의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

요약

엄마가 magnetosome 활성화에 참여하는 표시되었습니다 독특한 Magnetosome 관련된 단백질이다. 여기에서 엄마가 삭제 돌연변이의 정화 프로토콜 (MamAΔ41)을 제시 M. magneticum AMB - 1.

초록

Magnetotactic 박테리아는 지자기의 필드 함께 스스로를 동쪽을 향하게 수 있습니다 수생 미생물의 다양한 그룹을 구성. 이 문제는 적합한 환경에서 검색을 돕기 위해 생각됩니다

프로토콜

1. E.에 엄마가 진의 복제와 표현 대장균

5' - GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG - 3 '와 5' - GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG - 3'돌연변이 유전자 mamAΔ41는 primers와 Magnetospirillum magneticum AMB - 1의 게놈 DNA의 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭되었습니다. 증폭된 DNA 조각에서 NcoI 사이트는 개시 코돈 ATG에서 도입하고 종료 코돈은 ScoI 사이트로 교체되었습니다. 조각은 NcoI와 SacI와 소화하고 pET52b (+)의 각 사이트에 복제, pET52bMamAΔ41 - AMB1에 상승을 제공했다. 이 구조에서 mamAΔ41 유전자는 C - 말단에있는 10 그 태그로 프레임에 융합되었다. 플라스미드는 대장균 E. 스트레인 BL21에 electroporated되었습니다. E. 대장균은 pET52bMamAΔ41을 품고 BL21가 (15) 자동 유도에서 3 시간 동안 암피실린 (50 MG / ML) 310 ° K를 포함하는 매체를 성장했다 변형. 재배 온도는 310 °에서 다음 300 ° K로 이동 300 ° K.시 추가 48 H에 대한 유지되었다 세포는 277에서 10 분 ° K. 대한 5,465그램에서 원심 분리에 의해 수확했다 8리터 문화가 젖어 세포 펠렛 60 그램 생산.

2. 생물 정보학 계산

ProtParam 서버 (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)를 사용하여 분자량 (MW), 아미노산 순서에 따라와 280nm에서 단백질의 1mg/1ml의 예측 흡수의 계산. 10His 태그 - MamAΔ41에 대한 MW는 22529 다 (240 아미노산)이며 MamAΔ41 (트롬빈에 의해 그의 태그 제거 후 남은 9 아미노산 포함)에 대한 MW가 20596.5Da (187 아미노산)입니다. 10His 태그 - MamAΔ41에 대한 280nm에서 단백질의 1mg/1ml의 예측 흡수는 0.595이고 0.579 MamAΔ41위한 것입니다. 또한, 아미노산 서열은 시스테인 잔류물을 포함하지 않습니다. 따라서, 감소 대리인은 정화 과정 필요는 없습니다.

3. MamAΔ41의 정제

1. 재고 솔루션 준비, 밖으로 무게 다음과 같은 농도에서 (200 ML 각) 준비 : 이미다졸 (MW 228.2 g / 몰) 4M 솔루션, NaCl (MW 58.44 g / 몰) 5M 솔루션 트리스 - HCL (MW 121.3 g / 몰 ) 1M 솔루션은 산도 = 8을 조정합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 두 증류수 (DDW)과 혼합을 추가합니다. 0.22μm 필터 및 실온에서 보관과 필터 솔루션을 제공합니다.
2. 준비 및 재고 솔루션 (Table1)로부터 6 신선한 버퍼를 필터링합니다.
3. 희석 및 버퍼 1시 2분 비율, 세포의 g는 버퍼로 볼륨 (ML)에서 세포를 일시 중지합니다.
4. 샘플의 DNA 조각을 깰하기 위해 DNase I (1 MG / ML)의 박테리아의 각 10gr에 대한 10μl를 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 프로 테아제 억제제 칵테일의 박테리아의 각 20gr을위한 1ml를 추가합니다. 얼음 20 분 알을 품다.
5. 25,000 PSI 프랑스어 언론의 두 사이클에 의해 세포를 중단. sonication 달리, 프랑스 언론은 얇은 구멍을 통해 높은 압력 하에서 세포를 강제하여 대량 (> 10ml) 세포 압출 것을 목표로하고 있습니다. 피스톤은 온도 상승으로 인해 그 사용 및 조립하기 전에 십분 얼음에 냉각해야합니다.
6. 25ml 초원 심 분리기 튜브에 lysed 세포를 전송 및 샘플은 튜브의 목 라인에 도달할 때까지 버퍼와 (50mg) 정확하게 그 균형을.
7. 277에서 1 시간 동안 27만g에서 울트라 원심 분리하여 별도의 세포 부스러기 ° K.
8. 컬럼에 20 % 에탄올에 보존 아르 니켈 NTA 수지, 4 ML을 추가하여 만든 중력 니켈 NTA 칼럼 (2.5cm 직경)를 준비합니다. 완전히 액체 포기 후 DDW 40 ML로 세척하고 완전히 유체 포기. 버퍼 A. 40 ML과 열의 사전 equilibrated 수지
9. 중력 니켈 NTA 칼럼에서 울트라 원심 분리 튜브에서 용해 분수를 적용합니다. -을 통해 흐름을 수집 (언바운드 단백질)와 277K에서 보존, 액체 포기.
10. 펠렛을 스크랩하기 위해 작은 팁을 사용하여 울트라 원심 분리 튜브에서 펠렛 샘플을 수집합니다. 50μl 5 % 2X의 β - 메르 캅 토 에탄올 SDS - PAGE 샘플 버퍼에 제보를 섞는다.
11. -을 통해 흐름을 수집하고 277K에서 보존, 유체 포기 100 ML 버퍼 B.있는 컬럼을 씻으십시오.
12. 15 표시 eppendorf 튜브 (1.5ml)을 준비합니다.
13. 용리 - 가까이 열 밸브 다음 컬럼에 버퍼 C의 1ml를 로드할 수, 밸브 열고 흐름을 통해 컬렉션의 다음 3 분 알을 품다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
14. Elute 정지 나머지 한 ML 버퍼 C 증가에와 밸브를 닫습니다.
15. 분수의 280nm에서 OD를 측정하여 단백질 피크의 위치를​​ 평가하고, OD 아직도> 0.3 경우, 추가 샘플이 필요합니다.
16. 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 다음 예제와 함께 수행되어야 흐름을 통해 언바운드 단백질은 -을 통해 흐름을 씻고 Ultra - 원심 분리 펠렛 샘플. 10μl 5 % 2X SDS - PAGE 샘플 버퍼의 β - 메르 캅 토 에탄올 각 샘플에서 10μl를 섞습니다. 15% SDS - PAGE에 샘플을로드 180 볼트에서 45 분 동안 실행.
17. InstantBlue 솔루션 15 ML에 젤 스테인, 1 시간 동안 흔들. 플라스틱 상자를 커버하고 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다.
18. 젤을 평가, 단백질 표현이 나타내는 밴드에 따라 높이와 특정 경우, 선택한 eluted 분수를 병합합니다.
19. 10 그분의 태그를 제거하기 위해 결합 샘플을 제조 업체의 추천에 따라, 소 트롬빈 (10 대 / μl), 1 MG 단백질 당 10μl 트롬빈를 추가합니다.
20. 투석은 초과 이미다졸 제거를 위해 사용되며 이온 교환 바인딩을하는 동안 필요한 수준에 NaCl 농도를 감소합니다. 투석을위한 7 KD 분자량의 원하는 길이를 잘라 (MWCO) 투석 튜브를 잘라. DDW로 씻어 한 끝 (또는 클립 인감)에서 매듭을합니다. 상단의 일부 공간을 떠나있는 동안 가방에 병합된 단백질 솔루션을 전송 최대 클램프.
21. 4 리터 냉장 투석 버퍼에 잠수함 투석 튜브 (버퍼 D). 277에서 천천히 밤을 통해 솔루션을 저어 ° K.
22. , 비커의 투석 튜브 출력을 가지고 작은 상처를 만들고 50ml 튜브에 단백질을 전송하기만하면됩니다.
23. 이온 교환 크로마 토그래피 : 빠른 성능 액체 크로마 토그래피 (FPLC)에 사전 포장 MonoQ 4.6/100 PE 열을 조립. DDW 여과 물 5 열 볼륨 (CV)로 컬럼을 씻으십시오. 버퍼 D. 5 CV와 Equilibrated 열
24. DDW (두 루프 볼륨)와 사출 루프를 세척하고 주사 루프의 단백질을로드 버퍼 D.과 반복합니다.
25. 단백질 샘플을 (1 ML / 분 유량) 주사와 한정되지 않은 단백질의 SDS - PAGE 감지 분수를 수집 시작합니다.
26. 초기 단백질 볼륨 (3.23 단계)는 사출 루프보다 큰 경우에는 전체 표본이 칼럼에로드되기 전까지는, 루프를 세척하지 않고 단계 3.25-3.26를 반복합니다.
27. 억제할 수없는 단백질을 제거하기 위해 버퍼 C 3 CV와 컬럼을 씻으십시오.
28. 높은 흐름 속도가 비용에 사용될 수 있지만 버퍼 D & E (100 % 버퍼 E는 그라디언트의 마지막 때), 유량 1 ML / 분 (사이 40 2000mM NaCl의 60 분 선형 그라디언트로 단백질을 Elute 큰 볼륨하지만, 덜 집중, 단백질 봉우리). 그들은 280nm 크로마토 그램에서 나타나는 단백질의 봉우리를 수집합니다.
29. 클린 사전 포장 열을 추천을 제조했다.
30. 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 다음 예제와 함께 수행되어야 억제할 수없는 단백질 흐름 통해 단백질 봉우리 흐름을 통해. SDS - PAGE를 실행하고 단계 3.17-3.18에 대한 언급으로 얼룩.
31. 단백질 미리 묻은 마커에 따라 예측된 MW에서 단백질 밴드 존재 젤을 평가해보십시오. 관련 단백질을 포함 선택 용출 분수를 병합합니다.
32. 크기 배제 크로마 토그래피에 필요한 NaCl 농도를 낮게하기 위해, 병합된 샘플을 Dialyze. 로 버퍼 F. 대해 단계 3.21-3.23에 언급된 투석을 수행
33. 사용 Vivaspin - 15 10,000 MWCO 8 테이블 원심 분리기, 4000 RPM의 MG / ML.을 단백질 샘플을 집중 쿼츠 쿠베트에서 280nm에서 OD를 측정하여 원하는 농도를 확인합니다. 단백질이 너무 집중되면 버퍼 F로 희석하고 다시 측정합니다.
34. 크기 제외 미리 포장 열, FPLC에 HiLoad 60분의 26 Superdex 200, 조립, DDW 필터링 물 3 CV로 컬럼을 씻어. 버퍼 F. 3 CV와 Equilibrated 열
35. 주사 루프의 단백질 시료에 대한 4 개 이상 ML을 로드할 수 없습니다 버퍼 F.와 동일한 볼륨에 의해 다음 5ml DDW (두 루프 볼륨)과 주사 루프를 씻으십시오.
36. 단백질 샘플을 (3.5 ML / 분 유량) 주사하고 그들이 280nm 크로마토 그램 나타나는 단백질 피크 분수를 수집 시작합니다. 그것이 열 볼륨에 도달할 때까지 버퍼 흐름을 보자.
37. 초기 단백질 볼륨 (3.23 단계)는 사출 루프보다 큰 경우에는 전체 표본이 칼럼에로드되기 전까지는, 루프를 세척하지 않고 단계 3.25-3.26를 반복합니다.
38. 제조 추천에 따라 청소 미리 포장 열.
39. 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 단백질 봉우리 샘플로 수행하여야한다. SDS - PAGE를 실행하고 단계 3.17-3.18에 대한 언급으로 얼룩.
40. 젤 평가 : 단백질 봉우리 특정하는 경우, 정확한 예측 MW에있는 단백질 미리 스테인드 마커와 한 밴드에 따라 관련 단백질의 eluted 분수를 선택 병합 볼 수 있습니다.
41. > 20 테이블 원심 분리기에 MG / ML, 4000 RPM에 Vivaspin - 15 10,000 MWCO를 사용하여 단백질 샘플을 집중. 280nm에서 OD를 측정하여 원하는 농도를 확인합니다. 정화 MamAΔ41 그러면 26.5 결정화에 대한 MG / ML에 집중했다.
<리튬> 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 (든 - TOF)를 사용하여 샘​​플 순도 및 단백질 식별을 확인합니다.
42. 각각 25 - 50μl 단백질, 단백질은 질량 분석기와 SDS - PAGE에 따라 투석을하는 경우, 사전 표시된 eppendorf 튜브에 집중 MamAΔ41를 나눕니다.
43. 플래시 193 ° K.에 액체 질소와 저장소에 냉동

4. 대표 결과

이 프로토콜이 올바르게 완료되면 하나는 높은 정화, 크기 동질적인 농축 단백질 샘플을해야합니다. 이러한 단백질 샘플 결정화 실험을 위해뿐만 아니라 효소 반응 속도론, 구속력 친화력 등의 생화학 연구, 그리고 준비가되어 있습니다. 정화 프로토콜의 주요 단계의 대표적인 결과입니다 여기에 설명되어 있습니다. 니켈 - NTA 친화 칼럼의 용출 프로필 SDS - PAGE 분석 ~ 22kDa (그림 1)의 적절한 MW의 용해 분율로 표현 단백질 이상의 높은 공개한다. 흐름을 통해 한정되지 않은 단백질에 단백질이 통한 흐름과 울트라 원심 분리 펠렛 샘플 세척하면이 SDS - PAGE 분석도 최소를 공개해야합니다. 적절한 단백질 큰 대역이 샘플에 나타나지 않는 경우도 잘못된 버퍼 준비, 세포 파괴 또는 문화 자동 유도 조건과 성장의 문제에 문제를 고려해야합니다.

이온 교환 크로마 토그래피는 니켈 수지 (정전기 상호 작용이나 히스티딘 / 부정적인 아미노산 풍부한 단백질 루프에 의한)과 포경 그의 - 태그 바람직한 단백질에 묶인 채로 다른 E.coli의 단백질 위해 바람직한 단백질 간의 분리하기 위해 preformed입니다. 이 열은 증가 NaCl 농도에서 긍정적으로 충전 수지 자신의 바인딩 선호도에 따라 단백질을 분리합니다. 높은 부정 청구 단백질에 부정 청구 것들을 검토할 appose 높은 NaCl 농도에 elute 것입니다. 이 칼럼의 장점은 높은 흐름 속도와 바인딩 용량입니다. 이온 교환 크로마토 그램 (그림 2) 증가 NaCl 농도 3 단백질의 집단 사이 좋은 분리를 보여준다. SDS - PAGE 분석이 더욱 정화 단계가 필요한지 여부를 바람직한 하나 평가를 분리, 각 인구의 MW를 결정하기 위해 필요합니다. 두 번째 인구가 소 트롬빈에 의해 죽습 세 번째 인구가 낮은 농도로 인해 SDS - PAGE에서 탐지되지 않습니다되었습니다 MamAΔ41 + 그의 태그 (~ 22kDa) 동안 첫 번째 인구는 MamAΔ41 (~ 20 KDA)입니다. 단백질의 봉우리가 명확히 분리되지 않으면 하나는 잘못된 버퍼 준비를 고려하거나 NaCl 기울기의 기울기를 변경해야합니다.

크기 제외 크로마 토그래피는 니켈 - NTA 수지에 묶인 채로 및 이온 교환 크로마 토그래피 동안 분리되지 않은 다른 E.coli 세포 단백질 위해 바람직한 단백질 간의 분리하기 위해 preformed입니다. 이 항목은 자신의 크기에 따라 단백질을 분리합니다. 대형 단백질 큰 볼륨으로 eluted 것입니다 작은 반대 작은 용출 권 elute 것입니다. 칼럼 크로마토 그램 (그림 3)은 하나의 주 인구로 바람직한 단백질의 좋은 분리를 보여준다. 인구는 ~ 20 KDA의 MW로 적절한 단량체 크기 elute 나타납니다. ~ 80 KDA 밴드 (NI - NTA 수지를 바인딩 E.coli 전형적인 단백질)의 존재는 열 로딩하기 전에 SDS - PAGE에서 발견이 실행되는 동안 사라지게됩니다. 이 ~ 80 KDA 단백질의 농도가 시작하는 낮은 것이므로, 그 인구는 희석 및 SDS - PAGE 분석은 정화 효율을 결정하기 위해 필요에 의한 크로마토 그램에 나타나지 않습니다. 우리는 하나 반드시 해당 MW의 순수한 단백질의 존재를 확인할 수 있도록 SDS - PAGE로 주봉의 희석 및 농축 샘플을 로딩하는 것이 좋습니다. 이 단계에 의해 단백질이 정화이며 균질성이 든 - TOF에 의해 평가해야합니다. 이 분석은 10,176 다 (그림 4)에서 20,347 MW 다 다른의 MW의 단백질을 공개했다. ~ 10 KDA 단백질은 ~ 20 KDA 단백질이 부과 두 배가됩니다. 그의 태그 제거 후 남은 9 아미노산과 MamAΔ41의 예측 MW는 20596.5 다되었습니다. 얻은 든 - TOF MW에 비교하여 우리는 그들이 떨어져 248 다 것으로 나타났습니다. 이 차이가 든 - TOF 측정 오류 및 / 또는 첫 번째 메티오닌의 일반적인 저하와 두 번째 글리신으로 인해에서 발생할 수 있습니다. 결론을 위해서는 단백질이 높은 정화하고 추가 실험에 사용할 수 있습니다.

표 1. 버퍼 공법.

그림 1. 니켈 - NTA 칼럼 정화의 대표 SDS - PAGE 분석 오른쪽에서 왼쪽으로,. P 울트라 원심 분리기 펠릿 (3.11 프로토콜 단계), W - 씻어 (3.12 프로토콜 단계), U - 억제할 수없는 단백질 (3.10 프로토콜 단계), E - 용출 샘프 다섯 차선레 (3.14 프로토콜 단계), M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다.) 화살표 MamAΔ41을 나타냅니다.

그림 2. 이온 교환 크로마 토그래피 단계 (A) 이온 교환 (MonoQ 열) 크로마토 그램의 분석, 블루 - 수집 분수의 표시 - 흡수 280nm, 단백질 농도, 그린 - NaCl 농도, 레드를 나타냅니다. 이온 교환 정화 단계 (B) 대표 SDS - PAGE 분석. 왼쪽에서 오른쪽으로, M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다), A6 - 첫번째 피크 분율, A8 초 피크 ​​분수.

그림 3. 크기 배제 크로마 토그래피 분석 (A) 크기 배제 (Superdex 200 열) 크로마토 그램, 블루 - 흡수 280nm, 단백질 농도, 수집 분수의 빨간 표시를 나타냅니다. 크기 제외 정화 단계 (B) 대표 SDS - PAGE 분석. 왼쪽에서 오른쪽으로, M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다), PreI - 사전 주입 샘플, 첫 번째 정상에서 수집한 A4 - 6 결합 분율, A4 - 6D - 희석 분율은 정상에서 수집했습니다.

그림 4. 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 (든 - TOF) 정화 MamAΔ41의 질량 스펙트럼. 매트릭스 Sinapic 산성 (SA)입니다. MamAΔ41도 같이 20,347 다에 나타난 것은 다 10176에 MamAΔ41의 두 배로 부과 수종입니다.

토론

단백질 정제는 생화학 단백질이나 구조 연구의 주요 단계입니다. 각각의 단백질 자체 동작과 독특한 있기 때문에 하나의 속성을 정의하고 이에 따라 그 정화를 수정해야합니다. 단백질 대상은 생물 정보학 도구를 사용하여 정화위한 첫 단계로 분석을해야합니다. 그들은 대상 ISO - 전기 지점을 계산 환경 및 특수 이온 / 리간드에 대한 필요성을 감소 / 산화에 대한 필요성을 평가하는 데 사용됩니?...

자료

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
French Press	Equipment	Thermo scientific	FA-078A
Pressure cell	Equipment	Thermo scientific	FA-032
Ultra-centrifuge	Equipment	Sorvall	Discovery 90SE
Rottor	Equipment	Beckman	Ti60
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml	Equipment	Beckman	BC-355618
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns	Equipment	BioRad	737-2521
Ni-NTA His Bind resin	Equipment	Novagen	M0063428
Spectrophotometer	Equipment	Amersham Biosiences	Ultraspec 2100 pro
Quartz cuvette	Equipment	Hellma	104-QS
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10	Equipment	GE Healthcare Biosciences	28-4062-64
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE	Equipment	GE Healthcare Biosciences	10025543
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200	Equipment	GE Healthcare Biosciences	17-1071-01
Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO	Equipment	Sartorius Stedim Biotech GmbH	VS1501
Table centrifuge	Equipment	Thermo scientific	IEC CL30R
MALDI-TOF	Equipment	Bruker Daltonics	Reflex IV
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane	Reagent	BioLab	20092391
Sodium Chloride	Reagent	FRUTROM	235553470
Imidazole	Reagent	Alfa Aesar	288-32-4
EDTA free protease inhibitors cocktail	Reagent	Sigma	P-8849
Dnase I (Deoxyribonuclease I)	Reagent	Sigma	DN-25
Bovine Thrombin	Reagent	Fisher BioReagents	BP25432
Glycine	Reagent	BioLab	07132391
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS)	Reagent	BioLab	19822391
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M-3148
InstantBlue	Reagent	Expedeon	1SB01L
PageRuler Prestained Protein Ladder	Reagent	Fermentas	SM0671