководств по моделированию диабетических ран 1 типа, и им не хватает деталей и не представлены конкретные эталонные стратегии. Таким образом, в этом протоколе подробно описывается полная процедура построения модели диабетической раны 1 типа и анализируются прогрессирование и ангиогенные характеристики диабетических ран. Моделирование диабетической раны 1 типа включает в себя следующие этапы: подготовка инъекции стрептозотоцина, индукция сахарного диабета 1 типа и построение модели раны. Площадь раны измеряли на 7-й и 14-й день после ранения, а кожные ткани крыс извлекали для гистопатологического и иммунофлюоресцентного анализа. Результаты показали, что сахарный диабет 1 типа, вызванный стрептозотоцином 55 мг / кг, был связан с более низкой смертностью и высокой вероятностью успеха. Уровень глюкозы в крови был относительно стабильным после 5 недель индукции. Скорость заживления диабетических ран была значительно ниже, чем у нормальных ран на 7-й и 14-й день (p < 0,05), но оба могли достигать более 90% на 14-й день. По сравнению с нормальной группой, закрытие эпидермального слоя диабетических ран на 14-е сутки было неполным и имело замедленную реэпителизацию и достоверно более низкий ангиогенез (p < 0,01). Модель диабетической раны 1 типа, построенная на основе этого протокола, имеет характеристики хронического заживления ран, включая плохое закрытие, отсроченную реэпителизацию и снижение ангиогенеза по сравнению с нормальными ранами крыс.
Сахарный диабет 1 типа (СД1) – хроническое заболевание обмена веществ, характеризующееся гипергликемией и разрушением β-клеток поджелудочной железы1. Рана СД1 является хронической незаживающей раной и наиболее частым и разрушительным осложнением сахарного диабета у человека 2,3. Животные модели являются наиболее подходящими прототипами для изучения патологических изменений во время заживления ран, а также безопасности и эффективности потенциальных терапевтических агентов4. По сравнению с другими типами, самцы крыс Sprague-Dawley (SD) более чувствительны к стрептозотоцину (STZ) и демонстрируют более низкий уровень смертности, что делает их популярными в исследованиях диабетических ран 5,6.
Описаны многочисленные методы построения моделей ран СД1. Что касается модели СД1, исследования в основном были сосредоточены на влиянии метода инъекций STZ на успешность индукции диабета 7,8. Однако процесс моделирования страдает от непоследовательного выполнения этого же шага. В одном исследовании крысы голодали в течение 18 часов перед инъекцией STZ; крысы с уровнем глюкозы в крови выше 16,67 ммоль / л через 1 неделю после инъекции STZ были признаны диабетиками, и диабетическая рана была введена через 3 недели9. И наоборот, в соответствующем исследовании Zhu et al. голодали крысам в течение 12 часов перед инъекцией STZ; крысы с уровнем глюкозы в крови выше 16,7 ммоль/л через 72 ч после инъекции считались диабетиками, и диабетическая рана вводилась через 4 недели10. В целом, существуют несоответствия в протоколах инъекций STZ, критериях диагностики диабета и времени введения в рану.
С точки зрения моделирования раны, в большинстве исследований иссекается вся толщина дорсальной кожи для построения ран СД1 после успешной индукции диабета11,12,13. Хотя эта модель подвержена кожной контрактуре у крыс, она является наиболее часто используемой моделью в исследованиях заживления ран, поскольку она менее трудоемка и дешева14,15. Тем не менее, методические исследования этого метода иссечения на всю толщину отсутствуют. Кроме того, в существующих исследованиях нет единых стандартов относительно размера и расположения раны12,16. Размер и расположение раны могут косвенно влиять на согласованность плана эксперимента и научную обоснованность результатов. Поэтому существует острая необходимость в стандартном протоколе индукции СД1 и моделирования ран в качестве справочного материала для исследователей. Целью данного исследования является визуализация конкретного протокола моделирования ран СД1, который может быть использован в качестве эталона для исследований ран СД1.
Протокол был проведен в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все эксперименты на животных были одобрены Управляющим комитетом Университета традиционной китайской медицины Чэнду (запись No 2021-13).
1. Подготовка инъекции стрептозотоцина
2. Индукция модели T1DM
3. Построение модели раны
4. Расчет площади раны с помощью программного обеспечения ImageJ
5. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
6. Иммунофлуоресцентное окрашивание CD31
7. Статистический анализ
В общей сложности 10 крыс SD получили одну внутрибрюшинную инъекцию STZ для индукции модели СД1. Одна крыса умерла преждевременно (10%), но диабет был индуцирован у всех крыс (100%). После 3 дней инъекции STZ уровень глюкозы в крови всех крыс был выше 16,7 ммоль / л, а уровень глюкозы в крови стабилизировался через 5 недель после индукции (рис. 3A). Вес группы диабетиков постепенно увеличивался после инъекции STZ, но уменьшался на 3-й неделе, а затем снова медленно увеличивался с 4-й недели (рис. 3B). Напротив, вес крыс в нормальной группе неуклонно увеличивался, и их средний вес через 3 дня после индукции диабета был выше, чем в группе диабетиков (рис. 3B). У всех крыс с диабетом наблюдались типичные симптомы жажды, полиурии и потери веса, аналогичные выводам Hao et al.17.
На 7-й и 14-й день после ранения макроскопический анализ показал, что реэпителизация была более выражена у крыс в нормальной группе, чем в группе диабетиков (рис. 4А). Количественные результаты показали, что скорость заживления ран была достоверно ниже в группе диабетиков, чем в группе с нормальным уровнем на 7-й и 14-й день (p < 0,01). Однако на 14-й день скорость заживления ран также может быть выше 90% в группе диабетиков (p < 0,05, рис. 4B). Это говорит о том, что модель раны СД1 характеризуется плохим закрытием, но не в такой степени, как хроническое незаживание, наблюдаемое при диабетических ранах человека.
Окрашивание H&E на 14-й день заживления раны выявило неполный эпидермис раны, медленную пролиферацию кератиноцитов и задержку реэпителизации в группе диабетиков по сравнению с нормальной группой. Диабетические раны показали частичную потерю волосяных фолликулов и сальных желез. Также было меньше видимых капилляров (рис. 5).
Диабет вызывает дисфункцию эндотелиальных клеток, гликозилирование белков внеклеточного матрикса и сосудистую денервацию18. Эти осложнения приводят к более низкому, чем обычно, ангиогенезу ран при диабетических ранах18. Ангиогенез необходим для заживления ран, а раневой ангиогенез часто анализируется с помощью иммуноокрашивания CD31 (рис. 6A)19,20. Исходя из средней оптической плотности (AOD) экспрессии CD31, ангиогенез в месте раны был достоверно выше в норме, чем в группе диабетиков (p < 0,01, рис. 6B).
Рисунок 1: Изображение крыс, обездвиженных фиксаторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема расположения раны крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Уровни глюкозы в крови и вес экспериментальных крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Кожные раны на всю толщину (диаметром 20 мм) на спине экспериментальных крыс. (A) Макроскопический вид ран на 0-й, 7-й и 14-й день. Изображения морфологии ран на 0-й, 7-й и 14-й дни были получены с помощью цифровой камеры. (B) Площадь раны была измерена с помощью программного обеспечения ImageJ и использовалась для расчета скорости заживления раны. Скорость заживления раны (%) рассчитывали следующим образом: (начальная площадь раны − площадь раны в указанный момент времени)/начальная площадь раны × 100. Значения представлены как средние ± SD (n = 14). Статистическая значимость была установлена на уровне ** p < 0,01 и * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные гистопатологические изображения H&E на 14-й день после заживления раны. Синими стрелками обозначены капилляры. Красные стрелки показывают пролиферацию кератиноцитов. Левая шкала: один стержень = 200 мкм; Правая шкала: одна полоса = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания на экспрессию CD31. Уровни CD31 использовались для определения состояния ангиогенеза. (A) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания CD31 в диабетической и нормальной группах. Интегральное значение оптической плотности (IOD) и площадь пикселя (AREA) для каждого образца кожи были рассчитаны с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0. Также было получено среднее значение оптической плотности (AOD) (AOD = IOD/AREA). Значение AOD было прямо пропорционально положительной экспрессии CD31. (B) Количественное сравнение положительной экспрессии CD31 в диабетической и нормальной группах. Данные представлены в виде среднего ± SD. ** p < 0,01. Масштаб: один стержень = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол разъясняет спорные операции при моделировании раны СД1. В этой работе были рассмотрены вопросы, связанные с протоколами инъекций STZ, критериями успеха индукции СД1, временем стабилизации уровня глюкозы в крови, а также расположением и размером раны. Кроме того, уточнены патологические характеристики и измеримые параметры для оценки заживления ран СД1.
Крысы голодали в течение 18 ч перед инъекцией STZ, чтобы избежать конкурентного связывания глюкозы или ее аналогов с β-клетками, что могло повлиять на эффективность STZ. Наиболее часто используемым методом индукции СД1 является однократная высокая доза STZ, которая увеличивает уровень глюкозы в крови за счет повреждения островков и снижения секреции инсулина21. Предэкспериментальные испытания показали, что оптимальная доза STZ для высокой частоты успеха и низкого уровня смертности составила 55 мг / кг, что ниже оптимальных доз, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях22,23,24. В этом протоколе СД1 индуцировали с помощью однократной внутрибрюшинной инъекции 55 мг/кг STZ.
Уровень глюкозы в крови был выше 16,7 ммоль / л через 3 дня после инъекции STZ. Тем не менее, уровень глюкозы в крови выше 16,7 ммоль / л на 7-й день после инъекции STZ является рекомендуемым критерием для успешного моделирования СД1, поскольку степень повреждения островков варьируется у крыс, и соответствующее продление времени диагностики может снизить ложноотрицательную частоту. Кроме того, колебания уровня глюкозы в крови стабилизировались через 5 недель после инъекции STZ, и крысы постепенно набирали вес в течение этого периода, что согласуется с предыдущими результатами25,26. Это указывает на то, что уровень глюкозы в крови в модели СД1 должен быть стабилизирован в течение не менее 6 недель, а увеличение массы крысы через 6 недель снижает показатели смертности при моделировании раны. Следовательно, по этому протоколу проводилось моделирование раны через 8 недель после инъекции STZ.
Частота закрытия раны на 7-й и 14-й день после ранения была значительно ниже у диабетиков, чем в группе с нормальной раной, что указывает на медленное заживление. Более того, реэпителизация раны и ангиогенез были значительно ниже у диабетиков, чем в нормальной группе. Это свидетельствует о том, что модель раны СД1 демонстрирует более медленное заживление ран и замедленную реэпителизацию, чем у нормальных крыс, что может быть связано с патологическими изменениями сниженного раневого ангиогенеза. Однако на 14-й день скорость заживления ран СД1 также была выше 90%, что отличается от хронической незаживляющей характеристики диабетических ран человека. Это может быть связано с тем, что физиологические механизмы заживления ран у грызунов отличаются от таковых у людей27. Следовательно, наилучший диаметр раны составляет не менее 20 мм, что достаточно много, чтобы дать время оценить эффективность вмешательства в исследовании диабетической раны. Расположение раны должно избегать лопатки и позвоночника, так как непрерывное движение в этих двух местах может нарушить заживление раны.
В заключение следует отметить, что построение модели раны СД1 с использованием метода данного протокола является эффективным. Протокол воспроизводит некоторые характеристики хронических диабетических ран, такие как более медленное заживление ран, отсроченная реэпителизация и снижение ангиогенеза по сравнению с обычными ранами крыс. Однако неизвестно, может ли модель воспроизвести другие хронические фенотипы диабетических ран. Кроме того, этот протокол описывает наиболее фундаментальный и широко используемый метод, который не учитывает проблему сокращения кожи у крыс. Будущие исследования могут включать использование раневых шин в этот протокол или изучать дополнительные модели хронических диабетических ран, что станет серьезной проблемой для исследователей в будущем.
Все авторы заявляют, что данная рукопись не имеет конфликта интересов.
Это исследование было финансово поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82104877).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены