마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

요약

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

초록

이 프로토콜은 마우스 간을 사용하여 최적화된 적혈구가 없는 NEVLP 시스템을 제공합니다. 마우스 간의 생체 외 보존은 변형된 캐뉼라와 기존의 상업용 생체 외 관류 장비에서 채택된 기술을 사용하여 달성되었습니다. 이 시스템은 12시간의 관류 후 보존 결과를 평가하는 데 활용되었습니다. C57BL/6J 마우스를 간 기증자로 사용하였고, 간을 문맥(PV)과 담관(BD)에 캐뉼라(cannul)시킨 후, 따뜻한(37°C) 헤파린화된 식염수로 장기를 세척하여 이식하였다. 이어서, 이식된 간을 관류실로 옮기고 정상 체온 산소화 기계 관류(NEVLP)를 실시했습니다. 관류액 분석을 위해 입구 및 출구 관류액 샘플을 3시간 간격으로 수집했습니다. 관류가 완료되면 조직학적 분석을 위해 간 샘플을 얻었고, Hematoxylin-Eosin(HE) 염색을 통해 변형된 Suzuki-Score를 사용하여 형태학적 완전성을 평가했습니다. 최적화 실험은 다음과 같은 결과를 산출했다 : (1) 30 g 이상의 마우스는 담관 (BD)의 크기가 더 크기 때문에 실험에 더 적합한 것으로 간주되었다. (2) 2 Fr (외경 = 0.66 mm) 폴리우레탄 캐뉼라는 폴리프로필렌 캐뉼라와 비교할 때 문맥 캐뉼라(PV)를 캐뉼레이팅하는 데 더 적합하였다. 이는 폴리우레탄 소재의 향상된 그립감으로 인해 신체에서 장기 챔버로 이동하는 동안 카테터 미끄러짐이 감소했기 때문입니다. (3) 담관(BD)의 캐뉼라의 경우, 1 Fr(외경 = 0.33 mm) 폴리우레탄 캐뉼라가 폴리프로필렌 UT-03(외경 = 0.30 mm) 캐뉼라에 비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 이 최적화된 프로토콜을 사용하여 마우스 간은 조직학적 구조에 큰 영향을 미치지 않고 12시간 동안 성공적으로 보존되었습니다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색은 간에서 잘 보존된 형태학적 구조를 나타냈으며, 이는 명확하게 보이는 핵과 간 정현파의 경미한 확장을 가진 주로 생존 가능한 간세포를 특징으로 합니다.

서문

간 이식은 말기 간 질환이 있는 개인을 위한 황금 표준 치료법입니다. 유감스럽게도 기증자 장기에 대한 수요가 가용 공급을 초과하여 심각한 부족 현상이 발생합니다. 2021년에는 약 24,936명의 환자가 간 이식 대기자 명단에 올랐고 9,234건의 이식만이 성공적으로 수행되었습니다¹. 간 이식편의 수요와 공급 사이의 상당한 격차는 기증자 풀을 넓히고 간 이식편의 접근성을 향상시키기 위한 대체 전략을 조사해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 기증자 풀을 확장하는 한 가지 방법은 한계 기증자를 사용하는 것입니다². 한계 기증자에는 고령, 중등도 또는 중증 지방증이 있는 사람이 포함됩니다. 한계 장기의 이식이 유리한 결과를 가져올 수 있지만 전반적인 결과는 차선책으로 남아 있습니다. 결과적으로, 한계 기증자의 기능을 향상시키기위한 치료 전략의 개발이 현재 진행 중이다 ^3,4.

전략 중 하나는 기계 관류, 특히 정상 체온 산소 기계 관류를 사용하여 이러한 변연 기관의 기능을 향상시키는 것입니다⁵. 그러나 정상 체온 산소 기계 관류(NEVLP)의 유익한 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. 유전자 변형 균주를 풍부하게 이용할 수 있는 마우스는 분자 경로를 조사하기 위한 귀중한 모델 역할을 합니다. 예를 들어, 간 허혈-재관류 손상을 완화하는 데 있어 자가포식 경로의 중요성이 점점 더 인식되고 있습니다 ^6,7. 간 허혈-재관류 손상에서 중요한 분자 경로 중 하나는 miR-20b-5p/ATG7 경로⁸입니다. 현재, 다수의 ATG 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 균주가 이용 가능하지만, 상응하는 쥐 균주는 없다⁹.

이러한 배경을 바탕으로 마우스 간 이식을 위한 소형화된 NEVLP 플랫폼을 생성하는 것이 목표였습니다. 이 플랫폼은 기증자의 간 기능 향상을 목표로 하는 잠재적인 유전자 변형 전략의 탐색 및 평가를 용이하게 합니다. 또한 시스템이 장기 관류에 적합하여 일반적으로 "장기 복구"라고 하는 간의 생체 외 치료가 가능해야 했습니다.

마우스 간 관류에 대한 관련 시험관 내 데이터의 제한된 가용성을 고려하여 문헌 검토는 쥐에서 수행된 연구에 초점을 맞췄습니다. 2010년부터 2022년까지의 문헌에 대한 체계적인 검색은 "정상 체온 간 관류", "생체 외 또는 시험관 내" 및 "쥐"와 같은 키워드를 사용하여 수행되었습니다. 이 검색은 설치류에서 최적의 조건을 식별하여 가장 적절한 접근 방식을 결정할 수 있도록하는 것을 목표로했습니다.

관류 시스템은 밀폐된 방수 유리 버퍼 저장소, 연동 롤러 펌프, 산소 공급기, 버블 트랩, 열교환기, 오르간 챔버 및 폐쇄형 사이클링 튜브 시스템으로 구성됩니다(그림 1). 이 시스템은 전용 온도 조절기를 사용하여 37°C의 일정한 관류 온도를 정밀하게 유지합니다. 연동 롤러 펌프는 회로 전체에 걸쳐 관류물의 흐름을 구동합니다. 관류 회로는 절연된 워터 재킷 저장소에서 시작됩니다. 그 후, 관류액은 전용 가스통에서 95% 산소와 5% 이산화탄소의 가스 혼합물을 받는 산소 공급기를 통해 전달됩니다. 산소 공급 후, 관류액은 버블 트랩을 통과하며, 여기서 갇힌 버블은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 리디렉션됩니다. 나머지 관류액은 열교환기를 통해 흐르고 오르간 챔버로 들어가 저장소로 돌아갑니다.

여기에서 우리는 마우스 간을 위한 NEVLP를 확립한 경험을 보고하고 산소 운반체 없이 산소가 함유된 배지를 사용하여 수행된 파일럿 실험의 유망한 결과를 공유합니다.

프로토콜

동물 실험은 동물 복지에 대한 현행 독일 규정 및 지침과 동물 연구 보고를 위한 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 프로토콜은 독일 튀링겐의 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz에 의해 승인되었습니다(승인 번호: UKJ - 17 - 106).

참고: 체중이 34± 4g인 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 ± 표준 오차[SEM])를 간 기증자로 사용했습니다. 그들은 통제된 환경 조건(50% 습도 및 18 - 23 °C)에서 표준 마우스 차우와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 유지되었습니다. 수술 과정 내내 60회/분 이상의 호흡수를 유지하고, 체온을 34°C 이상으로 유지하였다.

1. 준비

1. 작업 테이블 설정
   1. 멸균 목적으로 모든 수술 기구와 소모품을 고압증기멸균합니다.
   2. 온난화 보드 및 전기 응고를 포함한 모든 장비를 켭니다.
   3. 따뜻한 인큐베이터(37°C)에 25mL 헤파린화(2,500U/L) 식염수가 담긴 50mL 주사기 1개를 넣습니다.
   4. 수술 도구, 6 - 0 실크 봉합사, 멸균 소형 면 어플리케이터, 수의학 식염수(500mL), 부직포 거즈 스폰지(10cm x 10cm)를 수술대에 적절하게 놓습니다.
   5. 26G 바늘을 수술대에 올려 0.5mL 미세원심분리기 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 만들어 담즙 수집을 위한 담도관을 수용합니다.
   6. 캐뉼라(1Fr 폴리우레탄 캐뉼라 또는 UT - 03 폴리에틸렌 캐뉼라)와 담즙 수집을 위해 멸균된 0.5mL 미세원심분리기 튜브를 수술대에 놓습니다.
2. 자체 제작 문맥 캐뉼라
   1. 집게로 2 Fr 캐뉼라를 잡고 캐뉼라 끝에서 30cm 떨어진 곳에서 1G 바늘로 벽을 뚫습니다. 바늘 끝이 보일 때까지 캐뉼라를 통해 바늘을 밀어 넣습니다.
   2. 캐뉼라의 끝을 다듬어 날카로운 삼각형을 만듭니다.
3. 헤파린화 식염수의 제조
   1. 최종 농도가 2,500 IU/mL인 헤파린화 식염수 25mL를 준비합니다.
   2. 모든 기포를 제거하고 주사기를 40°C 인큐베이터에 넣습니다.
4. 관류 시스템의 시연
   1. 기계 관류 시스템의 주요 구성 요소에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
5. 오르간실 설치
   1. 오르간 챔버의 레이아웃은 그림 2 를 참조하십시오.
6. 관류 시스템 설정
   1. 압력 모니터링을 위해 실험실 차트 프로그램을 켭니다.
   2. 오르간 챔버 수준에서 압력 교정기와 압력 센서를 연결합니다.
   3. 압력 교정기를 조정하여 0mmHg를 읽고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 확인합니다.
   4. 압력 교정기를 20mmHg로 조정하고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 다시 확인하십시오.
   5. 수조를 켜고 오르간 챔버를 40°C로 예열합니다.
   6. 증류수 탈이온수로 전체 배관 시스템을 각각 30분 동안 두 번 세척하여 살균 용액이 완전히 제거되도록 합니다.
   7. 철저한 소독을 위해 20분 동안 전체 시스템에 소독 용액의 순환을 시작합니다.
   8. 가스 혼합물(95% 산소(_O2)과 5% 이산화탄소(CO₂))을 켭니다.
7. 관류수 충전
   1. 윌리엄스 E 배지 250mL에 소 태아 혈청 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 3mL(1mg/mL), 인슐린 0.17mL(100IE/mL), 헤파린 0.34mL(5000U/mL), 하이드로코르티손 0.07mL(100mg/2mL)를 보충하여 완전한 Williams' E 배지를 준비합니다.
   2. 동일한 부피(150mL)의 관류수를 저장소와 오르간 챔버에 추가하여 시스템을 프라이밍합니다.
      알림: 충전 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 관류액은 폐쇄형 재순환 기계 관류의 이 두 가지 핵심 구성 요소를 통해 지속적으로 펌핑됩니다.
   3. 중간 속도(15mL/분)로 연동 펌프를 켜서 산소가 공급된 매체로 관류 시스템을 프라이밍합니다.

2. 간 이식

1. 수술 전 준비
   1. 동물의 무게를 잰다. 진통제 부프레노르핀(0.3mg/mL)(0.05mg/kg 체중)을 준비합니다.
   2. 인덕션 챔버를 벽면 콘센트와 연결합니다. 산소를 0.5L/min으로 돌립니다. 이소플루란을 3%로 바꾸십시오.
   3. 깊은 마취 (오른쪽 반사 양성)에 도달 할 때까지 동물을 챔버에 넣으십시오.
   4. 마이크로 주사기를 사용하여 체중에 맞는 용량의 진통제를 피하 투여합니다.
   5. 전기 면도기를 사용하여 복부 피부의 털을 다듬습니다.
   6. 마우스를 수술대로 옮기고 이소플루란 기화기를 2.5%로 켜서 마취를 유지합니다. interdigital toe reflex를 테스트하여 마취 깊이를 확인합니다.
2. 마우스 복부의 준비
   1. 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다.
   2. 적절한 마취 깊이를 두 번 확인하기 위해 디지털 간 반사를 테스트합니다. 네 팔다리를 모두 테이프로 고정하십시오.
   3. 복부의 양쪽을 겨드랑이 중간 라인까지 3 회 연속 요오드 알코올을 사용하여 소독하십시오. 부직포 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위 주변을 덮으십시오.
   4. Metzenbaum 아기 가위와 수술용 집게를 사용하여 마우스의 복부 부위에서 검상돌기 아래 1cm 아래에 3cm 가로 절개를 합니다.
   5. 피부 절개를 양쪽의 겨드랑이 선까지 양측으로 확장합니다.
   6. 스프링 가위를 사용하여 linea alba를 따라 조심스럽게 2cm 세로 절개를합니다.
   7. 전기 응고 및 Vannas 스프링 가위로 복부 근육층을 자릅니다.
   8. 전기 응고로부터 간을 보호하기 위해 젖은 거즈를 조심스럽게 놓으십시오.
   9. 관상 동맥 인대의 더 나은 노출을 위해 xiphoid 과정을 수축시키기 위해 둥근 바늘로 6-0 실크 봉합사를 사용하십시오.
   10. 두 개의 리브 리트랙터를 사용하여 마우스의 복강을 완전히 노출시킵니다.
   11. 젖은 면봉으로 소장을 복강 밖으로 조심스럽게 옮겨 문문을 완전히 노출시킵니다.
3. 일반적인 담관 준비
   1. 날카로운 가위로 falciform, phrenic 및 gastrohepatic ligaments를 Transect하십시오.
   2. 치아가 없는 미세한 곡선 집게를 사용하여 총담관을 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 총담관은 매우 쉽게 손상되어 파손됩니다. 한 번 깨지면 캐뉼러를 사용할 수 없습니다. 해부학 적 위치의 방향으로 인해 구부러진 집게를 사용하는 것이 좋습니다.
   3. 다음 단계를 준비하기 위해 두 개의 6 - 0 실크 봉합사 루프를 총 담관 위에 놓습니다.
4. 일반적인 담관 캐뉼러 삽입
   1. 30G 바늘로 담관을 조심스럽게 뚫습니다. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 담관 캐뉼러에 맞게 작은 구멍을 확대합니다.
   2. 혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 담관 캐뉼라를 잡고 담관으로 밀어 넣습니다.
   3. 사전 설정된 6 - 0 봉합 루프로 캐뉼라를 이중으로 고정합니다.
      알림: 캐뉼러 삽입 중에 담즙에 의한 저항이 느껴집니다. 힘이 잘 조절되지 않으면 담즙 유출 압력에 의해 캐뉼라가 담도 밖으로 밀려납니다. 캐뉼라의 깊이를 조심스럽게 조정하십시오. 너무 깊으면 담관이 손상될 수 있고, 충분히 깊지 않으면 빠져나갈 수 있습니다.
   4. 성공적인 캐뉼라 삽입 후 캐뉼라의 담즙 흐름을 관찰하십시오.
5. 문맥 준비
   1. 편평한 집게로 문맥을 고정하고 구부러진 집게로 결합 조직을 조심스럽게 풀어줍니다. 문맥이 찢어지지 않도록 세게 당기지 마십시오. 문맥이 손상되면 문맥을 다시 캐뉼러링하기가 어렵습니다.
   2. 분기점보다 약간 우수한 PV를 해부하고 나중에 사용할 수 있도록 합류점에 가까운 PV에 6 - 0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 봉합사 루프를 배치합니다.
   3. PV의 나중에 고정을 위해 두 번째 봉합사 루프를 가능한 한 간 문에 가깝게 배치합니다.
6. 문맥 캐뉼라 삽입
   1. 동맥 클립을 사용하여 원위 문맥을 닫습니다.
   2. 매우 조심스럽게 위의 문맥 캐뉼라 중 하나로 문맥을 뚫습니다. 성공적인 천자 후 캐뉼라 내에서 혈류를 명확하게 관찰 할 수 있습니다.
   3. 미리 배치된 6 - 0 봉합 루프로 PV 캐뉼라를 고정합니다.
7. 간 홍조
   1. 이소플루란을 5%로 늘리고 이소플루란 흡입의 과다 복용으로 마우스를 안락사시킵니다.
   2. 인큐베이터에서 예열 된 헤파린 식염수를 섭취하십시오. 헤파린화 식염수 내부에 형성된 모든 기포를 제거합니다.
   3. 예열 된 헤파린 처리 식염수로 주사기를 주사기 펌프에 고정하십시오.
   4. 주사기 펌프의 연장 튜브를 문맥의 캐뉼라에 연결하고 속도를 2mL/min으로 조정한 후 간 세척을 시작합니다.
   5. 홍조 절차가 끝날 때 간색을 관찰하십시오. 색이 균질한 노란색으로 변하면 간을 절제하십시오.
   6. 횡격막, 간상하 대정맥, 간대정맥, 간동맥, 원위 문맥 및 나머지 결합 조직을 절제합니다.
   7. 간을 페트리 접시에 넣으십시오.

3. 간과 챔버 연결

1. 간 이식
   1. 페트리 접시를 사용하여 간을 장기 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
   2. 간이 마르지 않도록 페트리 접시에 소량의 식염수를 보관하십시오.
      참고: 이 과정에서 문맥과 담관이 쉽게 뒤틀릴 수 있으며, 이는 간 관류 및 담즙 수집에 영향을 줄 수 있습니다.
2. 문맥 캐뉼라 연결
   1. 주사기로 문맥 캐뉼라에 생리 식염수를 천천히 주입하여 캐뉼라의 기포를 배출합니다.
   2. 문맥 캐뉼라를 장기 챔버의 관류액 유출 튜브에 연결합니다.
3. 담관 캐뉼라 연결
   1. 장기 챔버에 연결된 고무 캡의 밸브를 통해 마우스 담관 캐뉼라를 안내합니다.
   2. 담관 캐뉼라를 뚜껑에 작은 구멍이 있는 미리 준비된 0.5mL 마이크로튜브에 삽입합니다.
   3. 오르간 챔버 외부의 점토에 마이크로튜브를 놓습니다.

4. PV 압력에 따라 유량 조정

1. 연동 펌프를 1mL/분으로 켭니다.
2. 문맥 압력 판독값을 확인하여 유속을 조정하십시오.
3. 유속을 조절하여 문맥압을 7 - 10 mmHg 사이의 생리학적 범위로 유지한다.
   알림: 공칭 유량은 튜브의 사용 및 위치에 따라 약간 다를 수 있습니다.

5. 시료 채취

1. 문맥 유입 튜브에서 입구 관류액 샘플을 얻고 기관 챔버에서 3시간 간격으로 출구 관류액 샘플을 얻습니다.
2. 12시간의 관류 기간이 끝날 때 조직학적 분석을 위해 모든 간엽에서 샘플을 수집합니다.

결과

외과 절차의 확립
이 실험에는 총 17마리의 동물이 활용되었다: 14마리의 마우스는 문맥(PV) 및 담관(BD)의 캐뉼라 삽입을 포함하여 장기 조달 과정을 최적화하기 위해 사용되었고, 3마리의 마우스는 절차를 검증하는 데 사용되었다(표 1). 조직학적 결과(도 3)는 최적의 관류 조건의 식별을 용이하게 하기 위해 비교되었다.

?...

토론

프로토콜의 중요한 단계
간 이식의 두 가지 중요한 단계는 문맥의 캐뉼라 삽입(PV)과 후속 담관 캐뉼라(BD)입니다. 이러한 단계는 성공적인 장기 회수 및 후속 관류 또는 이식 절차를 보장하는 데 가장 중요합니다.

도전과 해결책
PV 캐뉼러는 혈관벽의 손상, 카테터의 변위 및 삽입 과정의 실행 가능성이라는 세 가지 문제를 제시합니다. PV 혈관 벽의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
10 µL Micro Syringe	Hamilton	701N
2 Fr Rubber Cannula	Vygon	Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula	Terumo	SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle	Sterican	100246
50 ml Syringe Pump	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Arterial Clip	Braun	BH014R
Autoclavable Moist Chamber	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Bubble Trap	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C	ERBE	/
Fetal Bovine Serum(500 ml)	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide)	House Supply	/
Heating Circulating Baths	Harvard-Apparatus	75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Pfizer	15427276
Insulin(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Iris Scissors	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Membrane Oxygenator	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microsurgery Microscope	Leica	M60
Mouse Retractor Set	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Non-Woven Sponges	Kompressen	866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)	C.C.Pro	Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm)	Braun	4256000
Peristaltic Pump	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Pressure Transducer Simulator	UTAH Medical Products	650-950
Reusable Blood Pressure Transducers	AD Instruments	MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Instruments	00608-11
Small Cotton Applicator	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Straight Forceps 10 cm	Fine Science Instruments	00632-11
Suture Tying Forceps	Fine Science Instruments	11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Cannula	Unique Medical, Japan	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William's E Medium (500 ML)	Thermofischer Scientific	A1217601