Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Resumo

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&RUN).

Resumo

Análises genômicas amplas com populações de pequenas células são uma grande restrição para estudos, particularmente no campo de células-tronco. Este trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento de células satélites do músculo do membro ativado por fluorescência (FACS), um tecido com alto conteúdo de proteínas estruturais. Os músculos dos membros dissecados de camundongos adultos foram mecanicamente interrompidos pela picagem em meio suplementado com dispase e colagenase tipo I. Após a digestão, o homogeneizado foi filtrado através de filtros celulares, e as células foram suspensas em tampão FACS. A viabilidade foi determinada pela coloração de viabilidade fixável, e as células satélites imunomarcadas foram isoladas por FACS. As células foram lisadas com Triton X-100 e os núcleos liberados foram ligados a esferas magnéticas de concanavalina A. Complexos núcleo/grânulo foram incubados com anticorpos contra o fator de transcrição ou modificações de histonas de interesse. Após as lavagens, os complexos núcleo/grânulo foram incubados com a proteína A-micrococcal nuclease, e a clivagem da cromatina foi iniciada com CaCl₂. Após a extração do DNA, bibliotecas foram geradas e sequenciadas, e os perfis para ligação do genoma amplo ao fator de transcrição e modificações covalentes de histonas foram obtidos por análise bioinformática. Os picos obtidos para as várias marcas de histonas mostraram que os eventos de ligação foram específicos para células satélites. Além disso, a análise de motivos conhecidos revelou que o fator de transcrição estava ligado à cromatina através de seu elemento de resposta cognato. Este protocolo é, portanto, adaptado para estudar a regulação gênica em células satélites musculares de membros de camundongos adultos.

Introdução

Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano¹. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem as^lesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites³. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras^musculares4. Foi relatado que eles expressam o cluster de diferenciação 34 (CD34; um marcador hematopoiético, progenitor endotelial e de células-tronco mesenquimais), integrina alfa 7 (ITGA7; um marcador liso, cardíaco e músculo esquelético), bem como o receptor de quimiocina C-X-C tipo 4 (CXCR4; um marcador de linfócitos, hematopoiéticos e células satélites)⁵. Em condições basais, as células satélites residem em um microambiente particular que as mantém em estado^quiescente6. Com o dano muscular, tornam-se ativados, proliferam e sofrem miogênese⁷. No entanto, contribuindo apenas para uma pequena fração do número total de células musculares, suas análises genômicas são particularmente desafiadoras, especialmente em ambientes fisiológicos (<1% do total de células).

Vários métodos para isolamento de cromatina a partir de células satélites têm sido descritos, os quais envolvem imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento paralelo maciço (ChIP-seq) ou clivagem sob alvos e experimentos de tagmentação (CUT&Tag). No entanto, essas duas técnicas apresentam algumas limitações significativas que permanecem incontestadas. De fato, ChIP-seq requer uma alta quantidade de material de partida para gerar cromatina suficiente, uma grande proporção da qual é perdida durante a etapa de sonicação. CUT&Tag é mais apropriado para baixo número de células, mas gera mais locais de clivagem fora do alvo do que ChIP-seq devido à atividade de transposição Tn5. Além disso, como essa enzima tem alta afinidade por regiões de cromatina aberta, a abordagem CUT&Tag pode ser preferencialmente usada para analisar modificações de histonas ou fatores de transcrição associados a regiões ativamente transcritas do genoma, em vez de heterocromatina silenciada ^8,9.

Apresenta-se aqui um protocolo detalhado que permite o isolamento de células satélites musculares de membros de camundongos por FACS para clivagem sob alvos e liberação utilizando análise de nucleases (CUT&RUN)^10,11. As várias etapas envolvem a ruptura mecânica do tecido, a classificação celular e o isolamento dos núcleos. A eficiência do método, no que se refere à preparação de uma suspensão celular viável, foi demonstrada através da análise CUT&RUN para modificações de histonas covalentes e fatores de transcrição. A qualidade das células isoladas torna o método descrito particularmente atraente para a preparação de cromatina que captura fielmente o estado de ocupação genômica nativa, e é provável que seja adequado para capturar a conformação cromossômica em combinação com o sequenciamento de alto rendimento em loci específicos (4C-seq) ou em níveis genômicos amplos (Hi-C).

Protocolo

Os camundongos foram mantidos em biotério credenciado, de acordo com as Diretrizes Nacionais de Cuidados com Animais (Diretiva 86/609/CEE da Comissão Europeia; Decreto francês no.87-848) sobre o uso de animais de laboratório para pesquisa. As manipulações pretendidas foram submetidas ao Comitê de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, França) e ao Ministério da Pesquisa francês (MESR) para avaliação ética e autorização de acordo com a diretiva 2010/63/EU sob o número APAFIS #22281.

1. Preparação da suspensão celular para isolamento de células satélites por fluorescência (FACS) (Figura 1)

1. Isolamento do tecido muscular
   1. Descontaminar os instrumentos de dissecção muscular, incluindo pinças, bisturis e tesouras, com um agente de limpeza (Tabela 1), e enxaguar abundantemente com água destilada.
   2. Preparar dois tubos de 2 mL (Tabela 1), cada um contendo 1 mL de tampão de isolamento muscular, e colocá-los sobre gelo para coleta dos músculos colhidos.
   3. Sacrificar dois camundongos machos C57/Bl6J com 10 semanas de idade por asfixia por CO₂ seguida de luxação cervical. Borrife etanol a 70% sobre cada rato inteiro. Descasque a pele do membro posterior usando pinças. Disseque todos os músculos dos membros ao redor do fêmur, tíbia e fíbula (aproximadamente 1 mg de músculos por camundongo).
      NOTA: O número de células satélites diminui após 15 semanas de idade.
   4. Colocar os músculos dos membros colhidos em tubos de 2 ml contendo 1 ml de tampão de isolamento muscular preparado no passo 1.1.2. Colete os músculos do segundo mouse seguindo o mesmo procedimento. Pique os músculos colhidos com tesoura sobre gelo até obter fragmentos menores que^{1 mm 3} .
      OBS: Os músculos foram coletados e picados principalmente conforme descrito¹². Efectuar a digestão dos tecidos seguindo os passos 1.2 ou 1.3.
2. Digestão tecidual com enzima colagenase
   1. Transferir a suspensão do músculo picado dos dois camundongos despejando-os em um tubo de 50 mL (Tabela 1) contendo 18 mL de tampão de isolamento muscular (suplementado com 5 mL [5 U/mL] de dispase e 5 mg de colagenase tipo I) (Tabela 1).
   2. Fechar bem o tubo e selá-lo com filme de laboratório (Tabela 1). Colocar horizontalmente em banho-maria (Tabela 1) a 37 °C a 100 rpm por 30 min.
   3. Após 30 min, adicionar 5 mg de colagenase tipo I. Mantenha os tubos por mais 30 min sob agitação em banho-maria a 37 °C a 100 rpm.
   4. Após a digestão, pipetar a suspensão muscular para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mL para melhorar a eficiência da dissociação. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Um pellet transparente será visível no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante com pipeta de 10 mL, deixando 5 mL de meio no tubo.
      NOTA: Deixar o meio ajuda a evitar o estresse das células. Adicionar 10 mL de tampão de isolamento muscular fresco e ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL.
   5. Colocar filtros celulares de 100 μm, 70 μm e 40 μm (um de cada tipo) (Tabela 1) em tubos abertos de 50 mL. Pipetar a suspensão para os filtros celulares sucessivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) e coletar o fluxo para os tubos de 50 mL, contendo células abaixo de 40 μm.
   6. Centrifugar a suspensão a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL até restarem 2 mL e, em seguida, use uma pipeta de 0,2-1 mL até que restem 100-200 μL. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de lise eritrocitária (Tabela 2). Incubar no gelo por 3 min.
   7. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL. Ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS frio (Tabela 2). Coloque no gelo.
3. Método alternativo para digestão tecidual com a enzima Liberase termolisina baixa (TL)
   1. Siga as descrições na etapa 1.1. para isolamento tecidual.
   2. Para desagregação tecidual mediada por liberase, colher os músculos em 2 mL de tampão de isolamento do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabela 2), em vez do tampão de isolamento muscular descrito no passo 1.1.2.
   3. Transferir a suspensão muscular picada dos dois camundongos despejando-os em um tubo de 50 mL (Tabela 1) contendo 18 mL de tampão de isolamento RPMI suplementado com 300 ou 600 μL de LT de Liberase a 5 mg/mL (Tabela 1) (ou seja, concentrações finais de 0,083 mg/mL e 0,167 mg/mL, respectivamente)¹³.
   4. Fechar bem o tubo e selá-lo com filme de laboratório (Tabela 1). Colocar horizontalmente em banho-maria (Tabela 1) a 37 °C a 100 rpm por 30 min.
   5. Após a digestão, pipetar a suspensão muscular para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mL para dissociar e melhorar a eficiência da dissociação.
   6. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Um pellet transparente será visível no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante com pipeta de 10 mL, deixando 5 mL de meio no tubo. Deixar o meio ajuda a evitar o estresse das células. Adicionar 10 mL de tampão de isolamento RPMI fresco e ressuspender o pellet pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL.
   7. Colocar filtros celulares de 100 μm, 70 μm e 40 μm (um de cada tipo) (Tabela 1) em tubos abertos de 50 mL.
   8. Pipetar a suspensão em filtros celulares sucessivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) e coletar o fluxo para os tubos de 50 mL, contendo células abaixo de 40 μm.
   9. Centrifugar a suspensão a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL até restarem 2 mL e, em seguida, use uma pipeta de 0,2-1 mL até que restem 100-200 μL.
   10. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de lise eritrocitária (Tabela 2). Incubar no gelo por 3 min.
   11. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL.
   12. Ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS frio (Tabela 2). Coloque no gelo.
4. Preparação de suspensão celular para isolamento de FACS
   1. Transferir 10 μL da suspensão celular obtida na etapa 1.2.12 para um tubo fresco de 1,5 ml. Esta amostra constituirá o controle não corado ou o controle negativo (Figura 2). Adicionar 190 μL de tampão FACS, transferir para um tubo de 5 mL (Tabela 1) e armazenar em gelo.
   2. Centrifugar os restantes 90 μL da suspensão celular obtida no passo 1.2.12 a 4 °C a 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta (volume da ponta de 20-200 μL). Incubar as células com 400 μL de coloração de viabilidade fixável (Tabela 3) diluída em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sem soro por 15 min à temperatura ambiente (TR).
   3. Lavar as células por centrifugação a 4 °C a 400 x g durante 5 min e adicionar 100 μL de tampão FACS. Inverta suavemente os tubos três vezes e centrifugue novamente a 4 °C a 400 x g durante 5 min.
   4. Durante o tempo de centrifugação, preparar 100 μL de uma mistura mestre de anticorpos primários acoplados a fluoróforos e direcionados contra CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 e CXCR4 (Tabela 3), diluídos em tampão FACS.
   5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante celular utilizando uma pipeta (volume de ponta de 20-200 μL) e adicionar a mistura de anticorpos de 100 μL. Inverta suavemente o tubo três vezes. Não vórtice. Incubar no escuro no gelo por 30 min.
   6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 20-200 μL e adicione 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x para lavar as células. Inverta suavemente o tubo três vezes. Recentrifugar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta de 20-200 μL.
   7. Ressuspender o pellet de células em 500 μL de tampão FACS e transferir a suspensão para um tubo de 5 mL.
      NOTA: a suspensão celular obtida da digestão com Liberase é processada da mesma forma.
5. Seleção de células satélites por FACS
   1. Vórtice brevemente a suspensão celular (2-5 s) e processe as células em um citômetro de fluxo equipado com um bocal de 100 μm (Tabela 1).
   2. Determinar os vários tamanhos de porta com base na amostra não manchada armazenada na etapa 1.4.1 (Figura 2).
   3. Cubra um tubo de 5 mL com 1 mL de soro fetal puro para bezerro (SFC) para melhorar a coleta celular e adicione 500 μL de tampão FACS.
   4. Troque a amostra não corada pela amostra marcada com anticorpos.
   5. Selecionar a população de interesse de acordo com a área de dispersão anterior (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A) (Figura 3A), e remover células duplas com a altura de dispersão FSC-A e anterior (FSC-H) (Figura 3B)¹⁴.
   6. Identificar células vivas com viabilidade fixável, coloração negativa (Figura 3C).
   7. Selecione células negativas para CD31, CD45, TER119 e CD11b (Figura 3D).
   8. Para identificar células satélites, selecione primeiro as células positivas para CD34 e ITGA7 (Figura 3E) e, em seguida, selecione as células CXCR4 positivas na população selecionada para CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
   9. Coletar as células selecionadas (entre 40.000 e 80.000 células, de acordo com a qualidade da preparação) no tubo revestido de 5 mL contendo 500 μL de tampão FACS.

2. Validação da população isolada em cultura de tecidos

1. Revestimento de lâmina com hidrogel
   1. Diluir 280 μL de uma matriz qualificada com células estaminais embrionárias humanas (hESC) de hidrogel puro (Tabela 1) em 12 ml de meio DMEM/F12 sem soro.
   2. Cobrir uma lâmina de câmara (Tabela 1) com a solução de hidrogel e incubá-la durante a noite a 4 °C.
   3. No dia seguinte, incubar a lâmina da câmara a 37 °C e 5% CO₂ por 1 h antes da semeadura celular.
2. Crescimento e diferenciação celular
   1. Placatear aproximadamente 20.000 células, obtidas a partir do passo 1.5.9, por poço, e cultivá-las em meio de cultura (Tabela 2) por 5 dias. Realizar imagens de contraste de fase em microscópio de campo claro (Figura 4A), antes de processá-las para análise de imunofluorescência para garantir a qualidade do preparo (Figura 4B).
   2. Para induzir a miogênese, crescer células satélites amplificadas a partir do passo 2.2.1 em meio miogênico (Tabela 2) por mais 7 dias. Captar imagens de contraste de fase em microscópio de campo claro (Figura 4C) antes de processá-las para análise de imunofluorescência para garantir a qualidade do preparo (Figura 4D).
3. Análise por imunocitofluorescência
   1. Remover suavemente o meio, lavar as células que foram cultivadas em lâmina de câmara com 100 μL de 1x PBS duas vezes e fixá-las com 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4 % em TR por 1 h.
      OBS: Esta etapa deve ser realizada com cuidado. Um pequeno volume de meio deve ser sempre mantido na câmara para evitar estresse das células, e o PBS deve ser derramado através das paredes da câmara.
   2. Lavar as células três vezes com 100 μL de PBS 1x, suplementado com Tween 20 a 0,1% (PBST) para permeabilizar as membranas celulares.
   3. Bloquear sinais inespecíficos por incubação em 100 μL de 1x PBST suplementado com 5% FCS (PBST-FCS) em TR por 1 h.
   4. Incubar as células com 100 μL de uma mistura mestra de anticorpos anti-PAX7 e antidistrofina (DMD) (diluídos em 1x PBST-FCS) a 4 °C durante a noite, para detectar células satélites e miofibras, respectivamente.
   5. Lavar as células três vezes com 100 μL de 1x PBST e incubá-las com 100 μL de anticorpos secundários de cabra anti-camundongo Cy3 ou cabra anti-coelho Alexa 488 (Tabela 3) diluídos em 1x PBST-FCS em TR por 1 h.
   6. Dissociar os orifícios da lâmina utilizando o equipamento fornecido pelo fornecedor, adicionar 20 μL de meio de montagem aquoso com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e cobrir a lâmina com uma lamínula (Tabela 1).
   7. Observar e capturar a imagem das células coradas com um microscópio confocal.
   8. Processar as imagens utilizando um software de análise de imagens (Figuras 4B,D).

3. Análise CUT&RUN

1. Preparação de amostras para análise CUT&RUN em células satélites isoladas por FACS
   NOTA: CUT&RUN foi realizado essencialmente como descrito^10,15. A composição do tampão é apresentada em Tabela 2.
   1. Para o ensaio CUT&RUN, utilizar aproximadamente 40.000 das células obtidas no método 1, etapa 1.5.9, por amostra/anticorpo que deve ser testado.
   2. Centrifugar as células satélites isoladas do FACS em RT a 500 x g por 10 min e, em seguida, descartar o sobrenadante usando uma pipeta (volume de ponta de 20-200 μL).
   3. Lavar as células com 1 mL de PBS 1x, centrifugar em TR a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante com pipeta (volume da ponta de 0,2-1 mL) e ressuspendê-las em 1 mL de tampão de extração nuclear frio (Tabela 2). Incubar no gelo por 20 min.
   4. Durante a incubação, preparar um tubo de 1,5 mL contendo 850 μL de tampão de ligação a frio (Tabela 2) e adicionar 20 μL de esferas magnéticas revestidas com concanavalina A por amostra (Tabela 1).
   5. Lavar as contas duas vezes com 1 mL de tampão de ligação a frio usando um rack magnético (Tabela 1). Para cada lavagem ou troca de tampão ao longo do procedimento, deixe as contas se acumularem ao lado do tubo no rack magnético por 5 min antes de remover o sobrenadante limpo com uma pipeta (volume de ponta de 0,2-1 mL). Em seguida, ressuspenda suavemente em 300 μL de tampão de ligação a frio.
   6. Centrifugar os núcleos a 4 °C a 600 x g durante 5 min e ressuspendê-los suavemente em 600 μL de tampão de extracção nuclear. Misturar suavemente os 600 μL dos núcleos extraídos com os 300 μL da pasta de esferas de concanavalina A e incubar a 4 °C durante 10 minutos.
   7. Remover o sobrenadante com um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, e ressuspender suavemente os núcleos ligados ao cordão com 1 ml de tampão de bloqueio a frio (Tabela 2). Incubar em TR por 5 min.
   8. Remova o sobrenadante com um rack magnético e lave os núcleos ligados ao cordão duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem a frio (Tabela 2). Durante a segunda lavagem, divida igualmente os núcleos ligados ao grânulo em tubos de 1,5 mL. Cada tubo será tratado com um anticorpo específico na etapa seguinte.
      NOTA: Neste exemplo, 250 μL de núcleos ligados a contas foram divididos em quatro tubos de 1,5 mL.
   9. Separe o sobrenadante utilizando um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, e aspirar com uma pipeta. Ressuspender suavemente os complexos núcleo/grânulos com um anticorpo primário específico (Tabela 3), ou uma IgG de outra espécie (aqui coelho) diluída em 250 μL de tampão de lavagem a frio. Incubar a 4 °C durante a noite com agitação suave.
      NOTA: Os anticorpos usados aqui são direcionados contra AR, H3K4me2 e H3K27ac.
   10. Remover o sobrenadante com um rack magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, lavar os núcleos ligados ao cordão duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem a frio e ressuspender em 100 μL de tampão de lavagem a frio.
   11. Diluir a proteína A-nuclease microcócica a 1,4 ng/μL em 100 μL por amostra de tampão de lavagem a frio.
   12. Adicionar 100 μL de proteína A-nuclease microcócica aos 100 μL de amostra obtidos no ponto 3.1.11 e incubar a 4 °C durante 1 h com agitação.
   13. Remover o sobrenadante com um suporte magnético, conforme descrito no passo 3.1.4, lavar duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem a frio e ressuspender os núcleos ligados ao cordão em 150 μL de tampão de lavagem a frio.
   14. Para iniciar a clivagem do DNA, adicione 3 μL de 100 mM de CaCl₂ aos 150 μL da amostra, misture rapidamente agitando e incube no gelo por 30 min. Parar a reacção adicionando 150 μL de tampão de paragem e incubar a 37 °C durante 20 minutos para digerir o ARN e libertar os fragmentos de ADN.
   15. Para a extração de DNA, centrifugar as amostras a 16.000 x g a 4 °C por 5 min.
   16. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microfuga e descarte o pellet e as contas.
   17. Adicionar 3 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 2,5 μL de 20 mg/mL de proteinase K. Misturar por inversão. Incubar durante 10 min a 70 °C (sem agitação).
   18. Adicionar 300 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, vórtice, transferir para tubos phase-lock de 2 mL (pré-girados por 5 min a 16.000 x g) e centrifugar por 5 min a 16.000 x g a 4 °C.
   19. Adicionar 300 μL de clorofórmio ao mesmo tubo e centrifugar durante 5 minutos a 16.000 x g a 4 °C. Coletar o sobrenadante (~300 μL) com uma pipeta (0,2-1 mL de volume da ponta) e transferir para um novo tubo de 1,5 mL.
   20. Adicionar 1 μL de glicogênio (concentração de 20 mg/mL).
   21. Adicionar 750 μL de etanol a 100% e precipitar durante a noite a -20 °C.
   22. Pellet o DNA por centrifugação por 15 min a 16.000 x g a 4 °C. Lavar o pellet com 1 mL de etanol 100%, centrifugar por 5 min a 16.000 x g, descartar o sobrenadante, centrifugar por 30 s a 16.000 x g e retirar o líquido com pipeta (volume de ponta de 20-200 μL).
   23. Seque o pellet ao ar por ~5 min. Ressuspender em 25 μL de Tris-HCl 1 mM (pH 8) e ácido etilenodiaminotetracético 0,1 mM (EDTA; pH 8).
2. Análise de bioinformática
   1. Preparar bibliotecas a partir de DNA imunoclivado e sequenciá-las como leituras pareadas de 100 pb com a ajuda da plataforma genômica conforme descrito¹⁶.
   2. Remova as leituras sobrepostas à região da lista negra ENCODE (V2) e separe as leituras restantes em dois grupos: tamanho do fragmento <120 pb (sem nucleossomo, em geral para fatores de transcrição) e tamanho do fragmento >150 pb (com nucleossomos, normalmente para marcas de histonas). Mapeie para o genoma de referência mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)¹⁷.
   3. Gere arquivos bigwig com bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
   4. Retenha leituras mapeadas exclusivamente para análise adicional.
   5. Gere arquivos bedgraph brutos com genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
   6. Use o algoritmo SEACR 1.3 (opção rigorosa) para a chamada de pico. Carregue o arquivo de bedgraph de dados de destino no formato de bedgraph UCSC que omite regiões contendo sinal zero e arquivo de bedgraph de dados de controle (IgG) para gerar um limiar empírico para chamadas de pico¹⁸.
   7. Realizar análise de correlação de Pearson com deeptools para determinar a similaridade entre as amostras¹⁹. Use a linha de comando multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguido por plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
   8. Visualize os perfis de intensidade genômica com IGV²⁰ usando arquivos bedgraph e os picos de arquivo de leito obtidos do SEACR.
   9. Use HOMER para anotação de pico e pesquisa de motivos²¹.
   10. Finalmente, compare os conjuntos de dados com os publicados anteriormente com o navegador ChIP-Atlas Peak para visualizá-los no IGV e/ou análise de enriquecimento usando os arquivos de leito gerados pelo SEACR como um conjunto de dados de entrada²².

Resultados

Células satélites de músculos esqueléticos de camundongos foram isoladas pela combinação dos protocolos de Gunther et ^al.12 e Liu et ^al.23 (doravante Protocolo 2). Como as fibras musculares não digeridas foram observadas após a digestão quando se utilizou a concentração de colagenase e dispase proposta no Protocolo 1, a quantidade de enzimas foi aumentada para melhorar a dissociação das fibras musculares, conforme descrito nas etapas 1.2.1 e 1.2.3. Conforme ind...

Discussão

O presente estudo relata um método padronizado, confiável e de fácil execução para o isolamento e cultivo de células satélites de camundongos, bem como a avaliação da regulação transcricional pelo método CUT&RUN.

Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é a ruptura muscular e digestão de fibras para garantir um alto número de células coletadas. Apesar do aumento da concentração enzimática, mais células vivas foram obtidas do que usando o Protocolo 1. As c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724