מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

Summary

כאן, אנו מבססים מודל חולדה של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות כדי לספק בסיס לחקר עין יבשה חסרת מים.

Abstract

עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג של מחלת עין יבשה שיכולה לגרום לירידה בכמות ואיכות הפרשת הדמעות. ייצור דמעות חריג ממושך עלול להוביל להפרעה בסביבת פני השטח של העין, כולל נזק לקרנית ודלקת. במקרים חמורים, ADDE יכול לגרום לאובדן ראייה או אפילו עיוורון. נכון לעכשיו, טיפול בעין יבשה מוגבל לטיפות עיניים או פיזיותרפיה, אשר יכולים רק להקל על תסמיני אי נוחות בעין ולא יכולים לרפא באופן יסודי תסמונת העין היבשה. כדי לשחזר את תפקוד בלוטת הדמעות בעין יבשה, יצרנו מודל חייתי של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות בחולדות המושרה על ידי סקופולמין. באמצעות הערכה מקיפה של בלוטת הדמעות, הקרניות, הלחמית וגורמים אחרים, אנו שואפים לספק הבנה מלאה של השינויים הפתולוגיים של ADDE. בהשוואה למודל עכבר העין היבשה הנוכחי, מודל זה של בעלי חיים ADDE כולל הערכה תפקודית של בלוטת הדמעות, ומספק פלטפורמה טובה יותר לחקר תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות ב- ADDE.

Introduction

עד שנת 2021, כ -12% מהאנשים מושפעים באופן משמעותי מיובש^{בעיניים 1}, מה שהופך אותה לאחת ממחלות העיניים הכרוניות הנפוצות ביותר. ניתן לחלק את העין היבשה לשני סוגים: עין יבשה חסרת מים (ADDE) ועין יבשה באידוי (EDE)², בהתאם לגורמים השונים המשפיעים על המחלה. ADDE מחולק גם לתסמונת סיוגרן (SS) ולא SS, אך רוב חולי העין היבשה הם חולים שאינם SS בקליני³. תסמיני עין יבשה כרוניים משפיעים באופן חמור על איכות הראייה של החולים. נכון לעכשיו, הטיפול הקונבנציונלי של DED כרוך ביישום של דמעות מלאכותיות כדי לשמן את פני העין ופיזיותרפיה של העפעפיים. עם זאת, תסמונת העין היבשה לא יכול להציע תרופה מלאה במקרים רבים. לכן, חקר הפתוגנזה של מחלת העין היבשה הוא חיוני לפיתוח טיפולים ותרופות חדשות. מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה מספקים בסיס למחקר נוסף.

ישנן דרכים רבות לבנות מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה⁴, כולל שינוי רמות הפרשת הדמעות על ידי שינוי רמות ההורמונים. לדוגמה, הסרת האשכים של חולדות יכולה להפחית את הפרשת אנדרוגן, להגביר את הפרשת הדמעות, ולהפחית את הריכוז של רכיב הפרשה חופשית (SC) ו- IgA בדמעות ^5,6. שיטה נוספת היא להצביע על תגובות אוטואימוניות בבלוטת הדמעות על ידי הסרת עצבי פני העין השולטים על הבלוטה. בנוסף, ניתן להשיג הפחתה ישירה של הפרשת הדמעות על ידי הסרה כירורגית של בלוטת הדמעות⁷. תנאי סביבה משתנים יכולים גם להאיץ את אידוי הדמעות. לדוגמה, גידול בעלי חיים בתנאי לחות נמוכה ואוורור יבש יכול לבסס מודל של עין יבשה באידוי מוגזם⁸, אשר ניתן לשלב עם שיטות אחרות כדי להגביר את חומרת העין היבשה. התרופות העיקריות המשמשות להשראת מודלים ניסיוניים של עין יבשה הן אטרופין וסקופולאמין⁹. כמעכבים פאראסימפתטיים, שניהם יכולים לגרום לחסימה פרמקולוגית של קולטנים כולינרגיים (מוסקריניים) בבלוטת הדמעות ולעכב הפרשת דמעות. בהשוואה ליובש בעיניים הנגרם על ידי הזרקת שריר אטרופין¹⁰, לסקופולמין יש השפעה מעכבת חזקה יותר על בלוטות ההפרשה, משך זמן ארוך יותר של פעילות תרופתית, והשפעות חלשות יותר על שרירי הלב, המעי הדק והסימפונות. זוהי אחת התרופות הבשלות ביותר עבור מודלים של בעלי חיים עם עיניים יבשות.

ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי לגרום לעין יבשה עם סקופולמין, כגון הזרקה תת עורית, משאבת סמים, או יישום תיקון ^4,11,12. על מנת להפחית את תדירות מתן התרופות לחיות ניסוי, חוקרים רבים מדביקים טלאים טרנסדרמליים על זנבות עכברים או משתמשים במשאבות סמים. עם זאת, לשתי השיטות הללו יש מגבלות. לדוגמה, ספיגת טלאים עוריים צריכה לקחת בחשבון את הקליטה האישית של עכברים, מה שעלול להוביל למינון תרופות לא עקבי. למרות משאבות סמים יכול לשלוט במדויק על המינון של כל ממשל, הם לא תמיד תואמים את התרופה מועברת או את הריכוז בשימוש. כמו כן, יש למקם אותם בניתוח – שהוא פולשני יותר לבעל החיים, הדורש אירוע הרדמה, וקיים פוטנציאל לסיבוכים לאחר הניתוח כגון הלחשה. הזרקה תת עורית, אם כי מסורבלת יותר, יכולה להבטיח מינון מדויק לכל מתן ולשמור על עקביות במתן התרופה בקרב חולדות שונות. יחד עם זאת, יש לו עלות נמוכה יותר והוא מתאים לביצוע מספר רב של ניסויים בבעלי חיים.

מחקר זה מיישם הזרקות תת עוריות חוזרות ונשנות של סקופולמין כדי לבסס מודל של חולדת עין יבשה. אנו מנתחים אינדיקטורים לעין יבשה כגון פגמים בקרנית, רמות הפרשת דמעות ומורפולוגיה פתולוגית של הקרנית, הלחמית ובלוטת הדמעות. על ידי שילוב של ריכוז תרופות, ביטויים פתולוגיים ותסמיני עין יבשה, אנו מרחיבים עוד יותר את מודל חולדת העין היבשה בפירוט, ומספקים נתונים ניסיוניים מדויקים יותר לחקר הטיפול בעין יבשה ומנגנונים פתולוגיים. אנו גם מתארים בפירוט את תהליך המידול עבור חוקרים עתידיים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בהתאם לפרוטוקול זה מבוצעים באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנת בעלי חיים

1. הכינו 12 נקבות ויסטאר בריאות בנות 6 שבועות עם מקדם הגנה במשקל 160 גרם ±-20 גרם.
2. השתמש במנורת סדק ואופטלמוסקופ כדי לבחון את תנאי העיניים של כל החולדות, וודא שאין מקטע קדמי או מחלות רשתית.
3. לגדל את כל החולדות במשך שבוע אחד עם מקורות מזון ומים מספיקים.
4. חולקו באופן אקראי כל החולדות לקבוצות נורמליות, ריכוז תרופת סקופולמין 2.5 מ"ג/מ"ל, ריכוז תרופת סקופולאמין 5 מ"ג/מ"ל וריכוז תרופת סקופולאמין 7.5 מ"ג/מ"ל, עם שלוש חיות בכל קבוצה.

2. הכנת פתרון

1. הכינו סקופולאמין הידרוברומיד על ידי המסתו בתמיסת נתרן כלורי 0.9% ליצירת תמיסה בריכוזים של 7.5 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל ו-2.5 מ"ג/מ"ל.
2. הכינו תמיסת נתרן כלורי 0.9% ללא הידרוברומיד סקופולאמין שתשמש כזריקה לקבוצת הביקורת של חולדות.

3. הכנת ציוד וחומרים

1. הכינו מיקרוסקופ של בעלי חיים קטנים.
2. להכין חומרים לניסוי, כולל מזרק חד פעמי 1 מ"ל עם מחט (26 גרם); רצועות נתרן אופתלמיות פלואורסצאין; רצועת בדיקת דמעות של שירמר; אתנול מוחלט; 4% paraformaldehyde; קסילן; בלסם נייטרלי; hematoxylin, eosin; וערכת צביעה תקופתית של חומצה שיף.

4. הזרקה תת עורית

הערה: הליך זה דורש סיוע מאדם שני כדי לסייע באבטחת החולדות.

1. החזיקו את גוף החולדה יציב ותפסו ומתחו את רגליה האחוריות השמאלית (או הימנית).
   הערה: עוזר יכול לעזור בהחזקת החיה.
2. נקו את מקום ההזרקה עם אלכוהול.
3. יש להכניס מזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל עם מחט (26 גרם) בבסיס קפל העור בין האגודל לאצבע.
4. שאפו את המזרק על ידי משיכת הבוכנה לאחור של המזרק. כל דם במזרק מצביע על מיקום מחט לא תקין; הסר ומקם מחדש את המחט.
5. יש לתת תמיסת נתרן כלורי 0.9% עם או בלי סקופולאמין הידרוברומיד בתנועה יציבה וזורמת.
6. יש להזריק את כל החולדות לפי ריכוזים שונים, כאשר 0.5 מ"ל מוזרק בכל פעם וארבע פעמים ביום (בשעות 9:00, 12:00, 15:00 ו-18:00) במשך תקופה רצופה של 19 ימים, לסירוגין בין גפיים שמאל וימין.
   הערה: שמות הקבוצות הם כדלקמן:
   קבוצה ללא סקופולמין הידרוברומיד: 0 קבוצה (ביקורת)
   קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 2.5 מ"ג/מ"ל: 2.5 קבוצה
   קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 5 מ"ג/מ"ל: 5 קבוצה
   קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 7.5 מ"ג/מ"ל: 7.5 קבוצה
7. להחזיר את בעל החיים לכלוב שלו ולפקח על נשימה והתנהגות במשך 5-10 דקות.

5. בדיקת הפרשת דמעות (בדיקת דמעות שירמר, STT)

1. צור רצועת נייר סינון שונה עבור חולדות¹¹. חתכו מחצית מפס נייר הסינון המשמש לבני אדם לאורך קו האמצע (1 מ"מ × 15 מ"מ), וחתכו את ראש הרצועה כדי להפוך אותה לחלקה.
   הערה: לפני ביצוע בדיקת הפרשת הדמעות, יש לרסן ידנית את גוף החולדה כדי למנוע תנועה ולהבטיח חשיפה של עיני החולדה.
2. הניחו את פס נייר הסינון על 1/3 החיצוני של שק הלחמית התחתון של העפעף של החולדה.
3. זמן הבדיקה במשך 5 דקות. לשלוט על סגירת העיניים של החולדה לאורך כל ההליך.
4. לאחר המדידה, השתמש בפינצטה כדי להדק את רצועת נייר הסינון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולרשום את נפח הקרע על ידי ביצוע סימן על דופן הצינור.
5. מדדו הפרשת דמעות ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.

6. צביעת פלואורסצאין בקרנית

1. זרוק 0.5 μL של תמיסת נתרן פלואורסצאין 0.5% לתוך שק הלחמית התחתון של כל חולדה.
2. יש להתבונן בקרנית תחת אור כחול במשך 3 דקות לאחר החדרת פלואורסצאין.
3. רשמו את הכתמים הפלואורסצנטיים של הקרנית של כל חולדה ובדקו אם יש פגם בקרנית.
4. בצעו צביעה פלואורסצאין בקרנית ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.

7. תצפית היסטולוגית של רקמת הלחמית

1. לאחר השלמת פיתוח המודל, מרדימים את החולדות עמוק עם הזרקה תוך צפקית של 0.4 מ"ל / 100 גרם של הידרט כלורלי מימי 10% כדי להקל על המתח של בעלי החיים. לאחר מכן, הרדימו את החולדות על ידי פריקת צוואר הרחם.
2. קח את לחמית הבולבר מאותם אזורים של כל חולדה, בגודל של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ.
3. תקן את הרקמות מיד ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות להטביע פרפין¹³.
4. יש לחתוך חתכים בעובי 5 מיקרומטר ולהכתים עם המטוקסילין ואאוזין (HE)¹⁴ וכתם חומצה-שיף תקופתי (PAS) (יש לעקוב אחר הוראות היצרן).

8. תצפית היסטולוגית של רקמת הקרנית ובלוטת הדמעות

1. לאחר השלמת פיתוח המודל, הרדימו את החולדה כמתואר בשלב 7.1.
2. קח את הקרנית בצד ימין של כל חולדה וקבע אותה מיד בתמיסת פרפורמלדהיד 4%.
3. חותכים את האפידרמיס הצפלי ואת הרקמה התת עורית לאורך הקו המחבר בין האוזן לפינה החיצונית של העין, מרחיבים את החתך לשני הצדדים ומבודדים עוד יותר את בלוטת האורביטל הנוספת הצהבהבה.
4. הסירו היטב את פרוות החולדה והפרידו את הבלוטה החוץ-מסלולית בתמיסת נתרן כלורי 0.9%.
5. מניחים את הבלוטות החוץ-מסלוליות המבודדות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות ומטמיעים בפרפין.
6. חתכו חלקים רציפים בעובי ~5 מיקרומטר והכתימו אותם עם HE עבור דגימות רקמת קרנית ובלוטות חוץ-מסלוליות.

9. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח סטטיסטי של הנתונים.
   1. בצע ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לנתח את הנתונים ואת מבחן ההבדל הכי פחות משמעותי (LSD) להשוואה בין קבוצות. הגדר את רמת המובהקות הסטטיסטית על α = 0.05, כאשר P < 0.05 מציין מובהקות סטטיסטית.
      הערה: תוכנת SPSS 20 שימשה לניתוח סטטיסטי של נתוני הניסוי.

תוצאות

שירמר אני בודק, SIT I
נפח הדמעות של החולדות נמדד בימים 0, 3, 5, 7, 11, 15 ו-19 לאחר תחילת הניסוי. תוצאות הניסוי הראו כי הפרשת הדמעות של קבוצת הסקופולמין (2.5 קבוצה, 5 קבוצות, 7.5 קבוצות), בהשוואה לקבוצת הביקורת (קבוצת 0), ירדה באופן מובהק, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (P < 0.01). לא נמצאה מובהקות סטטיסטית ?...

Discussion

עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג חשוב של עין יבשה, המהווה כשליש מכלל אוכלוסיית העין היבשה¹⁷, והגורם העיקרי ל- ADDE הוא נזק פתולוגי לבלוטת הדמעות ודלקת¹³. עבור סוג זה של עין יבשה, שיטות הטיפול הקליני הנפוצות ביותר הן דמעות מלאכותיות כדי להקל על הסימפטומים או יישום מקומי של ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418