Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Özet

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41) mevcut M. magneticum AMB-1.

Özet

Magnetotactic bakteri jeomanyetik alanlar boyunca kendi yolunuzu mümkün Sudaki mikroorganizmaların çeşitli bir grup oluşturmaktadır. Bu davranış uygun ortamlar için arama yardımcı olduğuna inanılıyor

Protokol

1. E. Mama Gen Klonlama ve İfade coli

5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 've 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3' mutant gen mamAΔ41 primerler Magnetospirillum magneticum AMB-1 genomik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. Çoğaltılan DNA parçaları, bir NcoI sitesinde başlatma kodon ATG sunuldu ve fesih kodon bir ScoI site ile değiştirilir. Parçaları NcoI ve Sacl ile sindirilir ve pET52b ilgili siteler (+) klonlanmış pET52bMamAΔ41-AMB1 sebebiyet veren. Bu yapı, mamAΔ41 gen-C-terminalindeki 10-tag ile çerçeve içinde erimiş oldu. Plazmid, E. coli suşu BL21 içine electroporated oldu. E. coli pET52bMamAΔ41 barındıran BL21 (15), oto-indüksiyon 3 saat ampisilin (50 mg / ml), 310 ° K içeren orta yetiştirilen süzün . Ekimi sıcaklığı 310 ° 'den 300 ° K, 300 ° K. kaydırılır ve ek bir 48 saat süreyle devam edildi Hücreleri 277 az 10 dak ° K. 5465g santrifüj tarafından toplandı 8 litre kültür ıslak hücre pelet 60 gram üretti.

2. Biyoinformatik Hesaplamalar

ProtParam sunucusu (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) kullanarak molekül ağırlığı (MW), amino asitler sırasına göre ve 280nm protein, 1mg/1ml öngörülen emme Hesaplamalar . 10His-Tag-MamAΔ41 için 22529 MW Da (240 amino asitler) ve MamAΔ41 (Trombin tarafından O'nun etiketi kaldırma sonra kalan 9 amino asitler) Mw 20596.5Da (187 amino asitler). 10His-Tag-MamAΔ41 için protein 280nm 1mg/1ml tahmin emme 0,595 ve 0,579 MamAΔ41 için. Buna ek olarak, amino asit dizisi, bir sistein kalıntıları içermez. Bu nedenle, indirgeyici ajanlar arıtma işlemi sırasında gerekli değildir.

3. MamAΔ41, saflaştırılması

1. Stok solüsyonu hazırlanması için, tartmak ve aşağıdaki konsantrasyonlarda (200 ml) hazırlayın: imidazol (MW 228,2 g / mol) 4M çözümü, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M çözüm, Tris-HCl (Mw 121.3 g / mol ) 1M çözelti, pH = 8 ayarlayın. Çözüm netleşene kadar bir girdap kullanarak çift distile su (DDW) ve karışımı ekleyin. 0.22μm oda sıcaklığında tutmak filtre ve filtre çözümleri.
2. Hazırlayın ve stok solüsyonları (Tablo 1) 6 taze tamponlar filtre.
3. Seyreltilir ve tampon 1:2 oranını, hücre gram tampon hacmi (ml) hücreler askıya.
4. DNaz I (1 mg / ml) bakteriler her 10gr için örnek DNA parçaları kırmak için 10μl ekleyin. EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl bakterilerin her 20gr için 1 ml ekleyin. 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
5. Fransız basını, iki kür 25.000 psi hücreleri bozulur. Sonication aksine, Fransız basını, ince bir borudan yüksek basınç altında hücreleri zorlayarak yüksek hacimli (> 10 ml) hücre ekstrüzyon hedeflenmektedir. Piston sıcaklık birikimi nedeniyle kullanım ve montaj önce on dakika boyunca buz üzerinde soğutulmalıdır.
6. 25ml ultrasantrifüjdeki tüpler içine parçalanmış hücreleri transferi ve örnek tüp boyun hattı ulaşıncaya kadar tampon A (50mg) tam denge.
7. 277, 1 saat süreyle 270.000 g Ultra santrifüj ayrı hücre artıkları ° K
8. 4 ml% 20 etanol konserveler Ni NTA reçine, sütun üzerine ekleyerek ev yapımı bir ağırlık Ni NTA sütun (2.5cm çap) hazırlayın. Tamamen sıvı bırakalım, daha sonra 40 ml DDW ile yıkayın ve tamamen sıvı bırakalım. 40 ml tampon A. sütun öncesi dengelenmiş reçine
9. Yerçekimi Ni NTA sütun üzerinde ultra santrifüj tüpleri çözünebilir fraksiyon uygulayın. Akış yoluyla toplamak (bağlantısı çözülmüş proteinler) ve 277K az korumak, sıvı bırakalım.
10. Pelet hurda küçük bir ipucu kullanarak ultra santrifüj tüpleri pelet örnek toplayın. 50μl 5% 2X β-merkaptoetanol SDS-PAGE örnek tampon ucu karıştırın.
11. 100 ml tampon B. sütun akış yoluyla toplamak ve 277K az korumak, sıvı bırakalım yıkayın.
12. 15 işaretli Eppendorf tüpleri (1.5ml) hazırlayın.
13. Elüsyon - yakın sütun vana ve sonra sütun üzerine tampon C 1ml yük, 3 dakika supap açılma ve flow-through toplama takip boyunca inkübe. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
14. Zehir geri kalanını askıya alma 1 ml tampon C artışlarla ve vanasını kapatın.
15. Kesirler 280nm az OD ölçün ve protein zirve konumunu değerlendirmek, OD hala> 0.3 ise, ek örnekler ihtiyaç vardır.
16. Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analiz, aşağıdaki örnekleri ile de yapılmalıdır bağlanmamış proteinler, flow-through-through akış yıkayın ve uLTRA santrifüj pelet örnek. 10μl 5% 2X SDS-PAGE örnek tampon β-mercaptoethanol her örnekten 10μl karıştırın. % 15 SDS-PAGE numuneleri yükleyin ve 180 Volt 45 dakika çalıştırın.
17. InstantBlue çözüm 15 ml jel Lekesi, 1 saat süreyle çalkalayın. Plastik kutu kapalı ve ışıktan korumalı olduğunu emin olun.
18. Jel değerlendirin; protein ekspresyonu gösterge bantlara göre, yüksek ve özel ise, seçilen yıkandı, kesirler birleştirmek.
19. 10-His-etiketi kaldırmak için, kombine örnek için üreticinin tavsiyesine göre, sığır trombin (10 adet / ml), 1 mg protein başına 10μl trombin.
20. Diyaliz aşırı imidazol çıkarılması için kullanılır ve iyon değişimi bağlanma sırasında gerekli seviyeleri için NaCl konsantrasyonları azaltmak için. Diyaliz için 7 kD molekül ağırlığı, istenilen uzunlukta kesilmiş (MWCO) diyaliz tüp kesti. DDW ile yıkayın ve bir ucunu (veya klipler ile mühür) bir düğüm. Üst kısmında biraz boşluk bırakarak çanta üzerine birleştirilmiş protein çözüm transferi ve mengene.
21. Batmak 4 litre soğuk tampon diyaliz diyaliz tüp (Tampon D). 277 gece boyunca yavaş yavaş çözüm karıştırın ° K
22. Beher diyaliz tüp dışarı atın, küçük bir kesim yapmak ve tüp 50ml protein transfer.
23. İyon-değişim kromatografisi: Hızlı Performans Sıvı Kromatografisi (FPLC) MonoQ 4.6/100 PE sütun önceden paketlenmiş monte edin. DDW filtrelenmiş su 5 sütun hacimleri (CV) ile sütun yıkayın. Tampon D. 5 CV ile dengelenmiş sütun
24. DDW (iki döngü hacimleri) ile enjeksiyon döngü yıkayın ve Yük enjeksiyon döngü içinde protein tampon D. ile tekrarlayın.
25. Protein örneği (1 ml / dak akış hızı) enjekte edilir ve sınırsız proteinlerinin SDS-PAGE tespiti için kesirleri toplamaya başlar.
26. Tüm örnek sütun yükleninceye kadar, ilk protein hacmi (adım 3.23) enjeksiyon döngü daha büyükse, döngü yıkamadan, 3,25-3,26 adımları tekrarlayın.
27. Sınırsız proteinlerin ortadan kaldırmak için 3 CV ile tampon C sütunu yıkayın.
28. Tamponlar D & E (% 100 tampon E degrade sonuna), akış hızı 1 ml / dk (arasında 40 2000mm NaCl 60 dakika doğrusal bir degrade, maliyeti yüksek debilerde kullanılan olmasına rağmen protein Zehir geniş hacimli, ama daha az yoğun, protein zirveleri). 280nm kromatogram göründükleri gibi proteinler doruklarına toplayın.
29. Temizlik öncesi dolu sütun tavsiye üretimi göre.
30. Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analizi aşağıdaki örnekleri ile yapılmalıdır, sınırsız proteinler akış yoluyla ve aracılığıyla protein doruklarına akış. SDS-PAGE çalıştırın ve adımları 3,17-3,18 söz leke.
31. Protein ön lekeli işaretine göre, tahmin edilen Mw protein bantları varlığı için jel değerlendirin. Birleştirme ilgili protein içeren seçilen elüsyon kesirler.
32. Boyut dışlama kromatografisi için gerekli NaCl konsantrasyonlarının azaltılması amacıyla, birleştirilmiş numunelerin Dialyze. 3,21-3,23 tampon F. karşı adım belirtildiği gibi diyaliz gerçekleştirin.
33. Protein örnek Konsantre bir Vivaspin-15 10.000 MWCO için 8 mg / ml 'bir tablo santrifüj, 4000 rpm. Kuvars küvet 280nm az OD ölçerek arzu konsantrasyon onaylayın. Protein çok konsantre ise tampon F sulandırmak ve tekrar ölçmek.
34. Boyut dışlama önceden paketlenmiş sütun, FPLC Hiload 26/60 superdex 200, birleştirin; sütun DDW filtrelenmiş su 3 CV ile yıkayın. Tampon F. 3 CV ile dengelenmiş sütun
35. Yük en fazla 4 ml enjeksiyon döngü içinde protein örnek enjeksiyon döngü ile aynı hacimde tampon F. takip 5ml DDW (iki döngü cilt) ile yıkayın.
36. Protein örneği (3.5 ml / dak akış hızı) enjekte edilir ve 280nm kromatogram göründükleri gibi proteinler zirve kesirleri toplamaya başlar. Sütun hacmi ulaşıncaya kadar tampon akışı olsun.
37. Tüm örnek sütun yükleninceye kadar, ilk protein hacmi (adım 3.23) enjeksiyon döngü daha büyükse, döngü yıkamadan, 3,25-3,26 adımları tekrarlayın.
38. Temizlik önceden paketlenmiş sütun üretimi önerisine göre.
39. Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analiz protein doruklarına örnekleri ile yapılmalıdır. SDS-PAGE çalıştırın ve adımları 3,17-3,18 söz leke.
40. Jel Değerlendirin: protein doruklarına özgü olmadığını, doğru tahmin Mw protein lekeli öncesi marker ve sadece tek bir bant göre ilgili protein yıkandı, kesirler seçili birleştirme görünür.
41. > 20 mg / ml, bir tablo santrifüj 4000 rpm bir Vivaspin-15 10.000 MWCO kullanarak protein örnek Konsantre. 280nm az OD ölçerek arzu konsantrasyon onaylayın. Saflaştırılmış MamAΔ41 sonra kristalleşmesi için 26.5 mg / ml konsantre oldu.
42. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI-TOF) kullanarak örnek saflık ve protein kimlik onaylayın.
43. Her 25-50μl protein, protein, kütle spektrometresi ve SDS-PAGE göre arıtılmış ise, önceden işaretlenmiş Eppendorf tüplerine konsantre MamAΔ41 bölün.
44. Flash 193 ° K, sıvı azot ve mağaza donmuş

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokol doğru yapıldığında bir yüksek derecede saflaştırılmış, boyut, homojen ve konsantre protein örneklerinin almalısınız. Bu protein örneklerinin yanı sıra kristalizasyon çalışmalarda, enzim kinetiği, afinitesi ve daha fazlası gibi biyokimyasal çalışmalar, daha sonra hazır. Arıtma protokolü ana adımlar temsilcisi sonuçlar burada nitelendirdi. Ni-NTA afinite sütun elüsyon profili SDS-PAGE analizi ~ 22kDa (Şekil 1) uygun MW mediğinin ifade protein üzerinde çok açığa çıkarmalıdır. Bu SDS-PAGE analizi de flow-through sınırsız proteinler herhangi bir protein, akış ve ultra santrifüj pelet örnek yıkama en az açığa çıkarmalıdır. Uygun protein büyük bantlar bu örnekler görünür yoksa bir yanlış tampon hazırlanması, hücre parçalama veya kültür oto-indüksiyon koşulları ve büyüme sorunları sorunları göz önünde bulundurmalısınız.

İyon değişim kromatografisi nikel reçine (elektrostatik etkileşimleri veya histidin / olumsuz amino asitlerden zengin protein döngüler nedeniyle) ve kesilmemiş Onun Takip edilen arzu protein bağlı diğer E.coli proteinler arasında bizim arzu edilen proteini ayırmak için önceden şekillendirilmiş. Bu sütun artan NaCl konsantrasyonları altında pozitif yüklü reçine afinitesi göre proteinler ayırır. Yüksek olumsuz ücret proteini yüksek NaCl konsantrasyonları negatif yüklü olanları orta appose Zehir. Bu sütunun avantajları yüksek akış hızı ve bağlama kapasitesi vardır. Iyon değişimi kromatogram (Şekil 2) artan NaCl konsantrasyonu 3 proteinler nüfus arasında iyi bir ayırım ortaya koymaktadır. SDS-PAGE analizi, ileri arıtma adımları gerekli olup olmadığını arzu edilen bir ve değerlendirme tecrit, her nüfus MW belirlemek amacıyla ihtiyaç duyulmaktadır. Ikinci nüfus sığır trombin tarafından parçalanır ve üçüncü nüfusun SDS-PAGE düşük konsantrasyon nedeniyle mümkün değildir değildi MamAΔ41 + Onun Tag (~ 22kDa) ise ilk nüfus MamAΔ41 (~ 20 kDa). Proteinler doruklarına açıkça ayrılmış değilseniz bir yanlış tampon hazırlık düşünün veya NaCl degrade eğimi değiştirerek.

Boyut dışlama kromatografisi Ni-NTA reçine bağlı ve iyon değişimi kromatografisi sırasında ayrılmış değil diğer E.coli hücre proteinleri bizim arzu protein arasındaki ayırmak için önceden şekillendirilmiş. Bu sütun, boylarına göre proteinler ayırır. Büyük proteinler karşı büyük hacimlerde yıkandı, küçük küçük elüsyon hacimleri Zehir. Sütun kromatogram (Şekil 3), iyi bir ana nüfus olarak arzu edilen bir protein ayırma ortaya koymaktadır. Nüfus uygun monomer boyutu ~ 20 kDa MW Zehir görünür. ~ 80 kDa bandı (Ni-NTA reçine bağlar E.coli tipik protein) varlığı sütun yükleme SDS-PAGE önce tespit edilir ve bu çalışması sırasında kaybolur. Bu ~ 80 kDa protein konsantrasyonu ile başlayan düşük olduğundan, nüfus, seyreltme ve SDS-PAGE analizi, arıtma etkinliğini belirlemek için gerekli nedeniyle kromatogram görünmüyor. Biz bir kesinlikle uygun MW saf protein varlığını belirlemek için SDS-PAGE ana zirve seyreltilmiş ve konsantre bir örnek yükleme önerilir. Bu aşamada proteinin saflaştırılmış ve homojenlik MALDI-TOF tarafından değerlendirmeye tabi tutulmalıdır. Bu analiz MW 10.176 Da (Şekil 4) Mw 20347 Da ve başka bir protein saptandı. ~ 10 kDa protein ~ 20 kDa protein ücret iki katına çıkar. His-Tag kaldırma sonra kalan 9 amino asitler ile MamAΔ41 tahmin MW 20.596,5 Da edildi. Elde edilen MALDI-TOF MW karşılaştırarak bunların dışında 248 Da bulundu. Bu benzemezliği MALDI-TOF ölçüm hataları ve / veya ilk metiyonin ortak bozulması ve ikinci glisin nedeniyle neden olabilir. Sonuç olarak, proteinin yüksek derecede saflaştırılmış ve daha fazla deneyler için kullanılabilir.

Tablo 1. Tampon formülasyonlar.

Şekil 1. Ni-NTA sütun arıtma Temsilcisi SDS-PAGE analizi, sağdan sola; P-ultra santrifüj pelet (3.11 protokol adım), W yıkama (3.12 protokol adım), U-sınırsız proteinleri (3.10 protokol adım), E - elüsyon samp beş şeritles (3.14 protokol adım), M-protein işaretleyici (sayı MW belirtiniz). Ok MamAΔ41 gösterir.

Şekil 2. Iyon değişim kromatografisi adım (a) İyon değişimi (MonoQ sütun) kromatogram Analizi; Mavi - toplanan fraksiyonları göstergesi emme 280nm, protein konsantrasyonu, Yeşil-NaCl konsantrasyonu, Kırmızı temsil eder. (B) iyon değişimi arıtma adım Temsilcisi SDS-PAGE analizi. Soldan sağa; M-protein işaretleyici (numaraları Mw göstermektedir), A6 - ilk zirve fraksiyonu, A8-ikinci zirve fraksiyonu.

Şekil 3. Boyut dışlama kromatografisi analizi (a) Boyutu hariç tutma (Superdex 200 sütun) kromatogram; Mavi - emilimi 280nm, protein konsantrasyonu, toplanan fraksiyonları Red göstergesi temsil eder . (B) boyut dışlama arıtma adım Temsilcisi SDS-PAGE analizi. Soldan sağa; M-protein işaretleyici (numaraları MW göstermektedir), PreI pre-enjekte örnek, ilk zirve toplanan A4-6 kombine fraksiyonu, A4-6D Seyreltilmiş fraksiyonu zirveden toplanır.

Şekil 4. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI-TOF) kütle spektrumu saflaştırılmış MamAΔ41. Matris Sinapic asit (SA). MamAΔ41 de gösterildiği gibi, 20.347 Da gösterilen 10.176 Da MamAΔ41 iki katına ücret türler.

Tartışmalar

Proteinlerin saflaştırılması, herhangi bir biyokimyasal proteinler ya da yapısal çalışmalar içinde önemli bir adımdır. Her protein kendi davranışları ile benzersiz olduğu için, onun özelliklerini tanımlamak ve buna göre arıtma değiştirmek gerekiyor. Protein hedef biyoinformatik araçlar kullanarak arıtma doğru bir ilk adım olarak analiz edilmelidir. Onlar, hedef iso-elektrik nokta hesaplamak için çevre ve özel iyonları / ligandlar için ihtiyacı azaltıcı / oksitleyici ihtiyacı değerlen...

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
French Press	Equipment	Thermo scientific	FA-078A
Pressure cell	Equipment	Thermo scientific	FA-032
Ultra-centrifuge	Equipment	Sorvall	Discovery 90SE
Rottor	Equipment	Beckman	Ti60
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml	Equipment	Beckman	BC-355618
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns	Equipment	BioRad	737-2521
Ni-NTA His Bind resin	Equipment	Novagen	M0063428
Spectrophotometer	Equipment	Amersham Biosiences	Ultraspec 2100 pro
Quartz cuvette	Equipment	Hellma	104-QS
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10	Equipment	GE Healthcare Biosciences	28-4062-64
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE	Equipment	GE Healthcare Biosciences	10025543
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200	Equipment	GE Healthcare Biosciences	17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO	Equipment	Sartorius Stedim Biotech GmbH	VS1501
Table centrifuge	Equipment	Thermo scientific	IEC CL30R
MALDI-TOF	Equipment	Bruker Daltonics	Reflex IV
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane	Reagent	BioLab	20092391
Sodium Chloride	Reagent	FRUTROM	235553470
Imidazole	Reagent	Alfa Aesar	288-32-4
EDTA free protease inhibitors cocktail	Reagent	Sigma	P-8849
Dnase I (Deoxyribonuclease I)	Reagent	Sigma	DN-25
Bovine Thrombin	Reagent	Fisher BioReagents	BP25432
Glycine	Reagent	BioLab	07132391
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS)	Reagent	BioLab	19822391
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M-3148
InstantBlue	Reagent	Expedeon	1SB01L
PageRuler Prestained Protein Ladder	Reagent	Fermentas	SM0671