Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

Riepilogo

Modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale, ci hanno permesso di esaminare il complesso di risposte innate e adattative immunitario associate con patogenesi. Utilizzando il punteggio istologico, la quantificazione di citochine pro-infiammatorie e di attività mieloperossidasi, si può cominciare a valutare queste risposte visto nella malattia infiammatoria intestinale.

Abstract

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) comprende una vasta gamma di patologie intestinali, le più comuni delle quali sono la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD). Entrambe le UC e CD, quando presenti nel colon, generare un profilo simile sintomo che può comprendere diarrea, sanguinamento rettale, dolore addominale e perdita di peso. ¹ Sebbene la patogenesi della malattia infiammatoria intestinale rimane sconosciuta, è descritto come una malattia multifattoriale che coinvolge sia componenti genetiche e ambientali ^2.

Ci sono modelli animali numerosi e variabili di infiammazione del colon che assomigliano a diverse caratteristiche di IBD. Modelli animali di colite gamma da quelli che nascono spontaneamente in ceppi sensibili di alcune specie a quelli che richiedono la somministrazione di concentrazioni specifiche di colite che inducono prodotti chimici, come il sodio destrano solfato (DSS). Chimica indotta modelli di infiammazione dell'intestino sono i modelli più comunemente utilizzati e meglio descritta di IBD. ADMINIdimostrazione di DSS in acqua potabile produce colite acuta o cronica a seconda del protocollo di amministrazione ^3. Animali dato DSS perdita di peso e mostrano segni di feci molli o diarrea, a volte con evidenza di sanguinamento rettale. ^4,5 Qui si descrivono le modalità con cui sviluppo colite e la risposta infiammatoria risultante può essere definita dopo la somministrazione di DSS. Questi metodi includono l'analisi istologica di ematossilina / eosina sezioni del colon macchiato, la misurazione di citochine pro-infiammatorie, e la determinazione della mieloperossidasi (MPO) attività, che può essere utilizzato come marker surrogato di infiammazione ^6.

L'entità della risposta infiammatoria in stato di malattia può essere valutata la presenza di sintomi clinici o alterazioni istologiche nel tessuto della mucosa. Colon danno istologico viene valutata utilizzando un sistema di punteggio che considera la perdita di architettura cripta, infiltrazione di cellule infiammatorie, muscolari tascesso hickening, deplezione delle cellule caliciformi, e la cripta. ⁷ Quantitativamente, i livelli di citochine pro-infiammatorie acute con proprietà antinfiammatorie, come l'interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, si può determinare con ELISA metodi convenzionali. Inoltre, l'attività MPO può essere misurata mediante un saggio colorimetrico e utilizzato come un indice di infiammazione ^8.

Nella colite sperimentale, la gravità della malattia è spesso correlato con un aumento dell'attività MPO e più elevati livelli di citochine pro-infiammatorie. Gravità colite e l'infiammazione associati danno può essere valutata esaminando la consistenza delle feci e sanguinamento, oltre a valutare lo stato istopatologici dell'intestino con ematossilina / eosina sezioni colorate di tessuto del colon. Frammenti di tessuto del colon può essere utilizzato per determinare l'attività MPO e produzione di citochine. Nel loro insieme, queste misure possono essere utilizzate per valutare la risposta infiammatoria intestinalemodelli animali di colite sperimentale.

Protocollo

1. Modello murino di DSS-indotta colite acuta

1. Aggiungi destrano sodio solfato (DSS) per l'acqua potabile sterilizzati in autoclave per la concentrazione finale desiderata (1-5%) (peso / volume) (cioè per ottenere una soluzione DSS 5%, aggiungere 25 mg di polvere di DSS a 500 ml di acqua autoclavato) . Soluzione madre può essere lasciato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. In una cappa di biosicurezza, versare DSS soluzione madre in 50 ml provette Falcon (una necessaria per gabbia). Mantenere la soluzione stock di tubi ricarica quando necessario.
3. Sostituire l'acqua potabile in ogni gabbia del mouse con la soluzione DSS (in provette Falcon da 50 ml) (La durata dipende dal regime DSS che viene utilizzato. Ad esempio, utilizzando 6-8 C57BL vecchio settimana maschio / 6 topi, abbiamo amministrare un DSS soluzione al 5% per un totale di cinque giorni). I topi non dovrebbero avere accesso a qualsiasi altra fonte d'acqua. Topi di controllo sono forniti di acqua potabile senza autoclave DSS.
4. Pesare topi quotidiano e registrare la quantità di DSS consumata al giorno. Top ognibottiglia da 50 ml dopo la registrazione dei livelli DSS. Questo è quello di misurare il volume approssimativo di DSS consumata per gabbia del mouse per tutta la durata dell'esperimento. Nei nostri studi, si usa una soluzione DSS 5% per 5 giorni con C57BL maschio / 6 topi. Significativa perdita di peso, la consistenza delle feci alterata e segni di sangue fecale sono visti fin dal giorno 3 utilizzando questo particolare regime DSS. Durante l'amministrazione DSS, i topi mostrano notevole perdita di peso (circa 5-10% del loro peso iniziale il giorno 5) con la perdita di peso superiore al 20% del peso iniziale con disidratazione e diarrea essere l'indicatore significativo fisiologico che un animale è pari o vicino endpoint. Se l'animale abbia accesso ad acqua normale, dopo i 5 giorni del 5% di DSS, si recupererà entro 7 giorni. Tutti gli esperimenti devono essere approvati dalla dell'istituzione animale comitato etico ed essere in conformità del protocollo approvato utilizzo degli animali (AUP).
5. Per tutta la durata dell'esperimento, un indice di attività della malattia (DAI)punteggio può essere valutato per valutare la progressione clinica della colite. Il DAI è il punteggio combinato della perdita di peso rispetto al peso iniziale, la consistenza delle feci, e sanguinamento. I punteggi sono definiti come segue: perdita di peso: 0 (nessuna perdita), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), e 4 (> 20%), la consistenza delle feci: 0 (normale), 2 (feci molli), e 4 (diarrea), e sanguinamento: 0 (assenza di sangue), 1 (Hemoccult positivo), 2 (Hemoccult sanguinamento positivo e visivo pellet), e 4 (sanguinamento grave, il sangue intorno ano). DAI può essere segnato ogni giorno per tutta la durata del trattamento DSS.
6. Nel punto in tempo di scelta, peso e sacrificio topi. I topi possono essere eutanasia da dislocazione cervicale a seguito di inalazione di isoflurano o altro metodo riconosciuto da stabulario dell'istituto.

2. Raccogliere campioni di tessuto del colon

1. Esporre il lato ventrale dell'animale e bagnare la zona addominale con una soluzione di etanolo al 70%. A questo punto, fare riferimento alla Tabella 1 e fare atto di unany segni di sanguinamento rettale (sangue presente al orifizio anale) o prolasso rettale in ogni animale.
2. Uso standard forbici dissezione di incidere l'addome facendo una incisione ventrale linea mediana.
3. Individuare i due punti e transetto i due punti più vicino possibile al margine del colon-retto più possibile per liberare il colon distale.
4. Attentamente e lentamente tirare fuori tutto il colon, distogliendolo dalle mesentere circostante.
5. Transetto i due punti al margine colonocecal per liberare l'estremità prossimale del colon. Feci può essere rimossa risciacquando colon con PBS sterile utilizzando un ago sonda collegata ad una siringa da 3 o 5 ml o da spremere accuratamente con l'ausilio di un paio di pinzette piegato / pinze. Utilizzando l'intero colon, per valutare i danni (vedi Sezione 3.1)
6. Campionamento per l'analisi istologica dei tessuti ed altri test può essere fatto tagliando 0,5 centimetri per 1,0 centimetri lunghi frammenti del colon prendendo nota di quale area campione è di (cioè prossimale, medio o distale).
7. Campioni di tessutoda utilizzare per i test possono essere singolarmente posto in 1,5 ml provette Eppendorf e congelato in azoto liquido e conservati fino al momento dell'uso a -70 ° C.

3. Valutazione della gravità colite

1. Punteggio di gravità macroscopica o malattia terminale è valutata da un osservatore imparziale utilizzando un sistema di punteggio precedentemente pubblicato (Tabella 1). ⁹ La consistenza delle feci può essere valutata utilizzando una pinza e premendo verso il basso le feci per determinare la consistenza. Per determinare il punteggio di sangue nelle feci, si noti il ​​colore delle feci (feci cioè nero contro la luce feci marrone) e convalidare ulteriormente con un test Hemoccult. Utilizzando il sistema di punteggio, determinano un punteggio per ciascuna delle condizioni. Il punteggio finale macroscopico per ogni animale è la somma di ogni punteggio individuale.
2. Per valutare i danni istologici di gravità colite, tagliare un piccolo frammento (0,5 cm) del colon, posto in una cassetta tessuto e immergerlo in soluzione tamponata formalina al 10%. Preparare 5paraffina micron incorporato sezioni trasversali e sezioni macchia con ematossilina / eoxin (H & E) utilizzando le procedure appropriate. Frammenti del colon può essere preso dal prossimale, a metà del colon, o parte distale del colon.
3. H & E sezioni colorate di tessuto del colon sono segnati da un osservatore cieco utilizzando un sistema precedentemente pubblicato per le seguenti misure: architettura cripta (normale, 0 - grave distorsione cripta con perdita di cripte intero, 3), grado di infiltrazione di cellule infiammatorie (normale, 0 - denso infiltrato infiammatorio, 3), l'ispessimento del muscolo (base della cripta si trova sulla muscolaris mucosae, 0 - segnata presenti ispessimento del muscolo, 3), deplezione delle cellule caliciformi (assente, 0 - oggi, 1) e ascesso cripta (assente, 0 - presente , 1). ⁷ Il punteggio danno istologico è la somma di ogni punteggio individuale. Va notato che a differenza dell'uomo UC, ascessi cripta non sono caratteristici di questo modello e si vedono raramente; ulcerazioni microscopiche sono anche rari. Se le sezioni più due punti sono statimacchiato, punteggi tra sezioni istologiche simili dovrebbero essere usati per determinare il punteggio finale per ogni area (cioè punteggio istologico nel colon prossimale rispetto al punteggio istologico nel colon distale).

4. Preparare soluzioni di reagenti per le analisi

1. Preparare una soluzione 50 mM di tampone fosfato di potassio con l'aggiunta di soluzione B (K ₂ HPO _4, 8,7 g di fosfato di potassio bibasico in 1 L di dH ₂ O) per la soluzione A (KH ₂ PO _4, 6,8 g di fosfato monobasico di potassio in 1L di dH ₂ O) fino a pH di 6,0 è raggiunto. Le soluzioni rimanente può essere conservato in frigorifero (2-8 ° C) fino a un uso futuro.
2. Preparare bromuro esadeciltrimetilammonio (HTAB) tampone con l'aggiunta di 5 g HTAB in 1 L di tampone fosfato di potassio (50 mM, pH = 6,0). Delicatamente il calore per sciogliere e conservare a 2-8 ° C fino al momento dell'uso. Quando richiesto, il calore di ri-sciogliere.
3. Preparare tampone di lisi per la omogeneizzazione dei tessuti per l'analisi delle proteine ​​da parteaggiungendo 10 mL di 1M tris-acido cloridrico (pH = 8,0), 6 ml di cloruro di sodio 5 M e 2 ml di Triton X-100-182 ml di acqua distillata sterilizzata. Triton X-100 è molto viscoso a temperatura ambiente e, quindi, dovrebbe essere riscaldato delicatamente prima dell'uso. Il tampone di lisi preparata possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso.

5. Preparazione dei campioni per le analisi

1. La preparazione del campione per l'analisi MPO.
   1. Rimuovere i campioni da -70 ° C e il luogo in ghiaccio. Registrare il peso di ciascun campione dopo aver rimosso le feci visibili o grasso utilizzando un pinza piegata / pinzetta e il luogo in 2 ml Eppendorf Safe-Lock provetta (o qualsiasi altro tubo che può essere utilizzato con un omogeneizzatore). I campioni devono essere conservati in ghiaccio in ogni momento. E 'importante notare che i frammenti del colon simili dovrebbero essere usati da ogni replica biologici (ad esempio sezioni sezioni distale o prossimale solo solo).
   2. Aggiungi omogeneizzatore tallone ad ogni provetta.
   3. Aggiungere la quantità appropriata di buf HTABFer in base al peso del tessuto. Se il peso del tessuto è inferiore a 25 mg, aggiungere la soluzione tampone con un rapporto di 12.5mg/mL, se il peso del tessuto è compresa tra 25-50, aggiungere con un rapporto di 25mg/ml. Se il peso del tessuto è superiore a 50, aggiungere tampone con un rapporto di 50mg/ml.
   4. Omogeneizzare con un omogeneizzatore tessuto per 4 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato.
   5. Rimuovere omogeneizzatore tallone e la soluzione di centrifuga per 6 min (13.400, xga 4 ° C).
   6. Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Supernatent possono essere conservati a -70 ° C fino al momento dell'uso.
2. La preparazione del campione per l'analisi delle citochine.
   1. Ripetere i passaggi 5.1.1. a 5.1.2.
   2. Aggiungere 50 ml di cocktail di inibitori delle proteasi (PIC) a 10 mL di tampone di lisi preparata.
   3. Aggiungere 1 ml del PIC e di soluzione tampone di lisi per ogni campione a prescindere dal peso.
   4. Omogeneizzare per 5 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato.
   5. Rimuovere omogeneizzatore tallone e centrifugare SOLUZIOper 5 min a 3300 x g.
   6. Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Surnatante può essere conservato a -70 ° C fino al momento dell'uso.

6. Quantificazione di marker infiammatori

1. Attività di test MPO
   1. Preparare o-dianisidina dicloridrato (o-dianisidina) soluzione combinando 16,7 mg di o-dianisidina dicloridrato, 90 ml di dH ₂ O e 10 ml di tampone fosfato di potassio. Questa soluzione deve essere preparato fresco per ogni test.
   2. Aggiungere 7 ml di tessuto omogenato (preparato in paragrafo 5.1) in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti.
   3. Aggiungere 50 ml di diluito H ₂ O ₂ (4 ml di 30% di H ₂ O ₂ diluita in 96 ml di dH ₂ O) per l'o-dianisidina miscela.
   4. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri della o-dianisidina miscela contenente H ₂ O ₂ a ciascuno dei pozzi.
   5. Misurare l'assorbanza a 450 nm usando uno spettrofotometrotometer. Prendere tre letture ad intervalli di 30 secondi.
   6. Calcolare l'attività MPO. Attività MPO è misurata in unità (U) di MPO / mg di tessuto, in cui è definito un'unità di MPO come l'importo necessario per degradare 1 mmol di H ₂ O ₂ al minuto a temperatura ambiente. Considerando che una sola unità (U) di MPO = 1 mol di H ₂ O ₂ diviso e che 1 mol di H ₂ O ₂ dà un cambiamento di assorbanza di 1,13 x 10 ^-2 nm / min, unità di MPO in ogni campione è determinato come variazione di assorbanza [ΔA (t _{2-t 1)]} / Δmin x (1,13 x 10 ^-2). Per ottenere unità per mg di tessuto, uso del tessuto: rapporto di buffer. Per esempio, se un tessuto: il rapporto di buffer di 50 mg / ml è stato usato, in 7 ml di omogenato, non vi è 0,35 mg di tessuto. Pertanto, per ottenere unità per mg di tessuto, dividere le unità di MPO da 0,35. Un esempio di calcolo utilizzando i valori di assorbanza (nm) è riportato qui di seguito (assumendo che il campione è stato aggiunto in triplice copia):

Campione	Tempo 0 sec			Tempo di 30 sec			Tempo di 60 sec
A	1	2	3	1 '	2 '	3 '	1 "	2''	3 "
	0,048	0,048	0,051	0,061	0,061	0,065	0,074	0,073	0,078

1. Media al tempo 0 sec = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm
2. Media in fase di 30 sec = 0,0623 nm
3. Media in fase di 60 sec = 0,075 nm
4. Variazione di assorbanza (ΔA) da 0 a 30 sec / mg di tessuto (assumendo 50 mg / ml di tessuto: rapporto di buffer) = [(0,0623-0,049) / (1,13 x 10 ^-2)] / 0,35 = 3,363
5. Cambiamento di assorbireANCE (ΔA) da 30 a 60 sec / mg di tessuto = 3,211
6. * Attività di MPO (U / mg di tessuto) = media di ΔA (0-30) e ΔA (30-60) = 3,287

2. Quantificazione dei citochine pro-infiammatorie da ELISA
   1. Citochine (IL-1β, IL-6 e TNF-α) i livelli sono determinati utilizzando disponibili in commercio enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) Kit (Quantikine murini; R & D Systems).
   2. Valori di assorbanza di ogni ELISA è normalizzata usando un test proteina Bradford rispettivi ad ogni campione e viene espresso in unità di pg / mg di proteina.

7. Rappresentante Risultati

Amministrazione del regime DSS appropriato indurre colite acuta nei topi. Durante la durata del trattamento DSS, DAI possono essere utilizzati per valutare e valutare la progressione clinica della malattia. Gli animali trattati con DSS mostrerà significativa perdita di peso rispetto al loro peso iniziale, perdita di feci e fecisanguinamento (Figura 1). Sul sacrificio e l'esame del colon, la gravità della colite è macroscopicamente punteggio sulla base di un accorciamento della lunghezza del colon, sanguinamento intestinale, sanguinamento nelle feci, perdita di consistenza delle feci, e segni di sanguinamento rettale, rispetto ai controlli trattati con sola acqua (Figura 2 e Tabella 1). Le sezioni trasversali dei campioni di tessuto del colon colorate con H & E avrà punteggi più alti istologici per DSS trattati con i due punti contro l'acqua trattata controlli (Figura 3). Per caratterizzare ulteriormente il grado di infiammazione nei topi trattati con DSS, attività MPO può essere valutata da omogeneizzato campioni di tessuto del colon. DSS trattati con i due punti che hanno una maggiore attività MPO rispetto ai controlli (Figura 4). Inoltre, questo è associato ad aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figura 5).

Figura 1. Maschio, topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS nel bere acqua per 5 giorni. DAI punteggi sono stati valutati al giorno per ogni animale e sono stati in media al giorno per ciascun gruppo (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo).

Figura 2. Topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS in acqua potabile per 5 giorni. Topi di controllo hanno ricevuto acqua senza DSS. Macroscopico danno punteggio / malattia punteggi di gravità sono stati valutati alla cieca il giorno 5 dopo DSS-indotta colite. I due punti isolati da topi che avevano ricevuto DSS hanno punteggi più elevati danni macroscopici (sanguinamento rettale, prolasso rettale, diarrea, sanguinamento del colon) che indica una maggiore gravità della malattia (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo).

Figura 3. Topi C57BL / 6 è stata data soluzione DSS 5% in acqua potabile al fine di indurre colite. Topi di controllo ricevuto acqua senza DSS. (A) i punteggi istologici sono stati ciecamente valutato con H & E sezioni colorate di tessuto del colon raccolto il 5 ° giorno post-DSS amministrazione. (B), DSS-campioni trattati mostrano più danni istologici (infiltrazione di più cellulari, più deplezione delle cellule caliciformi, maggiore distorsione / danni alla cripta architettura) rispetto a (C) controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). In (B) e (C), asterisco (*) indica un'area di deplezione delle cellule caliciformi e la distorsione di architettura cripta; cancelletto (#) indica infiltrazione cellulare.

Figura 4. Tutti i topi sono stati sacrificati il giorno 5 l'amministrazione postale di DSS e campioni di tessuto del colon sono stati raccolti per valutare l'attività MPO. La gravità della colite indotta da DSS è associata a più alti livelli di attività MPO rispetto ai controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo).

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Figura 5. Oltre ai livelli più alti MPO, la gravità della colite indotta da DSS è anche associata ad un aumento del livello di pro-infiammazione citochine come IL-1β, IL-6, TNF-α (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo).

Tabella 1. Macroscopica punteggio di gravità / Malattia

Punteggio	Sanguinamento rettale	Prolasso rettale	Sgabello Coerenza	Sangue
0	Nessuno	Nessuno	Normale	Normale
1	Rosso	I segni di prolasso	Morbido	Rosso
2	Rosso Scuro	Prolasso chiaro	Molto morbido	Rosso scuro
3	Lordo Bleeding	Prolasso ampia	Diarrea	Nero

in grado

Discussione

DSS colite è un modello ampiamente utilizzato indotto chimicamente di infiammazione intestinale. In questo modello, i topi sono fornite di acqua potabile integrato con DSS, che è pensato per essere tossico per le cellule epiteliali intestinali e danneggiare l'integrità della barriera mucosale. ¹⁰ La somministrazione di DSS induce una colite acuta, che è caratterizzata da feci molli, sanguinamento fecale, e infiltrazione con granulociti. DSS ¹⁰ Durante l'amministrazione, la colite è di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / apparecchiatura:	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Eppendorf Safe-Lock provetta (2 ml)	eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 Assorbanza lettore di piastre	Biotek	EL808
Destrano solfato di sodio per reagenti sale (peso molecolare 36,000-50,000 Da)	MP Biomedicals	160110
Gen 5 (software)	Biotek	Versione 1.10.8
Esadeciltrimetilammonio bromuro (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Perossido di idrogeno, il 30 wt.% Soluzione in acqua	Sigma-Aldrich	216763	Conservare a 2-8 ° C
Microtest plmangiava da 96 pozzetti fondo piatto	Sarstedt	82,1581	Da utilizzare una sola
o-dianisidina	Sigma-Aldrich	D-3252	Sensibile alla luce. Conservare a 2-8 ° C
Fosfato di potassio dibasico	Caledon	6620-1
Fosfato di potassio, monobasico	EMD chimici	PX1565-1
Inibitori della proteasi cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Conservare a -20 ° C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsteno perline in metallo duro per Tissue Lyser II	QUIAGEN	69997