Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Özet

Bu çalışma, bir gelişmesi açıklar In vitro elektroporasyon tekniği.

Özet

Eşkenar dudak nöral tüp ve dördüncü ventrikül ⁽¹ Yorumlar) ile roofplate arasındaki kavşakta arka beyin bulunan bir embriyonik neuroepithelium olduğunu. Eşkenar dudak rhombomere 1 (R1) kapsar ve beyincik nöronlar ve çeşitli nöronal beyin soy ^2-4 sebebiyet veren alt eşkenar dudak (LRL) oluşturduğu eşkenar üst dudak (URL) bölünmüştür edilebilir. LRL türevleri işitsel koklear çekirdeklerin nöronlar ve denge ve motor kontrol ^5-8 düzenleyen katılan precerebellar çekirdeklerin olanları içerir. LRL gelen nörogenez embriyonik gün (E) 9,5-16,5 ^{5, 9} kapsayan geniş bir zamansal pencere içinde oluşur. Farklı nöronal soy bu nörojenik penceresi sırasında farklı gelişimsel gün boyunca postmitotik hücreleri (veya doğar) gibi LRL çıkarlar.

Gen ifadesi yapıları elektroporasyon için kullanılabilirLRL ataları gen ekspresyonu işlemek ve potansiyel olarak bu bölgede ^10-12 üretilen nöronların kaderini değiştirebilirsiniz. Utero elektroporasyon yılında aracılığıyla fare LRL progenitörlerin değiştirilmesi gen ekspresyonu embriyonik gün E12.5 veya daha sonra ^{10, 12-14} doğumlu soy işlenmesi için oldukça başarılı olmuştur. Utero electroporations yılında öncesinde E12.5 öncelikle nedeniyle başarısız olmuştur ölümcül dördüncü ventrikül roofplate, LRL içine electroporated olan eksojen DNA sağlanmasında gerekli bir adım delinme ile ilişkilidir. Ancak, birçok LRL edilen soyların önceki E12.5 ^9'dan LRL kaynaklanmaktadır. Bunlar daha önce doğan soy lateral retiküler oluşturan nöronlar, dış cuneate ve beyincik ⁵ omurilik ve korteks girişleri bağlamak için işlev precerebellar sisteminin alt olivary çekirdekleri içerir. LRL ifade işlemek amacıylaE12.5 daha genç embriyo, bu embriyosu elektroporasyon takiben kültürü içine yerleştirilmiş olduğu bir in vitro sistemi geliştirilmiştir.

Bu çalışma E11.5 az LRL progenitörlerin gen ifadesini değiştirmek için etkin ve verimli bir yöntem sunar. Genel olarak aktif CAG organizatörü sürüldü yeşil floresan protein (GFP) ile electroporated embriyolar tekrarlanabilir kültür 24 saat sonra GFP dile getirdi. Bu testin kritik bir yönü olduğunu gen ekspresyonu çünkü sadece eksojen geninin ifade değil, çünkü ikincil etkiler değiştirilmiş olmasıdır elektroporasyon ve kültür teknikleri sonucu bu. Bu endojen gen ekspresyonu electroporated ve kültürlü embriyolarda bozulmadan kalır olduğu tespit edilmiştir. Bu test için aşırı plazmidlerin tanıtım yoluyla E12.5 daha genç embriyoların LRL çıkan hücrelerin kaderini değiştirebilir veya (RNAi yoluyla) yıkmak için kullanılabilecek farklı pro-nöral transkripsiyon faktörleri.

Protokol

1. Elektroporasyon öncesinde hazırlıklar

1. Bir maxi hazırlık (Prime-It or Qiagen) tarafından elektroporasyon için DNA Amplify. DNA konsantrasyonu etkin alımı için 1 mg / mL 'lik bir az olmalıdır.
2. Bir mikrosantrifüj tüp içinde 1 X PBS (fosfat tamponlu tuz)% 0.01 'Fast Green 5 ul DNA ve karışımı 495 uL çıkarın.

2. Embriyonik Hasat

1. CD-1 fareleri (Harlan) ile zamanlanmış çiftleşmelerin oluşturulması. Vajinal fişler varlığı için kontrol edin ve vajinal fiş embriyonik gün (E) 0.5 olarak tespit edildiği tarihten görüyoruz. Embriyolar 11 gün fişi (E11.5) görselleştirmek sonra hasat edilir.
2. % 70 etanol içinde sterilize araçları yerleştirin. Kullanmadan önce en az bir saat için UV ışığı ile laminar akım kaput davranın. Sprayhood, diseksiyon tepsi, ve% 70 etanol ile kapsamı diseksiyon. 37 Öncesi ısı 1 X PBS ° C
3. E11.5 On Enstitüsü tarafından onaylanmış koşullarına göre kadın euthanizeHayvan Bakımı ve Kullanımı (ICCUA) için ional Komitesi. Laminer akış kaputu diseksiyon tepsiye yerleştirin. % 70 etanol ile kadın karın aşağı püskürtün.
4. Periton boşluğuna açın ve diseksiyon tepsiye duvarlara takılmalıdır. Bu periton boşluğu içinde duracak şekilde laparotomi çekin.
5. Dikkatle uterin horn duvarı açın kesti. Hafifçe uzak plasenta yolk kesesi içinde embriyonun kaldırmak için bir 20 mm kaşık (Güzel Bilimsel Araçları) kullanın. 100 mm doku kültürü kabına Yeri embriyolar 2.2 ön ısıtmaya edildi steril 1 X PBS 10 mL doldurulmuş.
6. Mevcut tüm embriyolar için tekrarlayın.

3. E11.5 Embryolarının Elektroporasyon (Şekil 1)

1. Bir 20 mm kaşık kullanılarak, 37 ısıtılmış edildi steril 1XPBS 10 mL ile doldurulmuş yeni bir 100 mm çanağı ° C'ye kadar birinci embriyo transferi
2. Dikkatli bir şekilde tekrar bir 0.05 x 0.02 mm uç (Güzel Bilimsel Araçları) ile 11 cm forseps kullanmataşımak ve yolk kesesi atın.
3. Pozisyon embriyo yüzden onun sırt tarafında Şekil 1A karikatür benzer şekilde yukarı baktığından emin. Yavaşça embriyo için 7 mm elektrot kürekler (Harvard Apparatus) kullanın. Elektrotlar ardbeyin dördüncü ventrikül seviyesinde sinir tüpün her iki tarafında konumlandırılmış edilmelidir. Ventrikül çıplak gözle ancak bir diseksiyon mikroskobu kullanarak doğru kürek yerleştirme kolaylaştırabilir. Pedallarının Konumlandırma electroporated DNA aldığı bölgenin belirlenmesi için çok önemlidir. Dorsal embriyonik ardbeyin alt eşkenar dudak (LRL) isteniyorsa, kürek doğrudan dördüncü ventrikül açıklığı olan en geniş kısmını taarruzcu olduğu gibi yer olmalıdır.
4. % 0.01 Fast Green ile karıştırılır plazmid DNA hazırlamak için 1 cc şırınga kullanın. Karışım 500 uL, en azından 8-10 embriyosu (3,5 bakınız) elektroporasyon için yeterli olmalıdır.
5. Yavaşça ponksiyon roofplate ov1 cc enjektöre bağlanmış 25G 5/8 tüberkülin iğnesi ile dördüncü ventriküle erlying ve ventrikül içine DNA-boya karışımı enjekte edilir. Başarılı enjeksiyonlar tamamını ventriküler sistemi (Şekil 1C) dolum DNA-boya karışımı ile karakterize edilir. Tipik olarak enjekte DNA-boya karışımının miktarı en az 50 uL olup. Karışımın bir kısmı embriyonun çevresindeki PBS içine ventrikül taþmasýna eğilimi kesin miktarda embriyoları arasında değişkendir. DNA-boya karışımı teslim alternatif demektir Ortabeyin örten zar delinmesiyle ventriküler sisteme erişen yoluyla olacaktır. Yine, başarılı bir enjeksiyon tamamını ventriküler sistemi dolum DNA-boya karışımı ile karakterize edilir.
6. Elektrikli bir darbe jeneratörü (BTX) ve 7 mm elektrot kürekler kullanarak beş kare bakliyat sunun. Her darbe, her darbe arasında 500 ms puls başına 50 V ömürlü 5 ms. Pozitif yüklü elektrot en yakın doku tak sonra olacakplazmid kadar e.

4. Embriyolar Kültür

1. Bir laminar akış davlumbaz olarak,% 10 fetal bovin serumu,% 5 equine serumu,% 1 glutamin,% 1 penisilin / streptomisin ısıtılmış edildi ile desteklenmiş DMEM/F12 ortam 2 ml ile 12 bölümlü kültür çanağı dış kuyu dolgu 37 ° C Kültür koşullarında de Diego ve arkadaşları uyarlandı. ¹⁵
2. Forseps ile midsection (kalp aşağıda) laminer akış kaput tutam embriyo ve embriyonun arka kısmını kaldırın. 12 oyuklu kültür kabının doldurulması kuyuları birine ön kısmına yerleştirin.
3. Tüm embriyolar için tekrarlayın. Kültürlerin kirlenmesini önlemek için 12-iyi plaka sadece dış kuyuları doldurun.
4. _% 5 CO2 içeren bir inkübatör 37 ° C de kültüre embriyosu. Electroporated ekspresyon plazmidi 24 saat içinde gözlemlenebilir edilmelidir.
5. Artık kültür kez istenen olmalı, 2 mL ile yeni bir 12 de plaka Kuyulardan doldurunOrtam 4,1 kullanılır. Steril bir kaşık ile yeni plaka bir kuyuya embryo transfer. 37 ° C inkübatör içine geri yerleştirin. 48 saat için Kültür mümkündür.
6. İstenen kültür zamanı geldiğinde, (bkz. aşağıda) analizi için embriyo düzeltin.

5.. Analiz için Embriyolar hazırlanması

1. Beş dakika süreyle 4 ° C 'de 1 X PBS içinde embriyo çalkalayın. Tekrarlayın.
2. 4 ° C'de 2 saat süreyle 1XPBS içinde% 2 paraformaldehit analiz (PFA) sabitlemek için embriyosu
3. Beş dakika süreyle 4 ° C 'de 1 X PBS içinde embriyo çalkalayın. Tekrarlayın.
4. 4 gece 1 X PBS içinde% 30 sükroz embriyoların dengeye ° C
5. Bir kuru buz / etanol banyosu kullanılarak Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik embriyoların Embed. Embriyolar -20 ° C'de saklanabilir
6. 30 mikron bölüme kriyostat (Leica) ve (VWR, SuperFrost Plus) kızaklar üzerinde monte bölümü embriyoların. -20 ° C de saklayınız

6. İmmünoreaktifnohistochemistry Analizi

1. ¹⁶ içinde açıklandığı gibi İmmünohistokimya yapıldı. Fare α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100;; tavşan α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; tavşan α-Ptf1a (Jane Johnson bu çalışma için kullanılan primer antikor dilüsyonları tavşan α-GFP (Invitrogen) 1:2500 dahil ) 1:2500; tavşan Math1 (Jane Johnson) 1:100. 4 ° C'da bir boyama tepsi üzerinde slayt düz, örnek tarafı yukarı inkübe edin.
2. Slaytlar bir bileşik mikroskobu (Olympus BX51) üzerinde analiz edildi.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1A şematik elektroporasyon deneyi anlatıyor. Şekil 1B manipülasyon önce bir E11.5 embriyonun sagittal bir görünümdür. % 0.01 Fast Green plazmid içeren CAG :: GFP enjeksiyonu takiben aynı embriyo Şekil 1C ve tek taraflı GFP sergileyen bir temsilci sabitlenmemiş embriyo gösterilirdorsal ardbeyin 24 saat kültüre aşağıdaki ifade Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Başarıyla electroporated edilir LRL alanının ölçüde değişkenlik göstermektedir ve bu elektrot konumlandırma çok bağımlı olarak görünmektedir. Bizim çalışmalarda electroporated embriyoların 65 (% 80) 52 dışında başarıyla GFP ifade bulunmuştur. Doku bu tespit ve immünohistokimyasal analizi (bkz. aşağıda) sonra çeşitli bölümler üzerinde lokalize bölgelerde GFP pozitif ise başarıyla electroporated olarak kabul edildi. Bu kriterlere uymayan Embriyolar elektroporasyon de başarısız girişimler olarak skorlandı.

Elektroporasyon verimliliği daha fazla incelenmesine dördüncü ventrikül düzeyinde electroporated embriyoların enine kesitlerinde GFP karşı immünohistokimya yapılarak tespit edilebilir. Şekil 2 tek taraflı gösteren bir embriyodan temsilcisi seri bölümleri gösterirGFP. Şekil 2A embriyonun sol tarafına pozitif elektrot doğru olduğunu gösteren bir idealize şematik gösterir. Enine bölümleri (Şekil 2A, orta çizgi ile gösterilen seviyelerde) arka beyin doku (Şekil 2C ve 2B) sol tarafında münhasıran lokalize GFP tanımı ortaya koymaktadır. Şekil 2C gösterildiği üzere 300 mikron rostral veya daha büyük bölümlerde muayene express GFP (Şekil 2B) olmadığı için LRL ile electroporated alan nöral tüpün tüm ön-arka eksen vermemiştir.

Gen ekspresyonunun manipülasyonu için Bu testin yardımcı endojen proteinler için ifadesi etki stabilite bağlıdır. LRL proneural transkripsiyon faktörlerinin diferansiyel ifadesi ⁽¹ Yorumlar) ile karakterize benzersiz progenitör etki sahip olarak karakterize edilmiştir.Bu faktörlerin bir alt kümesi (Mash1, Math1, Ngn1 ve Ptf1a) LRL, gelecekteki çalışmalarda ^16-18 bir konuda precerebellar nöral alt tiplerinin özellikleri kendi önerilen ve / veya karakterize rolleri nedeniyle analiz için seçilmiştir. Dört proteinler E11.5 ^16-18 az kaudal ardbeyin oldukça karakteristik ifadeler etki var. Biz kültürler yerleştirildi embriyo büyüklüğü artırmak için başarısız oldu ve aynı zamanda koroid pleksus epitel ve E11.5 ve E12.5 ⁵ arasında meydana LRL ve roofplate, morfolojik olaylar invajinasyon üretimi başlatmak için başarısız olduğu görülmektedir. Bu gözlemlere dayanarak bu embriyoların normal gelişimini durdurdu veya fena halde geciktirdi ve kültürlü embriyolar için karşılaştırılabilir kontrol E11.5 az kültürsüz embriyo olmalıdır tespit edildi.

Kültür ve elektroporasyon endojen protein düzeyleri rahatsız etmemelerini sağlamak için, immunohistoch tarafından dört farklı proteinler analizelectroporated ve en az 24 saat sonra kültür alındı ​​34 farklı embriyolarda emistry (İHK). Tablo muhafaza Normal protein düzeyleri. Şekil 3 temsilcisi IHC veriler gösteriyor ki analiz her marker ve embriyoların yüzdesi için analiz embriyo sayısını gösterir proteinler iki analiz gelen, Mash1 (Şekil 3A ve 3B) ve Math1 (Şekil 3C ve 3B). Biz E11.5 (Şekil 3A ve 3C) de kontrol embriyo kıyasla embriyo çoğunluğu ifadesi takiben elektroporasyon ve kültür (Şekil 3B ve 3B) normal seviyede muhafaza gözlemlenmiştir. Önemli olarak, bu proteinlerin karakteristiği etki ifadesi pertürbe edilmemiştir.

Şekil 1.. Th E11.5 az Embryolarının Elektroporasyon. (A) Şematike elektroporasyon deney. Bir E11.5 embriyo izole edilir ve% 0.01 Fast Green plazmid ifade dördüncü ventrikül içine enjekte edilir. Embriyo daha sonra elektrot kürekler tarafından yanlı ve önceden kültürü içine enjeksiyon önce bir E11.5 embriyo (B) Sagital görünümü konuyor için 50 V darbe tabi tutulur. (C) aynı E11.5 embriyo% 0.01 Fast Green plazmid enjeksiyonu takiben. (D) GFP tek taraflı arka beyin ifade kültür 24 saat takip E11.5 embriyo gözlenmiştir. mb-orta beyin; 4v-dördüncü ventrikül.

Şekil 2. Electroporated Doku GFP ekspresyonu. (A) sol karikatür bir E11.5 embriyonun çevresindeki elektrot yerleştirme gösteriyor. Orta karikatür embriyonun sol tarafında plazmid kodlama GFP alımı ve ifade resmediyor. Sağdaki Karikatür l embriyo üzerinden alınan idealize enine bölümün şemasıevels orta karikatür siyah çizgiler ile gösterilir. Kültür 24 saat sonra bir electroporated E11.5 embriyo ile enine kesitlerinde GFP (B-D) İmmünohistokimya. Oklar roofplate (rp) hapseden sekonder antikor göstermektedir. Görüntüler 10X büyütme alınır. Gösterilen kesitlerin nispi seviyeleri (A) 'in, orta çizgi boyunca yatay çizgiler ile tasvir edilmektedir. mb-orta beyin, l 4v-dördüncü ventrikül; rp-roofplate.

Şekil 3. Alt Rombik Dudak Endojen Proteinlerin ifadesi Mash1 (A ve B) veya CAG ile electroporated edildi embriyolu (A, C) kültür değillerdi E11.5 embriyo enine bölüm karşılaştırarak Math1 (C ve D) için İmmünohistokimya.: : GFP ve 24 saat (B ve D) için kültür. Görüntüler 10X büyütmede alınmıştır.

Proneural TranscriptiFactor üzerinde Analyzed	Embriyolar sayısı İncelendi	Normal İfade Desenler İstinat Yüzde
Math1	15	% 86.7
Mash1	12	% 83.3
Ngn1	7	% 71.4
Ptf1a	6	% 100

LRL Normal Proneural Transkripsiyon Faktörü Alanlar İstinat Electroporated ve kültür Embriyoların Tablo I. yüzdesi.

Tartışmalar

Bu çalışmada sunulan vitro elektroporasyon tekniği verimli gebeliğin 12. günden küçük embriyolarda gen ekspresyonu işlemek için kullanılabilir yeni bir yöntemdir. Kültürüne embriyoların Yerleştirme tanıttı gen ekspresyonu izin verir ve electroporated embriyolar in vivo olarak kalmasına izin verildiğinde öldürücü gözlenen circumvents. Bu teknik elektroporasyon tabanlı çalışmalar için daha önce ulaşılamayan embriyonik ataları gen ifadeleri değişiklik yapıla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Kriyostat	Leica	CM-1850
Biologie ucu Dumoxel DUMONT forseps tedavi	Güzel Bilimsel Araçları	11252-30
20 mm Moria delikli kaşık	Güzel Bilimsel Araçları	10370-17
ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Generator	BTX (VWR)	47745-928
Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes * Elektrotlar	BTX (Fisher)	BTX450165
Fisher Isotemp CO 2 İnkübatör	Balıkçı	1325525
NAPCO CO 2 Gaz Regülatörü	Balıkçı	15497020
12 Peki Doku Kültürü Tabaklar	BD Falcon (Fisher)	877229
HyClone Sıvı Ortamda DMEM/F-12 (1:01); L-glutamin ve HEPES grubu; 500ml	Thermo Scientific (Fisher)	SH3002301
HyClone * Donör Atçılık Serum	Thermo Scientific (Fisher)	SH3007402
İnaktive Fetal Bovine Serum, Nitelikli, Isı	Invitrogen	16140-063
cellgro * 10.000 IU Penisilin, 10,000 mcg / mL Streptomisin	Mediatech (Fisher)	MT-30-002-CI
HyClone * L-Glutamin L-Glutamin; 20% 0.85 NaCl 0mm	Thermo Scientific (Fisher)	SH3003401
Fast-Yeşil	Balıkçı	AC41053-0250	% 0.01