La investigación de la inflamación intestinal inducida por DSS en el modelo de la EII

Resumen

Los modelos experimentales de enfermedad inflamatoria intestinal, nos han permitido examinar las respuestas del complejo inmune innata y adaptativa asociada con la patogénesis. El uso de puntuación histológico, la cuantificación de citoquinas pro-inflamatorias y la actividad mieloperoxidasa, se puede comenzar a evaluar las respuestas observadas en la enfermedad inflamatoria intestinal.

Resumen

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) engloba una serie de patologías intestinales, la más común de lo que son la colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (CD). UC y CD, cuando están presentes en el colon, generar un perfil similar de los síntomas que pueden incluir diarrea, sangrado rectal, dolor abdominal y pérdida de peso. ¹ Aunque la patogenia de la EII aún se desconoce, se describe como una enfermedad multifactorial que involucra tanto componentes genéticos y ambientales. ²

Existen numerosos modelos animales y variables de inflamación del colon que se asemejan a varias características de la EII. Los modelos animales de colitis rango de las que surgen de forma espontánea en cepas susceptibles de ciertas especies a las que requiere la administración de concentraciones específicas de productos químicos que inducen a la colitis, tales como el dextrano sulfato sódico (DSS). Química inducida por los modelos de la inflamación intestinal son los modelos más utilizados y mejor descrito de la EII. Adminidemostración de DSS en el agua potable produce colitis aguda o crónica, dependiendo del protocolo de administración. ³ animales que recibieron la pérdida de peso DSS exposiciones y muestras de heces sueltas o diarrea, a veces con evidencia de sangrado rectal ^4,5. A continuación, se describen los métodos por los cuales el desarrollo de la colitis y la respuesta inflamatoria resultante puede ser caracterizada tras la administración de DSS. Estos métodos incluyen el análisis histológico de hematoxilina / eosina secciones de colon teñido, la medición de citoquinas pro-inflamatorias, y la determinación de mieloperoxidasa (MPO) de actividad, que puede ser utilizado como un marcador de la inflamación ^6.

En la medida de la respuesta inflamatoria en el estado de la enfermedad puede ser evaluada por la presencia de síntomas clínicos o por la alteración de la histología en el tejido mucoso. Daño histológico del colon se evalúa mediante el uso de un sistema de puntuación que considera la pérdida de la arquitectura de las criptas, infiltración de células inflamatorias, musculares tabsceso hickening, el agotamiento de las células caliciformes, y la cripta. ⁷ cuantitativamente, los niveles de citoquinas pro-inflamatorias con propiedades inflamatorias agudas, como la interleucina (IL)-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral (TNF)-α, se puede determinar mediante los métodos convencionales de ELISA. Además, la actividad de MPO se puede medir mediante un ensayo colorimétrico y se utiliza como un índice de inflamación. ⁸

En la colitis experimental, gravedad de la enfermedad a menudo se correlaciona con un aumento en la actividad de MPO y mayores niveles de citoquinas pro-inflamatorias. La gravedad de la colitis y la inflamación asociada con el daño puede ser evaluada mediante el examen de consistencia de las heces y sangre, además de evaluar el estado histopatológico del intestino mediante hematoxilina / eosina secciones de tejido teñido de colon. Fragmentos de tejido del colon se puede utilizar para determinar la actividad de MPO y la producción de citoquinas. En conjunto, estas medidas se pueden utilizar para evaluar la respuesta inflamatoria intestinal enmodelos animales de colitis experimental.

Protocolo

1. Modelo murino de colitis inducida por DSS-aguda

1. Añadir dextrano sulfato sódico (DSS) al agua potable en autoclave para la concentración final deseada (1-5%) (p / v) (es decir, para hacer una solución de DSS al 5%, agregar 25 mg de polvo de DSS y 500 ml de agua esterilizada) . Solución madre puede dejar a temperatura ambiente por hasta una semana o menos 4 ° C hasta su uso.
2. En una campana de bioseguridad, se vierte una solución de archivo DSS en tubos de 50 ml Falcon (uno necesita por jaula). Mantenga la solución madre a los tubos de recambio cuando sea necesario.
3. Reemplazar el agua potable en cada jaula del ratón con la solución de DSS (en tubos de 50 ml Falcon) (La duración dependerá del régimen de DSS que se utiliza. Por ejemplo, con 6-8 semanas de edad C57BL masculino / 6 ratones, que administra una 5% de DSS solución para un total de cinco días). Los ratones no deben tener acceso a cualquier otra fuente de agua. Los ratones control se les da agua potable en autoclave sin DSS.
4. Pesar ratones diariamente y registrar la cantidad de DSS consumidos por día. Parte superior de cadabotella de 50 ml después de registrar los niveles DSS. Esto es para medir el volumen aproximado de DSS consumida por jaula por ratón durante toda la duración del experimento. En nuestros estudios, se utiliza una solución de DSS al 5% durante 5 días con C57BL macho / 6 ratones. Pérdida significativa de peso, consistencia de las deposiciones alteradas y los signos de sangre en heces se ven ya en el día 3 con este régimen DSS particular. Durante la administración de DSS, ratones muestran pérdida de peso pronunciada (alrededor de un 5-10% de su peso inicial en el día 5) con la pérdida de peso superior al 20% del peso inicial con la deshidratación y la diarrea como el indicador fisiológico significativo que un animal se encuentra en o cerca de punto final. Si el animal tiene acceso a agua normal después de los 5 días de DSS al 5%, se recuperan dentro de 7 días. Todos los experimentos deben ser aprobados por los animales del comité de ética de la institución y estar en conformidad con el Protocolo de utilización de animales aprobada (AUP).
5. Durante la duración del experimento, un índice de actividad de la enfermedad (DAI)puntuación puede ser evaluado para evaluar la progresión clínica de la colitis. El DAI es el resultado combinado de la pérdida de peso en comparación con el peso inicial, consistencia de las heces y hemorragia. Las puntuaciones se define de la siguiente manera: pérdida de peso: 0 (sin pérdida), 1 (1.5%), 2 (10.5%), 3 (10.20%) y 4 (> 20%), consistencia de las heces: 0 (normal), 2 (heces sueltas), y 4 (diarrea), y sangrado: 0 (sin sangre), 1 (Hemoccult positiva), 2 (Hemoccult sangrado pellet positiva y visual), y 4 (hemorragia grave, la sangre alrededor de ano). DAI se puede marcar todos los días durante la duración del tratamiento DSS.
6. En el punto en el tiempo de elección, peso y sacrificio ratones. Los ratones pueden ser sacrificados por dislocación cervical después de la inhalación de isoflurano o por otro método aprobado por el bioterio de la institución.

2. Recolectar muestras de tejido del colon

1. Exponer la parte ventral del animal y se orinan en la zona del abdomen con una solución de etanol al 70%. En este punto, consulte la Tabla 1 y tomar nota de unny signos de sangrado rectal (presencia de sangre en el orificio anal) o prolapso rectal en cada animal.
2. Utilice unas tijeras de disección estándar para incidir en el abdomen mediante una incisión media ventral.
3. Localice los dos puntos y transectos de los dos puntos lo más cerca posible del margen colorrectal como sea posible para liberar el colon distal.
4. Lentamente y con cuidado sacar todo el colon, separándolo del mesenterio rodea.
5. Transecto de los dos puntos en el margen colonocecal para liberar el extremo proximal del colon. Las heces pueden ser eliminados por lavado de colon con PBS estéril con una aguja una sonda conectada a una jeringa de 3 ml o 5, o por apretar con cuidado a cabo utilizando un par de pinzas doblado / pinzas. Utilizando todo el colon, evaluar los daños (ver Sección 3.1)
6. Muestras de tejido para su análisis histológico y otros ensayos se puede hacer mediante la reducción de 0,5 cm a 1,0 cm del colon largos fragmentos tomando nota de que el área de la muestra es de (es decir, proximal, media y distal).
7. Las muestras de tejidoque se utilizará para los ensayos pueden ser colocados individualmente en 1,5 ml tubos Eppendorf y se congeló en nitrógeno líquido y se almacenan hasta su uso a -70 ° C.

3. Evaluación de la gravedad de la colitis

1. Puntuación de gravedad de la enfermedad macroscópica o se evalúa en fase terminal por un observador imparcial con un sistema de puntuación previamente publicados (Tabla 1). ⁹ consistencia de las heces puede ser evaluado mediante el uso de un par de pinzas y presionar hacia abajo en las heces para determinar la consistencia. Para determinar la puntuación de la sangre en las heces, observe el color de las heces (materia fecal, es decir negro en comparación con las heces de color marrón claro) y validan aún más mediante una prueba de sangre oculta. Utilizando el sistema de puntuación, determinar un puntaje para cada una de las condiciones. La puntuación final macroscópicos de cada animal es la suma de cada puntuación individual.
2. Para evaluar el daño histológico de la gravedad de la colitis, cortar un pequeño fragmento (0,5 cm) de los dos puntos, coloque en un casete de los tejidos y se sumergen en una solución tampón formalina al 10%. Preparar 5micras de parafina incrustados secciones y las secciones se tiñen con hematoxilina / eoxin (H & E), utilizando los procedimientos adecuados. Fragmentos de colon se pueden tomar a partir de la próxima, a mediados de colon, o de la sección distal del colon.
3. H & E manchadas secciones de tejido del colon son calificadas por un observador ciego usando un sistema previamente publicados para las siguientes medidas: arquitectura de las criptas (normal, 0 - grave distorsión de la cripta con la pérdida de criptas todo, 3), el grado de infiltración de células inflamatorias (0 normal, - denso infiltrado inflamatorio, 3), el engrosamiento del músculo (base de la cripta se encuentra en la mucosa muscular, 0 - presentar un marcado engrosamiento del músculo, 3), el agotamiento de las células caliciformes (ausente, 0 - 1 actual,) y el absceso cripta (ausente, 0 - presente , 1). ⁷ La puntuación de daño histológico es la suma de cada puntuación individual. Cabe señalar que a diferencia de humanos de la UC, abscesos cripta no son característicos de este modelo y son raramente vistos, ulceraciones microscópicas también son raras. Si hay varias secciones del colon selas puntuaciones de colores, entre las secciones histológicas similares se deben utilizar para determinar la puntuación final para cada área (es decir, puntuación histológica en el colon proximal en comparación con puntaje histológico en el colon distal).

4. Se preparan soluciones stock de reactivos para los ensayos de

1. Prepare una solución de 50 mM de tampón fosfato de potasio mediante la adición de la solución B (K ₂ HPO _4, 8,7 g de fosfato de potasio dibásico en 1 litro de dH ₂ O) a la solución A (KH ₂ PO _4, 6,8 g de fosfato monobásico de potasio en 1 litro de dH ₂ O) hasta un pH de 6,0 se logra. Soluciones restantes se pueden almacenar en el refrigerador (2-8 ° C) hasta su uso futuro.
2. Prepare bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) mediante la adición de buffer 5 g HTAB en 1 L de tampón fosfato de potasio (50 mM, pH = 6,0). Calentar suavemente para disolver y almacenar a 2-8 ° C hasta su uso. Cuando sea necesario, el calor para volver a disolverse.
3. Prepare el buffer de lisis para la homogeneización de tejidos para análisis de proteínas porañadir 10 ml de 1 M Tris-ácido clorhídrico (pH = 8,0), 6 ml de cloruro de sodio 5M y 2 ml de Triton X-100 a 182 ml de agua destilada esterilizada. Triton X-100 es muy viscoso a temperatura ambiente y por lo tanto, se debe calentar suavemente antes de su uso. El tampón de lisis preparado puede almacenarse a -20 ° C hasta su uso.

5. Preparación de muestras para ensayos

1. Preparación de muestras para análisis de MPO.
   1. Muestras de los -70 ° C y el lugar en el hielo. Registrar el peso de cada muestra después de la eliminación de cualquier heces o la grasa visible mediante el uso de una pinza dobladas / pinza y coloque en un tubo de 2 ml Eppendorf microcentrífuga Safe-Lock (o cualquier tubo que se puede utilizar con un homogeneizador). Las muestras deben mantenerse en hielo en todo momento. Es importante tener en cuenta que los fragmentos de colon debe emplearse la misma de cada réplica biológica (es decir, las secciones secciones distal o proximal sólo solamente).
   2. Añadir homogeneizador de cuentas para cada tubo de muestra.
   3. Añadir la cantidad apropiada de buf HTABfer en función del peso del tejido. Si el peso del tejido es inferior a 25 mg, añadir el tampón en una proporción de 12.5mg/mL, si el peso del tejido es de entre 25-50, añade en una proporción de 25mg/mL. Si el peso del tejido es mayor de 50 años, añade tampón en una proporción de 50mg/ml.
   4. Homogeneizar con un homogeneizador de tejidos durante 4 min a 30 Hz. Repita si el tejido no está completamente homogeneizada.
   5. Quitar homogeneizador de cuentas y la solución se centrifuga durante 6 minutos (13.400 xg, 4 º C).
   6. Recoger el líquido sobrenadante y desechar el sedimento resultante. Sobrenadante se almacenó a -70 ° C hasta su uso.
2. Preparación de muestras para análisis de citoquinas.
   1. Repita los pasos 5.1.1. a 5.1.2.
   2. Añadir 50 l de cóctel inhibidor de la proteasa (PIC) a 10 mL de solución amortiguadora de lisis preparado.
   3. Añadir 1 ml de la PIC y una solución tampón de lisis a cada muestra independientemente del peso.
   4. Homogeneizar durante 5 min a 30 Hz. Repita si el tejido no está completamente homogeneizada.
   5. Quitar homogeneizador de cuentas y centrifugar solutidurante 5 min a 3300 x g.
   6. Recoger el líquido sobrenadante y desechar el sedimento resultante. Sobrenadante se almacenó a -70 ° C hasta su uso.

6. La cuantificación de los marcadores inflamatorios

1. Ensayo de la actividad de MPO
   1. Preparar o-dianisidina dihidrocloruro (o-dianisidina) solución mediante la combinación de 16,7 mg de o-dianisidina diclorhidrato, 90 ml de dH ₂ O, y 10 ml de tampón fosfato de potasio. Esta solución debe prepararse fresca para cada ensayo.
   2. Añadir 7 l de homogeneizado de tejido (preparado en la sección 5.1), por triplicado en una placa de 96 pocillos.
   3. Añadir 50 l de diluirse H ₂ O ₂ (4 l de 30% de H ₂ O ₂ diluido en 96 L de dH ₂ O) a la mezcla de o-dianisidina.
   4. Utilice una pipeta multicanal añadir 200 ul de la mezcla o-dianisidina contiene H ₂ O ₂ a cada uno de los pozos.
   5. Medir la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetrotometer. Tomar tres lecturas a intervalos de 30 segundos.
   6. Calcular la actividad de MPO. La actividad de MPO se mide en unidades (U) de tejido MPO / mg, donde se define una unidad de MPO como la cantidad que se necesita para degradar un mol de H ₂ O ₂ por minuto a temperatura ambiente. Teniendo en cuenta que una unidad (U) de MPO = 1 mol de H ₂ O ₂ dividido y que un mol de H ₂ O _{2 se presenta} un cambio de absorbancia de 1,13 x 10 ^-2 nm / min, las unidades de MPO en cada muestra se determina como el cambio en la absorbancia [ΔA (t _{2-t 1)]} / Δmin x (1,13 x 10 ^-2). Para obtener unidades por mg de tejido, el uso del tejido: relación de amortiguamiento. Por ejemplo, si un pañuelo de papel: relación de amortiguamiento de 50 mg / ml se utilizó, en 7 l de homogeneizado, que es de 0,35 mg de tejido. Por lo tanto, para obtener unidades por mg de tejido, se dividen las unidades de MPO por 0,35. Un ejemplo de cálculo utilizando los valores de absorbancia (nm) se incluye a continuación (suponiendo que la muestra ha sido añadido por triplicado):

Muestra	Hora 0 segundos			Tiempo de 30 seg			Tiempo de 60 seg
A	1	2	3	1 '	2 '	3 '	1 "	2''	3 "
	0.048	0.048	0.051	0.061	0.061	0.065	0.074	0.073	0.078

1. Promedio en el tiempo de 0 seg = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 nm
2. Promedio en el tiempo de 30 seg = 0,0623 nm
3. Promedio en el tiempo de 60 seg = 0,075 nm
4. Cambio en la absorbancia (ΔA) de 0 a 30 seg / mg de tejido (asumiendo que 50 mg / ml de tejido: relación de amortiguamiento) = [(0.0623 a 0.049) / (1,13 x 10 ^-2)] / 0,35 = 3.363
5. Cambio en la absorciónla línea (ΔA) de 30 a 60 seg / mg de tejido = 3,211
6. * La actividad de MPO (U / mg de tejido) = media de ΔA (0-30) y ΔA (30-60) = 3.287

2. La cuantificación de citoquinas pro-inflamatorias por ELISA
   1. Citoquinas (IL-1β, IL-6 y TNF-α) los niveles se determinan mediante disponibles en el mercado ligado a enzimas (ELISA) kit (Quantikine murino, R & D Systems).
   2. Los valores de absorción de cada uno de ELISA se normaliza mediante un ensayo de proteínas Bradford respectivos a cada muestra y se expresa en unidades de pg / mg de proteína.

7. Resultados representante

Administración del régimen de DSS apropiado inducir colitis aguda en ratones. Durante la duración del tratamiento DSS, la DAI se puede utilizar para valorar y evaluar la progresión clínica de la enfermedad. Los animales tratados con DSS mostrará la pérdida de peso significativa en comparación con su peso inicial, diarrea y hecessangrado (Figura 1). En el sacrificio y el examen del colon, la severidad de la colitis es macroscópicamente anotó sobre la base de acortamiento de la longitud del colon, sangrado de colon, hemorragia fecal, pérdida de consistencia de las heces, y hay signos de sangrado rectal en comparación con los controles tratados sólo con agua (Figura 2 y Tabla 1). Las secciones transversales de las muestras de tejido del colon teñidas con H & E tendrá una mayor puntuación histológico de DSS tratados con dos puntos en comparación con el agua tratada, los controles (Figura 3). Para caracterizar el grado de inflamación en los ratones tratados con DSS, la actividad de MPO se puede evaluar a partir de muestras de tejido homogeneizado de colon. DSS tratados con los dos puntos que tienen una mayor actividad de MPO en comparación con los controles (Figura 4). Además, esto está asociado con mayores niveles de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figura 5).

Figura 1. Hombre, ratones C57BL / 6 recibieron DSS al 5% en agua potable por 5 días. Puntuaciones de DAI fueron evaluados diariamente por cada animal y se promediaron por día para cada grupo (media ± SEM, n = 4 ratones / grupo).

Figura 2. Ratones C57BL / 6 se les dio DSS 5% en agua de bebida durante 5 días. Los ratones de control recibieron agua sin DSS. Macroscópica daños puntuación / enfermedad de las puntuaciones de gravedad fueron evaluados a ciegas en el día 5 después de la colitis inducida por DSS. Los dos puntos aislados de los ratones que recibieron DSS tienen puntuaciones mayores daños macroscópicos (sangrado rectal, prolapso rectal, diarrea, sangrado del colon) que indica una mayor gravedad de la enfermedad (media ± SEM, n = 4 ratones / grupo).

Figura 3. Ratones C57BL / 6 se les dio solución al 5% del DSS en el agua potable con el fin de inducir la colitis. Los ratones de control recibieron agua sin DSS. (A) los resultados histológicos se evaluaron a ciegas con H & E manchadas secciones de tejido del colon recogidas en el día 5 post-DSS administración. (B) DSS-muestras tratadas muestran más daño histológico (infiltración más celulares, más el agotamiento de las células caliciformes, mayor distorsión / daños a la cripta de la arquitectura) en comparación con (C) los controles (media ± SEM, n = 4 ratones / grupo). En (B) y (C), asterisco (*) indica la zona de agotamiento de las células caliciformes y la distorsión de la arquitectura de las criptas, signo de número (#) indica la infiltración celular.

Figura 4. Todos los ratones fueron sacrificados después de la administración en el día 5 de DSS y las muestras de tejido colónico fueron recogidos para evaluar la actividad de MPO. Gravedad de la colitis inducida por DSS se asocia con mayores niveles de actividad de MPO en comparación con los controles (media ± SEM, n = 4 ratones / grupo).

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Figura 5. Además del aumento de los niveles de MPO, la gravedad de la colitis inducida por DSS-también se asocia con un mayor nivel de citoquinas pro-inflamación como la IL-1β, IL-6, TNF-α (media ± SEM, n = 4 ratones / grupo).

Tabla 1. Macroscópica Puntuación / gravedad de la enfermedad

Puntuación	Sangrado rectal	El prolapso rectal	Consistencia de las heces	Sangre
0	Ninguno	Ninguno	Normal	Normal
1	Rojo	Los signos de prolapso	Suave	Rojo
2	Rojo Oscuro	Prolapso de la clara	Muy suave	De color rojo oscuro
3	Sangrado bruto	Prolapso de la extensa	Diarrea	Negro

poder

Discusión

DSS colitis es un modelo ampliamente utilizado químicamente inducida por la inflamación intestinal. En este modelo, los ratones se les da agua potable complementado con el DSS, el cual se cree que es tóxico para las células epiteliales del intestino y alterar la integridad de la barrera mucosa. ¹⁰ La administración de DSS induce una colitis aguda que se caracteriza por deposiciones sueltas, sangrado en heces, y la infiltración de granulocitos. ¹⁰ Durante la administración de DSS, colitis se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / equipo:	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Eppendorf Safe-Lock Microcentrífuga Tube (2 ml)	eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 Absorbancia lector de placas	Biotek	EL808
Dextrano sulfato de sodio sal de grado reactivo (peso molecular Da 36,000-50,000)	MP Biomedicals	160110
Gen5 (software)	Biotek	La versión 1.10.8
Hexadeciltrimetilamonio bromuro (HTAB)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
El peróxido de hidrógeno, 30 wt.% En agua	Sigma-Aldrich	216763	Almacenar a 2-8 ° C
Microtest plcomió de 96 pocillos de fondo plano	Sarstedt	82.1581	Para un solo uso
o-dianisidina	Sigma-Aldrich	D-3252	Sensible a la luz. Almacenar a 2-8 ° C
Fosfato de potasio dibásico	La Calera	6620-1
Fosfato de potasio, monobásico	EMD Chemicals	PX1565-1
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma-Aldrich	P8340	Almacenar a -20 ° C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
El carburo de tungsteno para el tejido de cuentas Lyser II	Quiagen	69997