유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

요약

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

초록

말라리아는 기생충 플라스모디움(Plasmodium)에 의해 발생하는 치명적인 질병이며 암컷 아노펠레스 모기에 물려 전염됩니다. 척추동물 숙주의 피부에 모기에 의해 침착된 Plasmodium의 sporozoite 단계는 임상 말라리아를 시작하기 전에 간에서 필수 발달 단계를 거칩니다. 우리는 간에서 Plasmodium 발달의 생물학에 대해 거의 알지 못합니다. sporozoite 단계에 대한 접근과 이러한 sporozoite를 유전적으로 변형할 수 있는 능력은 Plasmodium 감염의 특성과 간에서 발생하는 면역 반응을 연구하는 데 중요한 도구입니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 우리는 혈액 병기 P. berghei를 유전자 변형하여 이 형태를 사용하여 Anopheles 모기가 혈액 식사를 할 때 감염시킵니다. 유전자 변형 기생충이 모기에서 발달한 후, 생체 내 및 시험관 내 실험을 위해 모기 타액선에서 기생충의 포자석 단계를 분리합니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 소단위 11(GFP₁₁)을 발현하는 P. berghei의 새로운 균주의 sporozoites를 생성하여 프로토콜의 타당성을 입증하고 간 단계 말라리아의 생물학을 조사하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

서문

말라리아 예방 및 치료에 대한 약물 개발과 연구의 발전에도 불구하고 말라리아로 인한 전 세계적인 질병 부담은 여전히 높습니다. 매년 50만 명 이상이 말라리아로 사망하며, 사하라 사막 이남 아프리카¹과 같은 말라리아 풍토병 지역에 거주하는 어린이들의 사망률이 가장 높다. 말라리아는 플라스모디움(Plasmodium)이라는 기생충에 의해 발생하는데, 이 기생충은 침샘에 기생충을 품고 있는 암컷 아노펠레스 모기에 물려 인간에게 전염됩니다. 플라스모듐(Plasmodium)의 감염 단계인 스포로조이트(sporozoite)는 혈액 식사 중에 척추동물 숙주의 피부에 침착되어 혈류를 통해 이동하여 간세포를 감염시키고, 간세포를 감염시키기 전에 필수 발달(적혈구 전 말라리아 구성)을 거칩니다. 적혈구의 감염은 말라리아의 혈액 단계를 시작하고 질병과 관련된 이환율과 사망률 전체를 담당합니다 ^2,3.

플라스모디움(Plasmodium)의 적혈구 전 발달의 의무적 특성으로 인해 플라스모디움은 예방 백신 및 약물 개발 노력의 매력적인 표적이 되었습니다⁴. 적혈구 전단계 말라리아의 생물학을 연구하고 간 단계를 표적으로 하는 백신 또는 약물 개발을 위한 전제 조건은 Plasmodium sporozoites에 대한 접근입니다. 또한, 유전자 변형 Plasmodium sporozoites를 생성하는 우리의 능력은 그러한 연구 노력의 성공에 중요한 역할을 했습니다 5,6,7,8,9. 형광 또는 발광 리포터 단백질을 발현하는 형질전환 플라스모듐 라인은 생체 내 및 시험관 내 ^10,11의 발달을 추적할 수 있게 해주었습니다. Plasmodium에서 여러 유전자의 결실을 통해 생성된 유전자 약독화 기생충(GAP)도 가장 유망한 백신 후보^{중 일부입니다 12,13}.

설치류 및 비인간 영장류 말라리아 모델은 Plasmodium 종 간의 생물학 및 생활 주기의 유사성으로 인해 인간 말라리아에서 숙주-기생충 상호 작용의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되었습니다¹⁴. 설치류는 감염시키지만 인간은 감염시키지 않는 Plasmodium 종(예: P. berghei)을 사용하면 통제된 생물안전 레벨 1 환경에서 간 단계 말라리아를 연구하기 위해 전체 기생충 수명 주기를 유지하고 감염성 포자체를 생성할 수 있습니다. 형질전환 혈액 단계 플라스모디움 기생충(Plasmodium parasites)¹⁵의 생성, 모기(mosquitoes)¹⁶의 감염 및 스포자조이트(sporozoite)¹⁷의 분리를 위한 다양한 개별 프로토콜이 이미 존재한다. 여기에서는 새로운 형질전환 균주 PbGFP₁₁을 예로 들어 형질전환 P. berghei sporozoites를 생성 및 분리하기 위해 이러한 방법론을 결합한 포괄적인 프로토콜을 간략하게 설명합니다. PbGFP 11은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(GFP)의 11번째 β 가닥인 GFP₁₁을 숙주 간세포에서 생성된 기생 액포(PV)로 전달합니다. PbGFP 11은 세포질(Hepa GFP 1-10 세포)에서 GFP 1-10 단편(GFP _1-10)을 구성하는 잔기를 발현하는 형질전환 간세포(Hepa1-6 배경)와 함께 사용됩니다. PbGFP₁₁은 기능적 GFP 및 녹색 형광 신호(¹⁸)의 자기 보완 및 재형성을 통해 숙주 간세포에서 PV 용해를 보고합니다. 주목할 점은, GFP 11은 PbGFP₁₁에서 일련의 7개의 탠덤 서열로 인코딩되어 결과 형광 신호를 향상시킨다는 것이다. 세포질 염료인 CellTrace Violet(CTV)으로 PbGFP₁₁ sporozoites를 염색하면 기생충을 추적할 수 있습니다. 이러한 CTV 염색 세포 내 기생충의 용해 자체는 CTV가 숙주 세포 세포질로 누출되고 숙주 세포의 염색을 초래합니다. 숙주 간세포에서 Plasmodium PV 및/또는 기생충의 용해를 시각화하고 구별하는 것 외에도 이 시스템은 이러한 경로의 분자 구성 요소의 유전적 또는 치료적 섭동을 통해 이러한 과정 중 하나를 담당하는 면역 경로를 연구하는 데 안정적으로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

우리 실험실의 척추동물과 관련된 모든 연구는 조지아 대학의 동물 사용 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. P. berghei 감염 마우스의 생성

1. 야생형 P. berghei 기생충을 사용하여 수컷 또는 암컷, 6-8주 된 C57BL/6(B6) 마우스에서 혈액 단계 감염을 시작합니다. 이를 위해 400μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 재구성된 냉동 보존된 P. berghei에 감염된 혈액(2 x 10⁵ 감염된 적혈구)을 복강 내(i.p.)로 1개 또는 2개의 기증 마우스에 전달합니다.
2. 감염 후 5일(d.p.i.)에 기증자 마우스에서 후안와 출혈을 통해 수집된 신선한 혈액을 두 마리의 순진한 B6 마우스로 옮깁니다. 이를 위해 200μL의 혈액을 수집하고 300μL의 PBS로 재구성한 다음 200μL ip를 수용 마우스에 주입합니다. 이 시점에서 기증자의 기생충혈증이 2%-5%^{인지 확인하십시오.19,20}.
3. 이전에 설명한 대로 기생충혈증을 모니터링합니다^19,20, 수신자의 2 d.p.i.부터 시작합니다. 기생충혈증이 3%-5%(약 5d.p.i.)인 경우 이식 쥐를 안락사시킨 다음 심장 천자 또는 후안와 출혈을 통해 혈액을 채취합니다. 이산화탄소 흡입 후 자궁 경부 탈구를 사용하거나 기관 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
   참고: 기생충혈증이 5%를 초과하면 증식 감염된 적혈구의 유병률 증가로 인해 형질주입 효율이 감소할 수 있습니다.

2. 문화에서 분열체의 생성

1. 1.3단계에서 감염된 마우스의 혈액을 수집하여(2마리의 마우스에서 총 약 2mL) 멸균 환경에서 5mL의 Alsever의 용액( 재료 표 참조)을 넣습니다. 멸균 조건에서 2.1-3.12단계를 수행합니다.
   알림: 멸균 조건에는 장갑 착용, 70% 에탄올로 장갑 및 표면 닦기, 멸균 소모품 및 재료 사용, 생물 안전 캐비닛 내 작업이 포함됩니다.
2. 실온(RT)에서 450 x g 에서 8분 동안 혈액을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 10mL의 완전한 RPMI 배지(20% 소 태아 혈청[FBS] 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 1% 함유 RPMI 1640, v/v)에 재현탁시킵니다.
3. RT에서 450 x g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 25mL의 완전한 RPMI 배지에 재현탁시키고 필터 캡이 있는 T75 배양 플라스크로 옮깁니다.
4. 36.5 °C 및 5 % CO₂ 의 인큐베이터에 넣고 부드럽게 흔들어 세포를 16 시간 동안 부유 상태로 유지합니다.
5. 16시간 시점에서 schizont 발달을 확인합니다. 이를 위해 샘플 500μL를 수집하고 450 x g 에서 8분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 10μL의 완전한 RPMI 배지에 재현탁하고 얇은 혈액 도말을 준비합니다. Giemsa 염색¹⁹ ( 재료 표 참조)로 혈액 얼룩을 염색하고 주혈 빈도를 결정합니다(그림 1).
6. 최적의 형질주입 효율을 위해서는 기생충의 60%-70%가 분열기 단계에 있어야 합니다. 이 임계값보다 적은 것으로 결정되면 2.4단계에서와 같이 배양을 계속하고 진행하기 전에 위의 임계값을 초과했는지 매시간 확인합니다.

3. Plasmodium schizonts의 형질주입

1. 50mL 원심분리 튜브에서 1.44mL의 1.5M NaCl 및 5.6mL의 0.15M NaCl로 13mL의 밀도 그래디언트 스톡 배지( 재료 표 참조)를 재구성하여 그래디언트 원심분리 완충액을 준비합니다.
2. 25mL의 혈액 배양액을 새로운 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 좁은 유리 피펫을 사용하여 20mL의 그래디언트 원심분리 버퍼를 원심분리 튜브 바닥에 조심스럽게 레이어링하여 그래디언트 컬럼을 만듭니다. 액체층과 계면을 건드리지 않도록 주의하고 버퍼와 매체 사이의 명확한 구분을 확인하십시오.
3. RT에서 브레이크 없이 450 x g 에서 20분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양 배지와 그래디언트 원심분리 완충액의 계면에 위치한 분열층¹⁵ 를 조심스럽게 제거하고 새 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
4. 분리된 분열체를 완전한 RPMI 배지에 재현탁시키고 총 부피를 40mL로 올립니다. 상온에서 450 x g 에서 8분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
5. 10mL의 완전한 RPMI 배지에 주혈기를 재현탁시킵니다. 그런 다음 각 transfection에 대해 이 용액 1mL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 16,000 x g 에서 5초 동안 원심분리하여 감염된 적혈구를 펠트합니다. 위와 같은 방식으로 2마리의 마우스에서 유래한 감염된 적혈구는 최대 10개의 개별 형질주입에 사용할 수 있습니다.
6. RT에서 100 μL의 electroporation buffer (electroporation kit의 nucleofector solution, 재료 표 참조)를 별도의 1.5 mL microcentrifuge tube에서 각 transfection에 적용 가능한 5 μg의 원형 또는 선형화된 target plasmid DNA(최대 10 μL 용량)와 결합합니다. "no plasmid" 샘플은 transfection 및 항생제 선택을 위한 대조군으로 포함되어야 합니다.
7. 3.5단계에서 원심분리 후 상층액을 제거하고 감염된 적혈구를 준비된 뉴클레오펙터 용액 + 플라스미드 DNA(3.6단계)에 조심스럽게 재현탁시킵니다.
8. 현탁액(뉴클레오펙터 용액 + 플라스미드 + schizonts, 최대 110μL)을 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다. 적절한 뉴클레오펙터 프로그램(U-033, 문헌 참조)을 사용하여 형질주입한다.
   알림: 3.8-3.10단계가 RT에서 수행되었는지 확인하십시오.
9. 큐벳에 100μL의 전체 RPMI 배지를 추가하고 전체 용액(현재 총 부피 200μL)을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 상온으로 유지합니다.
10. 형질주입된 기생충의 200μL 용액을 생쥐에 정맥 주사(즉)하여 형질주입과 생쥐에 대한 최종 주입 사이의 시간을 최소화합니다.
    참고: transfection된 schizont는 프로토콜의 효율성을 극대화하기 위해 electroporation 후 5분 이내에 마우스에 주입됩니다.

4. 형질주입된 기생충의 선택

1. 감염을 확인하기 위해 매일 2 d.p.i.에서 형질 주입된 주혈 세포를 접종한 마우스의 기생충 혈증 수치를 확인하십시오.
2. 감염이 확인되면 임시로 제공되는 식수에 약물을 경구 투여하여 약물 선택을 시작합니다.
   참고: 피리메타민(Pyrimethamine)은 플라스미드에 대한 선택 가능한 약물 마커로 사용되었다. 이 경우, 17.5mg의 피리메타민을 250mL의 깨끗한 물(최종 농도 70mg/L)에 첨가하였다. 또한, 생쥐가 피리메타민을 함유한 물의 적절한 섭취를 장려하기 위해 이 물에 설탕 10g을 첨가했습니다.
3. 피리메타민 치료 시작 후 6일부터 5μl의 혈액으로 만든 혈액 도말을 사용하여 이틀마다 기생충혈증을 모니터링합니다. 15일 후에도 검출 가능한 기생충이 없다는 것은 형질주입이 실패했음을 나타냅니다. 이 경우 새로운 시도를 위해 1.1단계부터 프로세스를 다시 시작합니다.
4. 기생충혈증이 1% 이상에 도달하면 기생충을 순진한 B6 마우스로 옮겨 혈액 단계 기생충 스톡을 생성합니다. 기생충혈증이 2%-5%에 도달할 때까지 새로 감염된 마우스에서 선택을 계속하고, 이 시점에서 스톡을 생성하고 냉동 보존한다²¹.

5. 유전자 변형 계통을 가진 모기의 감염

1. 선택된 기생충이 포함된 200μL의 혈액으로 B6 마우스를 감염시킵니다(2 x 10⁵ 감염된 적혈구/마우스, i.v.). 모기 먹이 및 감염 당일에 이 쥐의 기생충혈증을 결정합니다. 2%-5% 사이의 기생충혈증은 모기 감염에 최적입니다. 확인되면 즉시 5.2-5.4단계에 따라 암컷 Anopheles stephensi 모기로 감염을 옮깁니다.
   알림: 감염을 위해 모기가 들어 있는 인큐베이터는 20.5°C, 습도 80%, 12시간 명암 주기(오전 07:00에서 오후 07:00 사이에 켜짐)로 유지해야 합니다.
2. 모기에 감염되기 전날, 37°C로 가열된 물로 채워진 얇은 플라스틱 방광이나 장갑과 같이 수컷과 암컷 모기가 모두 들어 있는 열원을 케이지 위에 놓아 암컷 모기를 분리합니다. 곤충 흡인기(insect aspirator)를 사용하여 열원에 유인되는 암컷 모기를 제거하고 감염을 위해 별도의 작은 케이지로 옮깁니다.
   알림: 수컷 모기는 약간 줄어든 몸 크기와 깃털 더듬이로 암컷 모기와 구별할 수 있습니다.
3. 감염된 쥐에게 전신 마취제(예: 2% 트리브로모에탄올/아버틴)를 주입합니다. 각 마우스의 발 패드를 단단히 조여 완전한 마취를 보장합니다. 반응이 없으면 충분히 진정되어 감염을 모기로 옮길 준비가 되어 있습니다.
4. 마취된 마우스를 흉골 누운 상태에서 우리에 갇힌 암컷 모기(5.2단계부터) 위에 놓습니다. 앞다리와 뒷다리를 수동으로 벌려 모기 먹이를 위한 가장 큰 표면적을 제공합니다. 감염된 쥐를 각 케이지 위에 총 15분 동안 두고, 5분마다 쥐가 깨어 있지 않은지 확인합니다. 먹이가 완료되면 자궁경부 탈구를 사용하거나 기관 동물 사용 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키고 안전하게 폐기하십시오.

6. sporozoites의 수집

1. 약 10d.p.i.에서 모기 중창자에 난포가 있는지 확인하여 성공적인 감염과 모기 내 Plasmodium 의 발달을 확인합니다. 집게를 사용하여 말단 복부 분절을 제거하여 복부에서 모기 중장을 분리합니다. 난포낭의 존재에 대해 편광된 빛 아래에서 midguts를 시각화합니다²².
2. 야생형 포자동물은 감염된 쥐를 먹은 후 18-21일 후에 모기의 타액선에 존재할 것으로 예상됩니다. 18일째에 5-10마리의 모기를 해부하여 sporozoite 수를 평가합니다.
   알림: 모기는 씻고 에탄올로 죽입니다. 그 후, 죽은 모기는 해부 전에 파편을 제거하기 위해 PBS로 두 번 씻습니다.
3. 포자동물을 분리하고 계산하려면 집게나 미세한 해부 바늘을 사용하여 모기 흉부에 압력을 가하면서 모기의 머리를 조심스럽게 제거합니다. 타액선은 제거된 머리에 부착된 상태로 남아 있습니다(그림 2).
4. 타액선에서 추가 모기 부스러기를 제거하고 400μL의 모기 해부 배지(1% 마우스 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco의 변형 Ealge 배지[DMEM], 재료 표 참조)가 들어 있는 미세 원심분리 튜브에 넣습니다.
5. 30G의 바늘 주사기를 15-20회 통과시켜 고립된 타액선을 파괴합니다. 파괴된 타액선 10μL를 모기 해부 배지에 넣고 혈구계에 넣고 계산합니다. 마우스에 주입, 세포 배양에 접종 또는 장기 동결 보존을 위해 원하는 농도의 모기 해부 배지 또는 PBS에 재현탁합니다^23,24.

결과

주혈기의 빈도와 발달을 결정하는 것은 충분한 생존 가능한 기생충이 형질주입을 위한 최적의 단계에 있는지 확인하는 데 중요합니다. 미성숙 분열체는 적혈구의 전체 세포 내 공간을 채우지 않는 더 적은 수의 메로조이트의 존재에 의해 완전히 성숙한 분열체와 구별될 수 있습니다(그림 1B). 배양된 혈액에서 혈액 도말을 만들 때 감염된 적혈구가 터져 혈액 도말에서 유리 ?...

토론

우리는 실험실에서 위의 프로토콜을 사용하여 여러 계통의 형질전환 P. berghei 기생충을 만들었습니다. P. berghei에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜을 사용하여 형질전환 P. yoelii sporozoites를 생성하는 데에도 성공했습니다. 형질주입된 분열체를 마우스에 주입한 후, 기생충은 플라스미드 대조군이 없는 그룹을 포함하여 모든 그룹에서 일반적으로 3 d.p.i. 이하로 검출될 수 있다. ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3