Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Riepilogo

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Abstract

Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l'organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l'analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l'analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell'ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l'esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l'incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell'organo. (3) per l'incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT - 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un'architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.

Introduzione

Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l'offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d'attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo¹. La significativa disparità tra l'offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l'accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donatori consiste nell'utilizzare donatori marginali². I donatori marginali includono quelli con età avanzata, steatosi moderata o grave. Sebbene il trapianto di organi marginali possa produrre risultati favorevoli, i risultati complessivi rimangono non ottimali. Di conseguenza, è attualmente in corso lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a migliorare la funzione dei donatori marginali ^3,4.

Una delle strategie è quella di utilizzare la perfusione della macchina, in particolare la perfusione della macchina ossigenata normotermica, per migliorare la funzione di questi organi marginali⁵. Tuttavia, esiste ancora una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che sono alla base degli effetti benefici della perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I topi, con la loro abbondante disponibilità di ceppi geneticamente modificati, servono come modelli preziosi per studiare i percorsi molecolari. Ad esempio, l'importanza delle vie autofagiche nel mitigare il danno da ischemia-riperfusione epatica è stata sempre più riconosciuta ^6,7. Un'importante via molecolare nel danno da ischemia-riperfusione epatica è la via 8 di miR-20b-5p/ATG7^. Attualmente, sono disponibili un certo numero di ceppi di topi knockout ATG e knock-out condizionali, ma nessun ceppo di ratto corrispondente⁹.

Sulla base di questo background, l'obiettivo era quello di generare una piattaforma NEVLP miniaturizzata per innesti di fegato di topo. Questa piattaforma faciliterebbe l'esplorazione e la valutazione di potenziali strategie geneticamente modificate volte a migliorare la funzionalità del fegato del donatore. Inoltre, era essenziale che il sistema fosse adatto alla perfusione a lungo termine, consentendo il trattamento ex vivo del fegato, comunemente indicato come "riparazione d'organo".

Considerando la limitata disponibilità di dati in vitro rilevanti sulla perfusione epatica di topo, la revisione della letteratura si è concentrata su studi condotti sui ratti. Una ricerca sistematica della letteratura che va dal 2010 al 2022 è stata eseguita utilizzando parole chiave come "perfusione epatica normotermica", "ex vivo o in vitro" e "ratti". Questa ricerca mirava a identificare le condizioni ottimali nei roditori, permettendoci di determinare l'approccio più appropriato.

Il sistema di perfusione è costituito da un serbatoio tampone di vetro sigillato con camicia d'acqua, una pompa a rulli peristaltica, un ossigenatore, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore, una camera d'organo e un sistema di tubi ciclici chiusi (Figura 1). Il sistema garantisce il mantenimento preciso di una temperatura di perfusione costante di 37 °C utilizzando una macchina termostatica dedicata. La pompa a rulli peristaltici guida il flusso del perfusato in tutto il circuito. Il circuito di perfusione inizia nel serbatoio isolato con camicia d'acqua. Successivamente, il perfusato viene diretto attraverso l'ossigenatore, che riceve una miscela di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica da una bombola di gas dedicata. Dopo l'ossigenazione, il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, in cui eventuali bolle intrappolate vengono reindirizzate al serbatoio dalla pompa peristaltica. Il perfusato rimanente scorre attraverso lo scambiatore di calore ed entra nella camera dell'organo, da dove ritorna al serbatoio.

Qui, riportiamo le nostre esperienze nella creazione di un NEVLP per fegati di topo e condividiamo i risultati promettenti di un esperimento pilota eseguito utilizzando il mezzo ossigenato senza vettori di ossigeno.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le attuali normative e linee guida tedesche per il benessere degli animali e le linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali. Il protocollo di sperimentazione animale è stato approvato dal Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Germania (numero di approvazione: UKJ - 17 - 106).

NOTA: I topi maschi C57BL/6J del peso di 34 ± 4 g (errore medio ± standard della media [SEM]) sono stati utilizzati come donatori di fegato. Sono stati mantenuti in condizioni ambientali controllate (50% di umidità e 18 - 23 ° C) con libero accesso a chow di topo standard e acqua. Durante la procedura chirurgica, è stata mantenuta una frequenza respiratoria superiore a 60 respiri / min e la temperatura corporea è stata mantenuta al di sopra di 34 ° C.

1. Preparazione

1. Impostazione della tabella delle operazioni
   1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici e materiali di consumo per scopi di sterilizzazione.
   2. Accendere tutte le apparecchiature, compresa la scheda riscaldante e l'elettrocoagulazione.
   3. Introdurre una siringa da 50 mL con 25 mL di soluzione salina eparinizzata (2.500 U/L) in un incubatore caldo (37 °C).
   4. Posizionare gli strumenti chirurgici, la sutura di seta 6 - 0, il piccolo applicatore di cotone sterile, la soluzione salina veterinaria (500 ml) e le spugne di garza non tessuta (10 cm x 10 cm) sul tavolo operatorio in modo appropriato.
   5. Posizionare un ago da 26 G sul tavolo operatorio per creare un piccolo foro nel coperchio della provetta da microcentrifuga da 0,5 mL per ricevere il tubo biliare per la raccolta della bile.
   6. Posizionare la cannula (cannula in poliuretano 1 Fr o cannula in polietilene UT - 03) e una provetta sterilizzata da microcentrifuga da 0,5 ml per la raccolta della bile sul tavolo operatorio.
2. Cannula venosa porta autoprodotta
   1. Tenere la cannula 2 Fr con una pinza e perforare la parete con un ago da 30 G a una distanza di 1 cm dall'estremità della cannula. Spingere l'ago attraverso la cannula fino a quando la punta dell'ago diventa visibile.
   2. Tagliare la punta della cannula ottenendo un triangolo acuto.
3. Preparazione di soluzione salina eparinizzata
   1. Preparare 25 ml di soluzione salina eparinizzata con una concentrazione finale di 2.500 UI/ml.
   2. Rimuovere tutte le bolle d'aria e posizionare la siringa nell'incubatore a 40 °C.
4. Dimostrazione del sistema di perfusione
   1. Vedere la Figura 1 per i componenti principali del sistema di perfusione della macchina.
5. Allestimento della camera d'organo
   1. Vedere la Figura 2 per la disposizione della camera dell'organo.
6. Messa a punto del sistema di perfusione
   1. Attivare il programma grafico di laboratorio per il monitoraggio della pressione.
   2. Collegare il calibratore di pressione e il sensore di pressione a livello della camera dell'organo.
   3. Regolare il calibratore di pressione per leggere 0 mmHg e controllare il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.
   4. Regolare il calibratore di pressione per leggere 20 mmHg e controllare nuovamente il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.
   5. Accendere il bagnomaria e preriscaldare la camera dell'organo a 40 °C.
   6. Lavare l'intero sistema idraulico due volte con acqua deionizzata distillata per 30 minuti ciascuno, garantendo la completa rimozione della soluzione igienizzante.
   7. Avviare la circolazione della soluzione di disinfezione in tutto il sistema per una durata di 20 minuti per garantire una disinfezione completa.
   8. Accendere la miscela di gas (95% di ossigeno (O 2) e 5% di anidride carbonica (CO₂).
7. Riempimento in perfusato
   1. Integrare 250 mL di terreno E di Williams con 50 mL di siero bovino fetale, 3 mL di penicillina/streptomicina (1 mg/ml), 0,17 mL di insulina (100 IE/mL), 0,34 mL di eparina (5000 U/mL) e 0,07 mL di idrocortisone (100 mg/2 mL) per preparare il mezzo Williams' E completo.
   2. Aggiungere volumi uguali (150 ml) di perfulato al serbatoio e alla camera dell'organo per innescare il sistema.
      NOTA: È necessario prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità durante il processo di riempimento. Il perfufato viene costantemente pompato attraverso questi due componenti chiave della perfusione della macchina a ricircolo chiuso.
   3. Accendere la pompa peristaltica a velocità media (15 ml/min) per innescare il sistema di perfusione con il mezzo ossigenato.

2. Espianto di fegato

1. Preparazione pre-operatoria
   1. Pesare l'animale. Preparare l'analgesico buprenorfina (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg di peso corporeo).
   2. Collegare la camera di induzione con la presa a muro. Portare l'ossigeno a 0,5 L/min. Portare l'isoflurano al 3%.
   3. Posizionare l'animale nella camera fino a raggiungere l'anestesia profonda (riflesso di raddrizzamento positivo).
   4. Utilizzare una micro siringa per applicare la dose di analgesia adattata al peso corporeo per via sottocutanea.
   5. Utilizzare un rasoio elettrico per tagliare la pelliccia sulla pelle addominale.
   6. Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e accendere il vaporizzatore isoflurano al 2,5% per mantenere l'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso interdigitale della punta.
2. Preparazione dell'addome del topo
   1. Posizionare il mouse in posizione supina.
   2. Testare il riflesso interdigitale per confermare due volte la profondità appropriata dell'anestesia. Fissare tutti e quattro gli arti con del nastro adesivo.
   3. Disinfettare entrambi i lati dell'addome fino alla linea ascellare centrale usando tre cicli consecutivi di iodio-alcool. Utilizzare garze sterilizzate non tessute per coprire l'area intorno al campo chirurgico.
   4. Effettuare un'incisione trasversale di 3 cm 1 cm sotto lo xifoide nella zona addominale del topo usando le forbici per bambini Metzenbaum e una pinza chirurgica.
   5. Estendere l'incisione cutanea bilateralmente alla linea medioascellare su entrambi i lati.
   6. Fare con attenzione un'incisione longitudinale di 2 cm lungo la linea alba usando le forbici a molla.
   7. Tagliare lo strato muscolare addominale con elettrocoagulazione e forbici a molla Vannas.
   8. Posizionare con cura un pezzo di garza bagnata per proteggere il fegato dall'elettrocoagulazione.
   9. Utilizzare una sutura di seta 6 - 0 con l'ago rotondo per ritrarre il processo xifoideo per una migliore esposizione del legamento coronarico.
   10. Utilizzare due divaricatori costali per esporre completamente la cavità addominale del topo.
   11. Spostare con attenzione l'intestino tenue fuori dalla cavità addominale con un batuffolo di cotone bagnato per esporre completamente l'ilo.
3. Preparazione del dotto biliare comune
   1. Transetto i legamenti falciformi, frenici e gastroepatici con forbici affilate.
   2. Liberare con cura il dotto biliare comune usando una pinza curva fine senza denti.
      NOTA: Il dotto biliare comune è molto facilmente danneggiato e si rompe. Una volta che si rompe, non può essere incannulato. A causa della direzione della posizione anatomica, è meglio usare una pinza curva.
   3. Posizionare due anelli di sutura di seta 6 - 0 sul dotto biliare comune in preparazione per il passaggio successivo.
4. Incannulamento del dotto biliare comune
   1. Forare accuratamente il dotto biliare con un ago da 30 G. Utilizzare una pinza curva appuntita per allargare il piccolo foro per adattarsi all'incannulamento del dotto biliare.
   2. Utilizzare una pinza per l'incannulamento dei vasi per afferrare la cannula del dotto biliare e spingerla nel dotto biliare.
   3. Fissare due volte la cannula con i passanti di sutura 6 - 0 preimpostati.
      NOTA: Durante l'incannulamento, si avverte resistenza alla bile. Se la forza non è ben controllata, la cannula verrà spinta fuori dalle vie biliari dalla pressione del deflusso biliare. Regolare con attenzione la profondità della cannula. Se è troppo profondo, può danneggiare il dotto biliare e, se non è abbastanza profondo, potrebbe scivolare fuori.
   4. Osservare il flusso biliare nella cannula dopo l'incannulamento riuscito.
5. Preparazione della vena porta
   1. Bloccare la vena porta con una pinza piatta e liberare con cura il tessuto connettivo con una pinza curva. Non tirare forte per evitare di causare lacerazione della vena porta. Una volta che la vena porta è danneggiata, è difficile ri-cannulare la vena porta.
   2. Sezionare il PV appena superiore alla biforcazione e posizionare il primo anello di sutura usando la sutura di seta 6 - 0 sul PV vicino alla confluenza per un uso successivo.
   3. Posizionare il secondo anello di sutura per la successiva fissazione del PV il più vicino possibile all'ilo epatico.
6. Incannulamento della vena porta
   1. Utilizzare una clip arteriosa per chiudere la vena porta distale.
   2. Con molta attenzione, forare la vena porta con una delle cannule della vena porta sopra. Il flusso sanguigno può essere chiaramente osservato all'interno della cannula dopo una puntura di successo.
   3. Fissare la cannula PV con l'anello di sutura 6 - 0 pre-posizionato.
7. Vampate di calore del fegato
   1. Aumentare l'isoflurano al 5% e eutanasia il topo con un sovradosaggio di inalazione di isoflurano.
   2. Prendere la soluzione salina di eparina preriscaldata dall'incubatore. Rimuovere tutte le bolle d'aria formate all'interno della soluzione salina eparinizzata.
   3. Fissare la siringa con soluzione salina eparinizzata preriscaldata nella pompa della siringa.
   4. Collegare il tubo di prolunga della pompa della siringa alla cannula della vena porta, regolare la velocità a 2 ml / min e avviare il lavaggio del fegato.
   5. Osservare il colore del fegato alla fine della procedura di lavaggio. Eliminare il fegato una volta che il colore diventa giallo omogeneo.
   6. Transetto il diaframma, la vena cava inferiore sopraepatica, la vena cava infraepatica, l'arteria epatica, la vena porta distale e qualsiasi tessuto connettivo rimanente.
   7. Mettere il fegato nella capsula di Petri.

3. Connessione fegato e camera

1. Trasferimento del fegato
   1. Trasferire con cautela il fegato nella camera dell'organo usando una capsula di Petri.
   2. Mantenere una piccola quantità di soluzione salina nella capsula di Petri per evitare che il fegato si secchi.
      NOTA: La vena porta e il dotto biliare possono essere facilmente attorcigliati durante questa procedura, il che può influenzare la perfusione epatica e la raccolta della bile.
2. Connessione cannula venosa porta
   1. Infondere lentamente la soluzione salina normale nella cannula della vena porta con una siringa per evacuare le bolle d'aria nella cannula.
   2. Collegare la cannula della vena porta nel tubo di deflusso del perfulato nella camera dell'organo.
3. Connessione cannula del dotto biliare
   1. Guidare la cannula del dotto biliare del topo attraverso la valvola di un cappuccio di gomma collegato alla camera dell'organo.
   2. Inserire la cannula del dotto biliare in un microtubo da 0,5 ml pre-preparato con un piccolo foro nel coperchio.
   3. Posizionare il microtubo sull'argilla all'esterno della camera dell'organo.

4. Regolare la portata in base alla pressione fotovoltaica

1. Accendere la pompa peristaltica da 1 ml/min.
2. Controllare la lettura della pressione della vena porta per regolare la portata.
3. Mantenere la pressione della vena porta nell'intervallo fisiologico tra 7 - 10 mmHg regolando la portata.
   NOTA: La portata nominale può variare leggermente a seconda dell'utilizzo e del posizionamento dei tubi.

5. Raccolta dei campioni

1. Ottenere campioni di perfusato in ingresso dal tubo di afflusso della vena porta e campioni di perfusato di uscita dalla camera dell'organo in intervalli di 3 ore.
2. Raccogliere campioni da tutti i lobi del fegato per l'analisi istologica alla fine del periodo di perfusione di 12 ore.

Risultati

Istituzione della procedura chirurgica
Un totale di 17 animali sono stati utilizzati per questo esperimento: 14 topi sono stati impiegati per ottimizzare il processo di approvvigionamento degli organi, compreso l'incannulamento della vena porta (PV) e del dotto biliare (BD), mentre 3 topi sono stati utilizzati per convalidare la procedura (Tabella 1). I risultati istologici (Figura 3) sono stati confrontati per facilitare l'identificazione della condizion...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
I due passaggi cruciali nell'espianto di fegato sono l'incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.

Sfide e soluzioni
L'incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
10 µL Micro Syringe	Hamilton	701N
2 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle	Sterican	100246
50 ml Syringe Pump	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Arterial Clip	Braun	BH014R
Autoclavable Moist Chamber	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C	ERBE	/
Fetal Bovine Serum(500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)	House Supply	/
Heating Circulating Baths	Harvard-Apparatus	75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
Insulin(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Iris Scissors	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Membrane Oxygenator	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microsurgery Microscope	Leica	M60
Mouse Retractor Set	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Non-Woven Sponges	Kompressen	866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)	Braun	4256000
Peristaltic Pump	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Pressure Transducer Simulator	UTAH Medical Products	650-950
Reusable Blood Pressure Transducers	AD Instruments	MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Instruments	00608-11
Small Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Straight Forceps 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Suture Tying Forceps	Fine Science Instruments	11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601