Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Summary

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&RUN).

Abstract

Análises genômicas amplas com populações de pequenas células são uma grande restrição para estudos, particularmente no campo de células-tronco. Este trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento de células satélites do músculo do membro ativado por fluorescência (FACS), um tecido com alto conteúdo de proteínas estruturais. Os músculos dos membros dissecados de camundongos adultos foram mecanicamente interrompidos pela picagem em meio suplementado com dispase e colagenase tipo I. Após a digestão, o homogeneizado foi filtrado através de filtros celulares, e as células foram suspensas em tampão FACS. A viabilidade foi determinada pela coloração de viabilidade fixável, e as células satélites imunomarcadas foram isoladas por FACS. As células foram lisadas com Triton X-100 e os núcleos liberados foram ligados a esferas magnéticas de concanavalina A. Complexos núcleo/grânulo foram incubados com anticorpos contra o fator de transcrição ou modificações de histonas de interesse. Após as lavagens, os complexos núcleo/grânulo foram incubados com a proteína A-micrococcal nuclease, e a clivagem da cromatina foi iniciada com CaCl₂. Após a extração do DNA, bibliotecas foram geradas e sequenciadas, e os perfis para ligação do genoma amplo ao fator de transcrição e modificações covalentes de histonas foram obtidos por análise bioinformática. Os picos obtidos para as várias marcas de histonas mostraram que os eventos de ligação foram específicos para células satélites. Além disso, a análise de motivos conhecidos revelou que o fator de transcrição estava ligado à cromatina através de seu elemento de resposta cognato. Este protocolo é, portanto, adaptado para estudar a regulação gênica em células satélites musculares de membros de camundongos adultos.

Introduction

Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano¹. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem as^lesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites³. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras^musculares4. Foi relatado que eles expressam o....

Protocol

Os camundongos foram mantidos em biotério credenciado, de acordo com as Diretrizes Nacionais de Cuidados com Animais (Diretiva 86/609/CEE da Comissão Europeia; Decreto francês no.87-848) sobre o uso de animais de laboratório para pesquisa. As manipulações pretendidas foram submetidas ao Comitê de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, França) e ao Ministério da Pesquisa francês (MESR) para avaliação ética e autorização de acordo com a diretiva 2010/63/EU sob o número APAFIS #22281.

Discussion

O presente estudo relata um método padronizado, confiável e de fácil execução para o isolamento e cultivo de células satélites de camundongos, bem como a avaliação da regulação transcricional pelo método CUT&RUN.

Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é a ruptura muscular e digestão de fibras para garantir um alto número de células coletadas. Apesar do aumento da concentração enzimática, mais células vivas foram obtidas do que usando o Protocolo 1. As c.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724