İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Özet

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

Özet

Inflamatuvar barsak hastalığı (İBH), bağırsak patolojileri, bir dizi olan en yaygın ülseratif kolit (ÜK) ve Crohn Hastalığı (CD) kapsar. UC ve CD, her iki kolonda bulunan, ishal, rektal kanama, karın ağrısı, kilo kaybı, benzer bir semptom profili oluşturmak ^1. İBH patogenezinde bilinmemektedir rağmen, hem de içerir multifaktöryel bir hastalık olarak tanımlanmaktadır genetik ve çevresel bileşenleri ²

Kolonik inflamasyon IBH çeşitli özellikleri benzer çok sayıda ve değişken hayvan modelleri vardır. Kolit aralığı gerektiren kolit-tetikleyen kimyasallar, dekstran sülfat sodyum (DSS) gibi belirli konsantrasyonlarda bu yönetim için belirli türlerin duyarlı suşlar kendiliğinden ortaya çıkan bu hayvan modelleri. Kimyasal bağlı gut inflamasyon modelleri IBH en sık kullanılan ve en iyi tarif modelleri. Adminiiçme suyu DSS edilebilmektedir yönetim protokolüne bağlı olarak akut ya da kronik kolit üretir. DSS sergi kilo kaybı ve gevşek dışkı veya ishal belirtileri ^verilen 3 Hayvanlar, bazen rektal kanama bulgusu ^olan 4,5 İşte, biz yöntemleri açıklanmaktadır hangi kolit gelişimi ve ortaya çıkan inflamatuvar yanıt DSS takiben karakterize edilebilir. Bu yöntemler, iltihabın bir belirteç olarak kullanılabilir histolojik hematoksilen / eosin lekeli kolon bölümlerinin analizi, pro-inflamatuar sitokinlerin ölçümü ve belirlenmesi miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, ⁶

Hastalık durumu inflamatuvar yanıt ölçüde klinik semptomların varlığı veya mukozal doku histolojisi değişiklik tarafından tespit edilebilir. Kolon histolojik zarar crypt mimarisi, inflamatuar hücre infiltrasyonu, kas t kaybı gözeten bir skorlama sistemi kullanılarak değerlendirildi.hickening, goblet hücre tükenmesi ve kript absesi kantitatif ^7, interlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü (TNF)-α gibi akut inflamatuar özellikleri, pro-inflamatuar sitokinlerin düzeyleri kullanılarak tespit edilebilir geleneksel ELISA yöntemleri. Buna ek olarak, MPO aktivitesi kolorimetrik tahlil kullanarak ölçülebilir ve inflamasyonun bir göstergesi olarak kullanılan ⁸

Deneysel kolit, hastalık şiddeti genellikle, MPO aktivitesi artışı ve yüksek düzeyde pro-inflamatuar sitokinler ile ilişkilidir. Kolit şiddeti ve inflamasyon ile ilişkili hasar hematoksilen / eosin lekeli kolon doku kesitlerinde kullanarak bağırsak histopatolojik durumu değerlendirmek için ek olarak, dışkı kıvamı ve kanama inceleyerek tespit edilebilir. Kolon doku parçaları, MPO aktivitesi ve sitokin üretimi belirlemek için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, bu önlemler bağırsak inflamatuvar yanıtı değerlendirmek için kullanılır.deneysel kolit hayvan modelleri.

Protokol

1. DSS-bağlı akut kolit murin model

1. Istenen nihai konsantrasyonu (% 1-5) (wt / vol) (yani,% 5 DSS çözüm otoklava su 500 ml için 25 mg DSS toz eklemek için) otoklavlanmış içme suyu dekstran sülfat sodyum (DSS) ekle . Stok çözelti ° C kadar bir haftaya kadar ya da 4 oda sıcaklığında bırakılabilir.
2. Biyogüvenlik kaputu, stok DSS çözüm 50 ml Falcon tüpleri (kafes ortalama gerekli bir) içine dökün. Gerekli stok solüsyonu tüplere dolum tutun.
3. DSS solüsyonu (50 ml Falcon tüpleri) ile her bir fare kafes içme suyu değiştirin (süresi kullanılan DSS rejimine bağlı olacaktır. Örneğin, 6-8 haftalık erkek C57BL / 6 fareler kullanarak, biz yönetmek toplam beş gün için% 5 DSS çözüm). Fare, başka bir su kaynağı girişi olmaması gerekir. Kontrol farelerde DSS olmadan otoklavlanmış içme suyu verilmiştir.
4. Günlük fareler tartılır ve DSS Hergün tüketilen miktarı kayıt. Her TopDSS seviyeleri kaydettikten sonra 50 ml şişe. Bu deney süresi boyunca fare başına düşen kafes başına tüketilen DSS yaklaşık hacmini ölçmek için. Çalışmalarda, erkek C57BL / 6 farelerinde ile 5 gün süreyle% 5 DSS çözüm kullanın. Önemli kilo kaybı, değişen dışkı kıvamı ve fekal kan bulguları bu özel DSS rejimi ile 3 gün gibi erken görülür. DSS yönetimi sırasında, fare, bir hayvan olduğunu ya da önemli fizyolojik göstergesi olarak belirgin kilo kaybı, dehidratasyon ve ishal ile kilo kaybı ile ilk ağırlığının% 20'den fazla sergi (5. günde ilk ağırlığının yaklaşık% 5-10) sonlanma noktası yakın. Hayvan% 5 DSS 5 gün sonra normal suya erişim verilirse, 7 gün içinde iyileşir. Tüm deneyler kurumun hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve onaylı Hayvan Kullanımı Protokolü (AUP) uygun olması gerekir.
5. Deney süresince, bir hastalık aktivite indeksi (DAI)skoru kolit klinik ilerlemesini değerlendirmek için değerlendirilebilir. DAI, başlangıç ​​ağırlığı, dışkı kıvamı ve kanama ile karşılaştırıldığında kilo kaybı kombine puan. Puanlar şöyle tanımlanmıştır: kilo kaybı: 0 (kaybı), 1 (% 1-5), 2 (% 5-10), 3 (% 10-20) ve 4 (>% 20), dışkı kıvamı: 0 (normal), 2 (gevşek dışkı), 4 (ishal) ve kanama: 0 (kan), 1 (Hemoccult pozitif), 2 (Hemoccult olumlu ve görsel pelet kanama) ve 4 (brüt kanama, kan etrafında anüs). DAI DSS tedavi süresince günde atılır.
6. Istediğiniz zaman noktada, tartmak ve fareler kurban. Fare kurumun hayvan tesis tarafından onaylanan izofluran veya başka bir yöntem teneffüs ettikten sonra servikal dislokasyon ötenazi olabilir.

2. Kolonik doku numunelerini

1. Açığa hayvan ventral tarafında ve% 70 etanol çözeltisi ile karın bölgesi ıslak. Bu noktada, Tablo 1'e bakın ve bir not edin.Rektal kanama (anal orifis kan mevcut) veya her hayvan rektal prolapsus ny imzaladı.
2. Ventral orta hat kesi yaparak karın kesilirken standart diseksiyon makas kullanın.
3. Kolon bulun ve distal kolon serbest kolorektal marjı mümkün olduğu kadar yakın olarak kolon transect.
4. Dikkatli ve yavaş yavaş çevredeki mezenter ayrılmakta, tüm kolon çekin.
5. Kolon, kolon proksimal ucu serbest colonocecal marjı transect. Dışkı, dikkatle bir çift bükülmüş cımbız / forseps kullanarak dışarı sıkma ya da 3 ya da 5 ml şırınga bağlı bir sonda iğne kullanılarak, steril PBS ile kolon durulama tarafından kaldırılabilir. (Bkz. Bölüm 3.1) tüm kolon kullanarak, hasar değerlendirmek
6. Histolojik inceleme için doku örneklemesi ve diğer testleri örnek alan not ederek, 1.0 cm uzunluğunda kolon parçaları 0.5 cm kesim tarafından yapılabilir (yani proksimal, orta veya distal).
7. Doku örnekleritestleri, 1.5 ml Eppendorf tüpler ayrı ayrı yerleştirilir ve sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -70 ° C'ye kadar saklanabilir için kullanılmak üzere

3. Kolit şiddetinin değerlendirilmesi

1. Makroskopik ya da hastalık şiddeti skoru daha önce yayınlanmış bir skorlama sistemi (Tablo 1) kullanarak tarafsız bir gözlemci tarafından ölümcül değerlendirilir. Forseps bir çift kullanarak ve tutarlılığı belirlemek için dışkı ^bastırarak 9 Tabure tutarlılık değerlendirilebilir . Dışkı kan için bir puan belirlemek için, dışkı renginin not edin (örneğin dışkıya karşı açık kahverengi dışkı) ve daha ileri bir Hemoccult testi kullanılarak doğrulamak. Puanlama sistemi kullanarak, koşulların her biri için bir puan belirler. Her bir hayvan için son makroskopik skor her bir puan toplamına eşittir.
2. Kolit şiddeti histolojik hasarı değerlendirmek için, kolon tamponlu% 10 formalin küçük bir parçası (0.5 cm), bir doku kaset yeri ve batığın kesti. 5 hazırlayınmikron parafin uygun prosedürler kullanarak kesitler hematoksilen / eoxin (H & E) ve leke bölümler gömülü. Colon parçaları proksimal, orta kolon veya kolon distal bölümünde alınabilir.
3. H & E lekeli kolon doku bölümleri aşağıdaki önlemleri daha önce yayınlanmış bir sistem kullanarak bir kör gözlemci tarafından gol vardır: (tüm kript, 3 kaybı ile ciddi crypt bozulma, normal, 0), inflamatuvar hücre infiltrasyonu derece (Normal, 0 crypt mimari işaretli kas kalınlaşması mevcut, 3), goblet hücre kaybı (Yok, 0 - - mevcut, 1) ve kript absesi (yok, 0 - halen yoğun inflamatuar), kas kalınlaşması (crypt baz muskularis mukoza, 0 oturur 3 sızmak 1) ⁷ histolojik hasar skoru her bir puan toplamına eşittir. Bu crypt apseler insan UC aksine, bu modelin karakteristik değildir ve nadiren görülür belirtmek gerekir ki; mikroskobik ülserasyonlar da nadirdir. Eğer birden fazla kolon bölümleribenzer bölümler arasında lekeli, histolojik skor her alan için final skoru (distal kolonda histolojik skoru karşılık proksimal kolon yani histolojik skoru) belirlemek için kullanılmalıdır.

4. Deneyleri için reaktiflerin stok çözümleri hazırlayın

1. Çözüm (K ₂ HPO _4, çift bazlı potasyum fosfat 1 dH ₂ O L 8.7 g) B çözeltisi ekleyerek 50 mM potasyum fosfat tampon solüsyonu hazırlayın (KH ₂ PO _4, 1L tekbazlı potasyum fosfat 6.8 g dH ₂ O) kadar 6.0 pH elde edilir. Kalan çözümler ileride kullanmak kadar buzdolabında (2-8 ° C) saklanabilir.
2. Potasyum Fosfat tamponu (50 mM, pH = 6.0) 1 L içine 5 gr HTAB ekleyerek hekzadesiltrimetilamonyum bromür (tablo) tampon hazırlayın. 2-8 çözülür ve saklamak için hafifçe ısı ° C kullanana kadar. Gerektiğinde, yeniden çözünmesi için ısı.
3. Protein analizi için doku homojenizasyon lizis tamponu hazırlayın1M Tris-hidroklorik asit (pH = 8.0), 5M sodyum klorür 6 mL ve 2 mL steril distile su Triton X-100 için 182 ml, 10 ml sözlerine ekledi. Triton X-100 oda sıcaklığında çok viskoz ve böylece, kullanımı hafifçe önceden ısınmış olmalıdır. Hazırlanan lizis tamponu, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanabilir.

5. Deneyleri için örnek hazırlama

1. MPO analizi için örnek hazırlanması.
   1. Örnekleri çıkarın -70 ° C ve buz koyun. 2mL Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüp (ya da bir homojenizatör ile kullanılabilecek herhangi bir tüp) / cımbız ve yerde boynu bükük forsepsle kullanarak görünür bir dışkı ya da yağ çıkardıktan sonra her numunenin ağırlığı kaydedin. Numuneler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Benzer kolon parçaları her bir biyolojik tekrarında (yani distal bölümleri tek veya proksimal bölümleri sadece) kullanılması gerektiğini dikkat etmek önemlidir.
   2. Her örnek tüpü homojenizatör boncuk.
   3. HTAB tampon uygun miktarda ekledoku ağırlığına göre ferin. Doku ağırlığı 25 mg daha az ise, 12.5mg/mL bir oranında tampon eklemek; doku ağırlığı 25-50 arasında ise, 25mg/mL bir oran ekleyin. Doku ağırlığı 50'den büyükse, 50mg/mL bir oranında tampon ekleyin.
   4. 4 dakika 30 Hz için bir doku homojenizatör ile homojenize. Doku tamamen homojenize değilse tekrarlayın.
   5. Homojenizatör boncuk ve 6 dk (13400 xg, 4 ° C) santrifüj çözümü çıkarın.
   6. Süpernatant toplayın ve sonuçta elde edilen pelet atın. Supernatent -70 ° C kullanana kadar saklanabilir.
2. Sitokin analizi için örnek hazırlanması.
   1. Tekrar adımları 5.1.1. 5.1.2 için.
   2. Proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) 50 ul hazırlanan lizis tamponu 10 ml ekleyin.
   3. PIC ve ağırlığı ne olursa olsun her bir örnek için lizis tampon çözelti 1 ml ekleyin.
   4. 30 Hz 5 dakika karıştırılır. Doku tamamen homojenize değilse tekrarlayın.
   5. Homojenizatör boncuk ve santrifüj soluti çıkarın3300 x g. az 5 dakika
   6. Süpernatant toplayın ve sonuçta elde edilen pelet atın. Süpernatant -70 ° C kullanana kadar saklanabilir.

6. Inflamatuvar belirteçler Kantitasyonu

1. MPO aktivitesi tahlil
   1. O dianisidine dihidroklorür dH ₂ O, 90 ml ve 10 ml potasyum fosfat tamponu 16,7 mg birleştirerek o dianisidine dihidroklorür (o-dianisidine) çözeltisi hazırlayın . Bu çözüm, her tahlil için taze olarak hazırlanması gerekir.
   2. 96 plaka, üç nüsha olarak doku Homojenat (bölüm 5.1 hazırlanan) 7 mcL ekleyin.
   3. Seyreltilmiş H ₂ O ₂ (4% 30 H ₂ O ₂ 96 dH ₂ O mcL seyreltilmiş mcL) 50 mcL o dianisidine karışıma ekleyin.
   4. 200 mcL kuyuların her H ₂ O ₂ içeren o-dianisidine karışımı eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
   5. Spectropho kullanarak 450 nm dalga boyunda absorbansı ölçülürtometer. 30 saniyelik aralıklarla az üç okuma çekin.
   6. MPO aktivitesi hesaplayın. MPO aktivitesi MPO bir birim 1 mol H ₂ O ₂ oda sıcaklığında dakikada aşağılamak için gerekli olan miktar olarak tanımlanır MPO / mg doku birimleri (U) olarak ölçülür. MPO bir birim (U) = 1 mol H ₂ O ₂ split, ve H ₂ O ₂ 1 mol 1.13 x 10 ^-2 nm / dk absorbans bir değişiklik verdiği göz önüne alındığında, her bir örnek MPO birimleri belirlenir. absorbans değişimi olarak [ΔA (t _{2-t 1)]} / Δmin x (1,13 x 10 ^-2). Mg doku başına birimleri almak için, doku kullanın: tampon oranı. Örneğin, bir doku halinde: 50 mg / ml tampon oranı kullanılmıştır, 7 mcL Homojenat, 0.35 mg doku vardır. Bu nedenle, MPO birimleri bölmek, 0,35 mg doku başına birimleri almak için. Absorbans değerleri kullanarak bir örnek hesaplama (nm) (örnek, üç nüsha olarak eklenmiştir olduğunu varsayarak) aşağıda bulunmaktadır:

Örnek	Zaman 0 sec			Süresi 30 sn			Süresi 60 sn
A	1	2	3	1 '	2 '	3 '	1 "	2''	3 "
	0,048	0,048	0,051	0,061	0,061	0,065	0,074	0,073	0,078

1. Ortalama Süre 0 sn = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 nm
2. Süresi 30 sn ortalama = 0,0623 nm
3. Süresi 60 sn Ortalama = 0.075 nm
4. 0 ile 30 sn / mg doku (50 mg / ml doku varsayarak: tampon oranı) absorbans (ΔA) = [(0,0623-0,049) / (1.13 x 10 ^-2)] / 0,35 = 3,363
5. Absorbe içinde değişimance (ΔA) 30 - 60 sn / mg doku = 3,211
6. * MPO aktivitesi (U / mg doku) ΔA = ortalama (0-30) ve ΔA (30-60) = 3,287

2. ELISA ile pro-inflamatuar sitokinlerin Niceleme
   1. Sitokin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) düzeyleri ticari enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kiti (R & D Systems Quantikine murin) kullanılarak belirlenir.
   2. Her ELISA absorbans değerleri, her bir örnek için ilgili Bradford protein assay kullanarak normalize ve pg / mg protein birimleri cinsinden ifade edilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Uygun DSS rejimi İdaresi farelerde akut kolit neden olacaktır. DSS tedavi süresince, DAI klinik hastalığın ilerleyişini değerlendirmek ve değerlendirmek için kullanılabilir. DSS ile tedavi edilen hayvanların ilk ağırlıklara göre belirgin kilo kaybı, gevşek dışkı ve dışkıkanama (Şekil 1). (Şekil 2 ve Tablo kolon fedakarlık ve sınav üzerine, kolit şiddeti makroskopik dışkı kıvamı gevşeme kolon uzunluğu, kolon kanaması, dışkı kanama, kısaltılması göre atılırsa, rektal kanama belirtileri ve sadece su ile tedavi kontrollere göre 1). H & E ile boyandı kolon doku örnekleri kesitler DSS ile tedavi edilen iki nokta üst üste (Şekil 3) su ile tedavi edilen kontrol grubuna göre daha yüksek histolojik skorlar olacaktır. DSS ile tedavi edilen farelerde inflamasyon ölçüde karakterize etmek için, MPO aktivitesi homojenize kolon doku örnekleri değerlendirilebilir. DSS ile tedavi edilen iki nokta üst üste denetimleri (Şekil 4) kıyasla daha yüksek MPO aktivitesi olacak. Buna ek olarak, bu pro-inflamatuar sitokinlerin düzeylerinde artış (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Şekil 5) ile ilişkilidir.

Şekil 1 Erkek, C57BL / 6 fareler, 5 gün süreyle içme suyu% 5 DSS verildi . DAI puanları her bir hayvan için günlük olarak değerlendirildi ve her grup için günde (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ortalaması alınmıştır.

Şekil 2 C57BL / 6 farelerde 5 gün süreyle% 5 DSS içme suyu verildi. Kontrol farelerde DSS olmadan su aldı. Makroskopik hasar skoru / hastalık şiddeti skorları körü körüne gün 5 mesaj DSS-bağlı kolit olarak değerlendirildi. DSS alınan fareler izole edilen iki nokta üst üste yüksek makroskopik hasar skorları (rektal kanama, rektal prolapsus, ishal, kolonik kanama) daha fazla hastalık şiddeti (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) gösteren var.

Şekil 3. C57BL / 6 fareler kolit ikna etmek için% 5 DSS çözüm içme suyu verildi. Kontrol fareler DSS olmadan su aldı. (A) histolojik skorları körü körüne gün 5-DSS sonrası yönetim toplanan H & E lekeli kolon doku bölümleri kullanılarak skorlandı. (B) (C) kontrol (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ile karşılaştırıldığında daha histolojik hasar (hücresel infiltrasyonu, goblet hücre tükenmesi, daha fazla bozulma / crypt mimarisine zarar) DSS-tedavi edilen örnekleri göstermektedir. (B) ve (C), yıldız (*) goblet hücre incelmesi ve crypt mimari bozulma alanı gösterir; sayı işareti (#) hücresel infiltrasyon gösterir.

Şekil 4. Tüm fareler gün 5 Posta idaresi, DSS ve kolon doku örnekleri üzerinde kurban MPO aktivitesi değerlendirmek için toplandı . DSS indüklediği kolit Önem kontroller (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ile karşılaştırıldığında yüksek düzeyde MPO aktivitesi ile ilişkilidir.

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Şekil 5 yüksek MPO düzeyleri, DSS-kaynaklı kolit şiddeti yanı sıra aynı zamanda artmış IL-1β, IL-6, TNF-α gibi pro-inflamasyon sitokinlerin düzeyi (ortalama ± SEM, n = 4 fareler ile ilişkili / grup).

Tablo 1 Makroskopik / Hastalık Ciddiyet Skoru

Puan	Rektal kanama	Rektal prolapsus	Tabure Tutarlılık	Kan
0	Hiçbiri	Hiçbiri	Normal	Normal
1	Kırmızı	Prolapsus belirtileri	Yumuşak	Kırmızı
2	Koyu Kırmızı	Temizle prolapsusu	Çok Yumuşak	Koyu kırmızı
3	Brüt Kanama	Kapsamlı prolapsusu	Ishal	Siyah

Tartışmalar

DSS kolit bağırsak inflamasyonu yaygın olarak kullanılan bir kimyasal indüklenen model. Bu modelde, fare, epitel hücreleri gut ve mukozal bariyer bütünlüğünü bozmaya zehirli olduğu düşünülmektedir DSS ile takviye içme suyu verilmiştir. ^DSS 10 İdaresi gevşek dışkı, dışkı kanama ile karakterize akut bir kolit neden olur , ve granülositler ile infiltrasyon ¹⁰ DSS yönetimi sırasında, kolit genellikle dışkı gaitada gizli kan testi ile tespit edilebilir önemli kilo kayb...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / ekipman Adı:	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Eppendorf Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüp (2mL)	Eppendorf	0030 120.094
BIOTEK EL808 Absorbans plaka okuyucu	BIOTEK	EL808
Dekstran sülfat sodyum tuzu saflıkta (molekül ağırlığı 36,000-50,000 Da)	MP Biyomedikal	160110
Gen5 (yazılım)	BIOTEK	Sürüm 1.10.8
Hekzadesiltrimetilamonyum bromür (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Hidrojen peroksit, su içinde 30 ağırlıkça% çözüm	Sigma-Aldrich	216763	Mağaza 2-8 ° C
Microtest pl96-düz dipli yedi	Sarstedt	82,1581	Tek kullanım için
o-Dianisidine	Sigma-Aldrich	D-3252	Işığa karşı hassastır. Mağaza 2-8 ° C
Potasyum fosfat, dibazik	Caledon	6620-1
Potasyum fosfat, tekbazlı	Merck Kimyasallar	PX1565-1
Proteaz inhibitörü kokteyl	Sigma-Aldrich	P8340	-20 ° C'de muhafaza
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Doku Lyser II Tungsten Karbür boncuk	QUIAGEN	69997