Enquêter inflammation intestinale induite par DSS modèle des MICI

Résumé

Des modèles expérimentaux de maladies inflammatoires de l'intestin nous ont permis d'examiner le complexe innée et adaptative des réponses immunitaires associées à la pathogenèse. Utiliser score histologique, la quantification des cytokines pro-inflammatoires et de l'activité myéloperoxydase, on peut commencer à évaluer ces réponses observée dans la maladie intestinale inflammatoire.

Résumé

Les maladies intestinales inflammatoires (MII) englobe un éventail de pathologies intestinales, la plus commune qui sont la colite ulcéreuse (CU) et maladie de Crohn (CD). Les deux communications unifiées et de CD, lorsqu'elles sont présentes dans le côlon, de générer un profil de symptômes similaires qui peuvent inclure la diarrhée, des saignements rectaux, des douleurs abdominales et la perte de poids. ¹ Bien que la pathogénie des MICI reste inconnue, elle est décrite comme une maladie multifactorielle qui implique à la fois composantes génétiques et environnementales. ²

Il ya de nombreux modèles animaux et les variables de l'inflammation du côlon qui ressemblent à plusieurs caractéristiques des MICI. Les modèles animaux de la plage de la colite de ceux qui naît spontanément dans les souches sensibles de certaines espèces à ceux nécessitant l'administration de concentrations spécifiques de colite induisant des produits chimiques, tels que le dextran sulfate de sodium (DSS). Chimique induite par les modèles d'inflammation intestinale sont les modèles les plus couramment utilisés et mieux décrit des MICI. Adminidémonstration de DSS dans l'eau potable produit une colite aiguë ou chronique, selon le protocole d'administration. ³ animaux ayant reçu du SSD présentent une perte de poids et les signes de selles molles ou diarrhée, parfois avec des preuves de saignement rectal ^4,5. Ici, nous décrivons les méthodes par lesquelles développement de la colite et la réponse inflammatoire résultant peut être caractérisée après l'administration de DSS. Ces méthodes comprennent l'analyse histologique de l'hématoxyline / éosine sections du côlon tachés, la mesure des cytokines pro-inflammatoires, et la détermination de la myéloperoxydase (MPO), qui peut être utilisé comme un marqueur de l'inflammation. ⁶

L'ampleur de la réponse inflammatoire dans la maladie de l'Etat peut être évaluée par la présence de symptômes cliniques ou par l'altération de l'histologie dans le tissu muqueux. Côlon dommages histologiques est évaluée en utilisant un système de notation qui prend en compte la perte de l'architecture crypte, l'infiltration de cellules inflammatoires, des muscles tAbcès hickening, la déplétion des cellules caliciformes, et la crypte. ⁷ Quantitativement, les niveaux de cytokines pro-inflammatoires aiguës avec des propriétés inflammatoires, telles que l'interleukine (IL)-1β, IL-6 et le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, peut être déterminée à l'aide les méthodes classiques ELISA. En outre, l'activité MPO peut être mesurée en utilisant un dosage colorimétrique et utilisé comme un indice d'inflammation. ⁸

Dans la colite expérimentale, sévérité de la maladie est souvent corrélée avec une augmentation de l'activité MPO et des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires. Gravité de la colite et l'inflammation associées aux dommages peuvent être évalués en examinant la consistance des selles et des saignements, en plus d'évaluer l'état histopathologique de l'intestin à l'aide d'hématoxyline / éosine sections colorées des tissus du côlon. Fragments de tissus du côlon peut être utilisé pour déterminer l'activité de MPO et de la production de cytokines. Pris ensemble, ces mesures peuvent être utilisées pour évaluer la réponse inflammatoire dans l'intestindes modèles animaux de colite expérimentale.

Protocole

1. Modèle murin de colite induite par le DSS-aiguë

1. Ajouter dextran sulfate de sodium (DSS) à l'eau potable autoclave à la concentration finale désirée (1-5%) (p / v) (c'est à dire faire une solution SSD de 5%, ajouter 25 mg de poudre de DSS à 500 mL d'eau à l'autoclave) . Solution mère peut être laissé à température ambiante pendant jusqu'à une semaine ou à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Dans une hotte de biosécurité, verser la solution SSD stock dans des tubes de 50 ml Falcon (un nécessaire par cage). Gardez la solution stock de tubes de remplissage en cas de besoin.
3. Remplacer l'eau potable dans chaque cage souris avec la solution SSD (dans les tubes Falcon de 50 ml) (La durée dépendra du régime de DSS qui est utilisé. Par exemple, en utilisant 6-8 semaines C57BL âgé / 6 souris, nous administrons une solution de DSS 5% pour un total de cinq jours). Souris ne devraient pas avoir accès à toute autre source d'eau. Les souris témoins sont donnés en eau potable autoclave sans DSS.
4. Peser les souris quotidiennement et inscrire le montant du DSS consommées par jour. Garnir chaqueBouteille de 50 mL après l'enregistrement des niveaux DSS. Cela permet de mesurer le volume approximatif de DSS consommée par cage par souris pendant toute la durée de l'expérience. Dans nos études, nous utilisons une solution SSD de 5% pendant 5 jours avec C57BL mâle / 6 souris. Perte de poids significative, la consistance des selles modifiées et les signes de sang dans les selles sont vus dès le jour 3 en utilisant ce protocole DSS particulier. Pendant l'administration du MAS, les souris présentent une perte de poids marquée (environ 5-10% de leur poids initial au jour 5) avec une perte de poids supérieure à 20% du poids initial à la déshydratation et la diarrhée à l'indicateur physiologique important qu'un animal est atteint ou à proximité de terminaux. Si l'animal est donné accès à l'eau normale au bout de 5 jours de DSS 5%, il va récupérer dans les 7 jours. Toutes les expériences doivent être approuvés par les animaux de l'institution du comité d'éthique et d'être en conformité avec le Protocole de l'utilisation des animaux approuvés (AUP).
5. Pendant la durée de l'expérience, un indice activité de la maladie (DAI)score peut être évaluée afin d'évaluer la progression clinique de la colite. Le DAI est le score combiné de la perte de poids par rapport au poids initial, la consistance des selles, et des saignements. Les scores sont définis comme suit: perte de poids: 0 (aucune perte), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), et 4 (> 20%); consistance des selles: 0 (normal), 2 (selles molles), et 4 (diarrhée), et saignements: 0 (pas de sang), 1 (Hémoccult positif), 2 (Hémoccult positif saignements et visuelle de granulés), et 4 (saignement grave, du sang autour l'anus). DAI peut être marqué par jour pendant la durée du traitement DSS.
6. Au point le temps de choisir, de peser et de sacrifice des souris. Les souris peuvent être euthanasiés par dislocation cervicale après inhalation d'isoflurane ou par une autre méthode approuvée par l'animalerie de l'institution.

2. Recueillir des échantillons de tissus du côlon

1. Exposez la face ventrale de l'animal et humide de la région de l'abdomen avec une solution d'éthanol à 70%. À ce point, se reporter au tableau 1 et prendre note d'unny signes d'hémorragie rectale (sang présent dans l'orifice anal) ou prolapsus rectal dans chaque animal.
2. Utilisez des ciseaux à disséquer standards pour inciser l'abdomen par une incision médiane ventrale.
3. Localisez le colon et le colon transect aussi près de la marge colorectal que possible afin de libérer le côlon distal.
4. Soigneusement et tirez lentement tout le côlon, le détachant du mésentère environnant.
5. Transect du côlon à la marge colonocecal pour libérer l'extrémité proximale du côlon. Les matières fécales peuvent être enlevés par un rinçage avec du PBS stérile du côlon en utilisant une aiguille de gavage attachée à une seringue de 3 ou 5 ml ou par attentivement le serrant à l'aide d'une pincette plié / forceps. Utiliser tout le côlon, d'évaluer les dommages (voir section 3.1)
6. Prélèvement de tissus pour analyse histologique et autres dosages peuvent être effectués par découpe de 0,5 cm à 1,0 cm de long fragments coliques faire acte de quelle région de l'échantillon est de (ie proximale, moyenne ou distale).
7. Des échantillons de tissusà être utilisé pour les dosages peuvent être placés individuellement dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL et congelés dans l'azote liquide et stockés jusqu'à utilisation à -70 ° C.

3. Évaluation de la gravité de la colite

1. Score de sévérité ou de la maladie macroscopique est évaluée en phase terminale par un observateur impartial en utilisant un système de notation précédemment publiées (tableau 1). ⁹ consistance des selles peut être évaluée en utilisant une paire de pinces et en appuyant sur ​​les selles afin de déterminer la cohérence. Afin de déterminer un score de sang dans les selles, noter la couleur des fèces (selles noires par rapport à savoir marron clair selles) et valider encore davantage l'aide d'un test Hémoccult ®. Utilisation du système de notation, de déterminer un score pour chacune des conditions. Le score final macroscopique pour chaque animal est la somme de chaque score individuel.
2. Pour évaluer les dommages histologiques de gravité colite, couper un petit fragment (0,5 cm) du côlon, le placer dans une cassette de tissu et de plonger dans une solution tamponnée de formol à 10%. Préparer 5paraffine um intégré des sections et des sections tache avec hématoxyline / eoxin (H & E) en utilisant les procédures appropriées. Colon fragments peuvent être prises à partir de la proximale, mi-colon, ou de la section distale du côlon.
3. H & E sections colorées tissu colique sont marqués par un observateur impartial à l'aide d'un système déjà publiés pour les mesures suivantes: architecture crypt (normal, 0 - distorsion crypte sévère avec perte de cryptes entier, 3), le degré d'infiltration de cellules inflammatoires (normal, 0 - inflammatoires infiltrat dense, 3), l'épaississement du muscle (base de la crypte se trouve sur la musculaire muqueuse, 0 - marquée présente épaississement du muscle, 3), l'épuisement des cellules caliciformes (absent, 0 - Actuellement, 1) et abcès crypt (absent, 0 - présents , 1). ⁷ Le score dommages histologiques est la somme de chaque score individuel. Il est à noter que, contrairement humaine UC, abcès cryptiques ne sont pas caractéristiques de ce modèle et sont rarement vus; ulcérations microscopiques sont également rares. Si certaines sections du côlon sont multiplestachés, les scores histologiques entre les sections similaires doivent être utilisés pour déterminer le score final pour chaque domaine (c'est à dire au score histologique du côlon proximal par rapport au score histologique du côlon distal).

4. Préparer des solutions étalons de réactifs pour les tests

1. Préparer une solution 50 mM de tampon phosphate de potassium en ajoutant la solution B (K ₂ HPO _4, 8,7 g de phosphate de potassium dibasique dans 1 L d'dH ₂ O) à la solution A (KH ₂ PO _4, 6,8 g de phosphate de potassium monobasique dans 1L de DH ₂ O) jusqu'à un pH de 6,0 est atteint. Solutions restantes peuvent être stockés dans un réfrigérateur (2-8 ° C) jusqu'à utilisation future.
2. Préparer le bromure d'hexadécyl (CCFH) tampons en ajoutant 5 g HTAB dans 1 L d'tampon phosphate de potassium (50 mM, pH = 6,0). Chauffer doucement pour dissoudre et conserver à 2-8 ° C jusqu'à utilisation. Lorsque requis, la chaleur de re-dissoudre.
3. Préparer un tampon de lyse pour l'homogénéisation de tissu pour analyse des protéines parajouter 10 ml de tris-1M d'acide chlorhydrique (pH = 8,0), 6 ml de chlorure de sodium 5M et 2 ml de Triton X-100 à 182 ml d'eau distillée stérilisée. Triton X-100 est très visqueux à température ambiante et donc, devrait être légèrement chauffé avant utilisation. Le tampon de lyse préparé peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.

5. La préparation des échantillons pour des analyses

1. La préparation des échantillons pour l'analyse de MPO.
   1. Retirer les échantillons de -70 ° C et placer sur la glace. Noter le poids de chaque échantillon après avoir enlevé les excréments visibles ou de la graisse en utilisant un pince plié / pince à épiler et le placer dans un tube Eppendorf 2 ml microtubes Safe-Lock (ou n'importe quel tube qui peut être utilisé avec un homogénéiseur). Les échantillons doivent être conservés sur la glace en tout temps. Il est important de noter que des fragments du côlon similaire devrait être utilisé à partir de chaque répétition biologique (ie sections sections distale ou proximale seule uniquement).
   2. Ajouter homogénéisateur talon à chaque tube échantillon.
   3. Ajouter la quantité appropriée de buf HTABFer en fonction du poids du tissu. Si le poids du tissu est inférieure à 25 mg, ajouter le tampon à un ratio de 12.5mg/mL; si le poids du tissu est entre 25-50, ajoutez à un ratio de 25mg/ml. Si le poids du tissu est supérieur à 50, ajouter un tampon à un ratio de 50mg/ml.
   4. Homogénéiser avec un homogénéiseur de tissus pour 4 min à 30 Hz. Répétez l'opération si le tissu n'est pas totalement homogène.
   5. Retirer homogénéisateur perles et la solution par centrifugation pendant 6 min (13400 xg, 4 ° C).
   6. Recueillir le surnageant et jeter le culot résultant. Surnageant peut être conservé à -70 ° C jusqu'à utilisation.
2. La préparation des échantillons pour l'analyse des cytokines.
   1. Répétez les étapes 5.1.1. à 5.1.2.
   2. Ajouter 50 ul de cocktail inhibiteur de protéase (PIC) à 10 ml de tampon de lyse préparé.
   3. Ajouter 1 mL de la PIC et de solution tampon de lyse à chaque échantillon, indépendamment du poids.
   4. Homogénéiser pendant 5 min à 30 Hz. Répétez l'opération si le tissu n'est pas totalement homogène.
   5. Retirer homogénéisateur perles et centrifuger solutipendant 5 min à 3300 x g.
   6. Recueillir le surnageant et jeter le culot résultant. Surnageant peut être conservé à -70 ° C jusqu'à utilisation.

6. La quantification des marqueurs inflammatoires

1. Dosage de l'activité MPO
   1. Préparer o-dianisidine dichlorhydrate (o-dianisidine) solution en combinant 16,7 mg de dichlorhydrate d'o-dianisidine, 90 ml de dH ₂ O et 10 ml de tampon phosphate de potassium. Cette solution doit être préparé pour chaque dosage.
   2. Ajouter 7 uL d'homogénat tissulaire (préparé dans la section 5.1), en trois exemplaires dans une plaque de 96 puits.
   3. Ajouter 50 uL de dilution H ₂ O ₂ (4 ul de 30% de H ₂ O ₂ dilué dans 96 uL de DH ₂ O) pour le mélange d'o-dianisidine.
   4. Utiliser une pipette multi-canaux à ajouter 200 ul du mélange d'o-dianisidine contenant H ₂ O ₂ à chacun des puits.
   5. Mesurer l'absorbance à 450 nm en utilisant une spectrophotométrieTometer. Prenez trois lectures à des intervalles de 30 secondes.
   6. Calculer l'activité MPO. Activité MPO est mesuré en unités (U) de MPO / mg de tissus, où une unité de MPO est définie comme le montant nécessaire pour dégrader une mol de H ₂ O ₂ par minute à température ambiante. Considérant que d'une unité (U) de MPO = 1 mol de H ₂ O ₂ divisé et que 1 mol de H ₂ O ₂ donne un changement d'absorbance de 1,13 x 10 ^-2 nm / min, les unités de MPO dans chaque échantillon est déterminé que le changement de l'absorbance [Aa (t _{2-t 1)]} / Δmin x (1,13 x 10 ^-2). Pour obtenir unités par mg de tissu, utilisez le tissu: ratio de la mémoire tampon. Par exemple, si un tissu: ratio de tampon de 50 mg / mL a été utilisé, dans 7 uL d'homogénat, il est de 0,35 mg de tissu. Par conséquent, pour obtenir unités par mg de tissu, la division des parts de MPO par 0,35. Un exemple de calcul utilisant des valeurs d'absorbance (nm) est inclus ci-dessous (en supposant que l'échantillon a été ajoutée en triple exemplaire):

Exemple	Temps 0 sec			Durée 30 sec			Durée 60 sec
Une	1	2	3	1 '	2 '	3 '	1 "	2''	3 "
	0,048	0,048	0,051	0,061	0,061	0,065	0,074	0,073	0,078

1. Moyenne au temps 0 sec = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm
2. Moyen au moment 30 sec = 0,0623 nm
3. Moyen au moment 60 sec = 0,075 nm
4. Changement d'absorbance (Aa) de 0 à 30 sec / mg de tissu (en supposant que 50 mg / mL de tissu: ratio de tampon) = [(de 0,0623 à 0,049) / (1,13 x 10 ^-2)] / 0.35 = 3.363
5. Changement d'absorberment (Aa) de 30 à 60 sec / mg de tissu = 3,211
6. * Activité MPO (U / mg de tissu) = moyenne de Aa (0-30) et Aa (30-60) = 3,287

2. Quantification des cytokines pro-inflammatoires par ELISA
   1. Cytokines (IL-1β, IL-6 et TNF-α) niveaux sont déterminés en utilisant commercialement disponibles enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Quantikine murin; R & D Systems).
   2. Les valeurs d'absorbance de chaque test ELISA est normalisé en utilisant un dosage de protéines Bradford respectifs pour chaque échantillon et est exprimée en unités de pg / mg de protéine.

7. Les résultats représentatifs

L'administration de la posologie appropriée DSS va induire une colite aiguë chez la souris. Pendant la durée du traitement DSS, DAI peut être utilisé pour analyser et évaluer la progression clinique de la maladie. Les animaux traités avec le MAS va montrer la perte de poids significative par rapport à leur poids initial, des selles molles et fécalesaignement (figure 1). Après le sacrifice et l'examen du côlon, de la gravité de la colite est macroscopiquement marqué repose sur le raccourcissement de la longueur du côlon, des saignements du côlon, des saignements fécale, relâchement de la consistance des selles, et des signes d'hémorragie rectale par rapport aux témoins traités avec de l'eau seulement (Figure 2 et Tableau 1). Des coupes transversales d'échantillons de tissus du côlon colorés avec H & E aura des scores plus élevés histologiques pour DSS-traitée deux points par rapport à l'eau traitée contrôles (figure 3). Pour caractériser davantage le degré d'inflammation dans le DSS-souris traitées, l'activité MPO peut être évaluée à partir des échantillons de tissu homogénéisé côlon. DSS-traité deux points auront une plus grande activité MPO par rapport aux témoins (figure 4). De plus, cela est associé à des niveaux accrus de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) (figure 5).

La figure 1. Male, des souris C57BL / 6 ont été donnés DSS 5% dans l'eau potable pendant 5 jours. DAI scores ont été évalués quotidiennement pour chaque animal et ont été en moyenne par jour pour chaque groupe (moyenne ± SEM, n = 4 souris / groupe).

Figure 2. Souris C57BL / 6 ont été donnés DSS 5% dans de l'eau potable pendant 5 jours. Les souris témoins ont reçu de l'eau sans SSD. Macroscopique des scores de gravité des dommages score / maladie ont été évalués à l'aveuglette au jour 5 après le DSS-colite induite. Colons isolés de souris qui ont reçu SSD ont des scores plus élevés des dommages macroscopiques (saignement rectal, un prolapsus rectal, diarrhée, saignements du côlon) indiquant une plus grande sévérité des maladies (moyenne ± SEM, n = 4 souris / groupe).

Figure 3. C57BL / 6 ont reçu une solution SSD de 5% dans de l'eau potable afin d'induire la colite. Les souris témoins a reçu de l'eau sans SSD. (A) des scores histologiques ont été aveuglément classé par H & E sections colorées tissu colique recueillies au jour 5 après-DSS administration. (B) DSS-échantillons traités montrent plus de dommages histologiques (infiltration plus cellulaires, plus la déplétion des cellules caliciformes, une plus grande distorsion / dommages à la crypte architecture) par rapport à (C) contrôle (moyenne ± SEM, n = 4 souris / groupe). En (B) et (C), astérisque (*) indique la zone de déplétion des cellules caliciformes et la distorsion de l'architecture crypte; signe dièse (#) indique une infiltration cellulaire.

Figure 4. Toutes les souris ont été sacrifiées sur l'administration après le jour 5 de la DSS et des échantillons de tissus du côlon ont été recueillies afin d'évaluer l'activité MPO. Gravité de la DSS colite induite est associée à des niveaux plus élevés d'activité de la MPO par rapport aux témoins (moyenne ± SEM, n = 4 souris / groupe).

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Figure 5. En plus des niveaux plus élevés MPO, la gravité de la DSS-colite induite est également associée à une augmentation du niveau de pro-inflammatoires des cytokines comme l'IL-1β, IL-6, TNF-α (moyenne ± SEM, n = 4 souris / groupe).

Tableau 1. Macroscopique Severity Score / Maladie

Score	Saignement rectal	Un prolapsus rectal	Consistance des selles	Sang
0	Aucun	Aucun	Normale	Normale
1	Rouge	Les signes d'un prolapsus	Doux	Rouge
2	Rouge foncé	Effacer un prolapsus	Très Souple	Rouge foncé
3	Saignement brut	Prolapsus vaste	La diarrhée	Noire

pouvoir

Discussion

DSS colite est un modèle largement utilisé chimiquement induite de l'inflammation intestinale. Dans ce modèle, les souris sont donnés en eau potable complétée par le MAS, qui est pensé pour être toxiques pour les cellules épithéliales intestinales et perturber l'intégrité de la barrière muqueuse. Administration du ¹⁰ DSS induit une colite aiguë qui se caractérise par des selles molles, des saignements fécale, et l'infiltration avec des granulocytes. ¹⁰ Pendant DSS admini...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / équipements:	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube Eppendorf Safe-Lock Microcentrifugeuse (2 ml)	Eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 lecteur de plaque d'absorbance	Biotek	EL808
Dextran sulfate de sodium du sel de qualité réactif (poids moléculaire 36,000-50,000 Da)	MP Biomédical	160110
Gen5 (logiciel)	Biotek	Version 1.10.8
Bromure de Hexadecyltrimethylammonium (CCFH)	Sigma-Aldrich	H5882-100G
Le peroxyde d'hydrogène, 30 wt.% Solution dans l'eau	Sigma-Aldrich	216763	Conserver à 2-8 ° C
Microtest plmangeaient de 96 puits à fond plat	Sarstedt	82.1581	A usage unique
o-dianisidine	Sigma-Aldrich	D-3252	Sensible à la lumière. Conserver à 2-8 ° C
Phosphate de potassium, dibasique	Caledon	6620-1
Phosphate de potassium, monobasique	EMD Chemicals	PX1565-1
Cocktail d'inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	P8340	Conserver à -20 ° C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tungstène carbure perles pour les tissus Lyser II	QUIAGEN	69997