Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Özet

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri açıklar In vivo, Kemik iliği aspirasyon gelen polarize makrofajlar doğan ve adoptively farelere makrofajlar aktarılması. Bu teknikler polarize makrofajlar sağlık ve hastalıkta oynadığı rol belirlenmesini sağlar.

Özet

Makrofajlar doğuştan bağışıklık yanıtı başlatılması ve edinilmiş bağışıklık yanıtı yönetmenlik bulaşıcı meydan okuma ya da yaralanma Doğal bağışıklık sisteminde önemli oyuncular vardır. Makrofaj disfonksiyon uygun bir bağışıklık yanıtı monte bir yetersizlik yol açabilir ve bu şekilde, inflamatuvar barsak hastalıkları gibi birçok hastalık süreçleri, karıştığı edilmiştir. Makrofajlar, kabaca iki kategoriye ayrılır polarize fenotipleri gösterilecek. Klasik aktive makrofajlar, IFNγ veya LPS ile uyarılması ile aktive çözünürlükte alternatif aktive makrofajlar ise, IL-4 veya IL-13 tarafından aktive, süpürücü enkaz ve doku yeniden katılmak ve suçlanmıştır bakteriyel meydan okumaya yanıt olarak önemli bir role enflamasyon faz. In vivo bir inflamatuvar yanıt sırasında, makrofajlar bağışıklık hücrelerinin infiltre karmaşık bir karışımı ortasında bulunan ve ağırlaştırarak ya çözümleriniz katılabileceklerdirg iltihabı. Bir bütün hayvan modelinde yerinde makrofajların rolünü tanımlamak için, bu karmaşık ortamdan makrofajlar tüketen etkisini incelemek gerekir. In situ makrofaj fenotip rolü hakkında soru sormak için, fenotipik olarak tanımlanan kutuplaşmış makrofajların kemik iliği aspirasyon gelen, ex vivo elde edilebilir ve veya makrofajların önceden tükenmesi olmadan geri farelere ekledi. Protokolde klodronat-içeren lipozomlar Burada sunulan, karşılık PBS enjekte kontroller, dekstran, sodyum sülfat (DSS) ile endüklenen farelerde kolit esnasında kolon makrofajlar tüketen için kullanıldı. Buna ek olarak, polarize makrofajlar ex vivo olarak elde edildi ve farelere damardan enjeksiyon yoluyla aktarılmıştır. Bu yaklaşımın bir uyarı olduğunu klodronat içeren lipozomlar böylece tükenmesi tarafından gözlemlenen etkisi makrofaj özgü, sulandırılması o olduğundan emin olmak için dendritik hücreler ve makrofajlar dahil olmak üzere tüm profesyonel fagositler, tüketmek olduğunumakrofajların evlatlık transferi ile f fenotip gereklidir. Farelerde sistemik makrofaj azalması da bir CD11b-DTR arka plan üzerine backcrossing fareler elde edilebilir, ki tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Klodronat ihtiva eden lipozom-aracılı tükenmesi avantajı backcrossing farelerin dahil süresi ve masrafı gerekmez ve bağımsız olarak farelere (C57BL / 6, BALB / c, ya da karışık arka plan ve farelerde de kullanılabilir olmasıdır ).

Protokol

1. Klodronat içeren Lipozomlar kullanma Delen Makrofajlar

1. Lipozomlar 4 ° C'de saklanır İki saat enjeksiyondan önce, oda sıcaklığına (18 ° C) gelmesini sağlamak için buzdolabından klodronat içeren lipozomlar, PBS içeren lipozomlar veya steril PBS (enjeksiyon kontrolü) çıkarın.
2. 1 ml enjektöre 200 ul yüklemeden önce eşit dağılımını sağlamak için lipozomlar 8-10 kez içeren tüpler ters çevirin. Şırınga üstüne bir 26 gauge iğne takın.
3. Sadece kendi kafa ve bacaklarda hareketsiz yeterli cilt tutan kulakları aşağıda sol elinizle, berduş fare kullanma.
4. Iç organların karın sağ alt kadranda bulunan enjeksiyon, uzaklaşın böylece başını yere doğru biraz yani fare eğin.
5. Avuçlarınızın arasında şırınga yuvarlayın ve enjeksiyon için eşit önce lipozom çözümü dağıtmak için 6 kez ters çevirin.
6. 30-40 derecelik bir açıyla fare karnın sağ alt tarafında iğne yerleştirin. Lipozom çözüm veya PBS 200 mikrolitre enjekte edilir.
7. Tetiklenmiş bir inflamasyon modeli sırasında, DSS bağlı kolit gibi yeni infiltre makrofajlar tüketmek protokolü sırasında ikamet makrofaj ve her 2 günde tükenmesi sağlamak için önce deneysel inflamasyon başlangıcından 4 gün fareler enjekte.
8. Deney sonunda, planlanan deneysel analizleri ile birlikte, ilgi sitesinden dokuların kaldırmak ve immünohistokimyasal makrofaj tükenmesi onaylamak için paraformaldehit ile sabitleyin.

2. Kemik İliği ASPİRAT gelen Polarize Makrofajlar türetilmesi

1. Yaş 8 ve 12 hafta arasında farelerin kemik iliği kemik iliği kaynaklı makrofajlar en yüksek verim sağlar. Fare Euthanize, onun sırtüstü yatıyordu, ve mümkün olduğunca bacakları germe, pençeleri mecbur.
2. Hoo steril bir çalışmad, mümkün olduğu kadar çok kas gibi kesilip, femur ve tibia çıkarın.
3. % 10 FCS ile IMDM kullanarak kemiklerden Flush iliği, 26 gauge iğne ile donatılmış bir 5 ml şırınga içine yüklenir.
4. Seyreltilir kemik iliği% 10 FCS, bir 75 cm ² doku kültürü şişe içinde yer hücreler ve 37 ° C'de inkübe edilir, 5% 4 saat boyunca _CO2 ile IMDM içinde 40 ml aspire. Bu adım, hematopoietik öncü yapışık mezenkimal hücreler veya olgun makrofajlar kaldırır.
5. 1200 rpm'de 5 dakika boyunca 50 ml konik Falcon tüpü ve santrifüj ile yapışmaz progenitörlerin içeren transferi kültür yüzey maddesi.
6. Pastör pipetiyle hücre 5 ml IMDM yılında pelet,% 10 FCS ve asetik asit 20 hücre süspansiyonu 1 seyreltilmesiyle çekirdekli hücreleri saymak. Bu prosedür, kırmızı kan hücreleri ve kalan çekirdek bir hemositometre sayılabilir dahil tüm hücreleri lyses.
7. 0.5 'lik bir konsantrasyon x 10 ⁶ hücre / ml tam medyum içinde azından Pastör pipetiyle hücreleri; IMDM,% 10 FCS, 150 uM monothiogliserol (MTG) ve 10 ng / MCSF, GM-CSF, ya da IL-3 ya ml. GM-CSF-ya da IL-3-türevi makrofajlar alternatif olarak aktive edilir ise MCSF-türevi makrofajlar, klasik olarak makrofajlar aktive edilir.
8. Yapışmaz hücreleri aşağı eğirme ve şişeyi onları dönen ve gün 7'de atarak yapışmaz hücreleri, 4. günde orta değiştirin.
9. Buna ek olarak, IFNγ (10 ng / ml) ya da IL-4 (10 ng / ml) eğriltme makrofajlar etmek üzere gün 7'de MCSF türetilmiş hücreler içeren şişe ilave edilebilir bir klasik olarak, sırasıyla, aktive edilmiş veya bir alternatif olarak aktif fenotipe. 3 gün daha hücreleri inkübe edin.
10. 10. günde, medya kaldırmak ve Hücre Disosiyasyon Tampon (Gibco-BRL) kullanılarak doku kültürü balonun hücreleri kaldırın. Sonra Place 5 oda sıcaklığında (18 ° C) 5 dakika hücrelerindeki tampon ml ve palmiye topuk sıkıca birkaç kez şişenin yan vuruyorum. Hücreler altında şişesi inceleyerek balonun kaldırdı emin olunmikroskop. Pipet ile 15 ml konik tüpe Falcon hücreleri tekrar süspanse edilir ve IMDM,% 10 FBS ilave bir 10 ml şişeye yıkanır. Havuz ve 300 × g az 5 dakika boyunca hücreleri aşağı spin.
11. Steril PBS içerisinde 10 pH7.4 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda bir hemasitometre ile Pastör pipetiyle kullanılarak canlı hücreler sayma. Makrofajlar farelere enjeksiyon için hazırdır.
12. Rezerv 1.0 × makrofaj fenotip değerlendirilmesi için 10 ⁶ makrofajlar. Lipopolisakkarid salgılayan nitrik oksit yüksek seviyede ve IL-10 ve IL-12p70 ve düşük seviyede olmaları ile uyarılan, klasik olarak aktive makrofajlar alternatif aktive makrofajlar kıyasla. Alternatif olarak aktive makrofajlar yapısal olarak YM1 ve Batı immunoblotting ile tespit edilebilir arginaz I (Argi), ifade eder.

3. Fareler içine Makrofajlar tranferring

1. 10. ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda steril PBS içinde Pastör pipetiyle makrofajlar. Bu, bir sağlargüvenli ve rahat kuyruk veninden farelere enjekte edilebilir bir hacmi 100 ul, toplam hacmi 10 ⁶ makrofajların travenous enjeksiyon.
2. Kuyruk veni genişletmek için 5-10 dakika bir ısıtma yastığı veya sıcak kucağında kullanarak Sıcak fareler. Hipertermi belirtileri için her zaman fare izleyin.
3. Kuyruk damarlar erişime izin veren bir frenleyici cihaz için fareyi aktarın.
4. Kuyruk 90 ° çevirin ven yukarı bakacak şekilde. Damarları kuyruk her iki yanal olarak aşağı doğru çalıştırma ve ven ya da kullanılabilir.
5. Bir alkollü bez ile enjeksiyon yeri temizleyin ve yavaş yavaş 26 veya 28 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak 100 ul (10 ⁶ makrofajlar) enjekte edilir. Yukarı gelecek şekilde eğim yüzü ve ven neredeyse paralel hafif bir açıyla iğne yerleştirin.
6. Iğnenin doğru takılırsa hiçbir direnç hissettim edilmeli ve damar enjeksiyonu sonrası net olmalıdır. İğne mevcut değilseven, kuyruk çıkıntı olacak. Bu durumda, iğneyi çıkarın ve tekrar son girişimi veya diğer ven proksimalinde deneyin. Kuyruk sert ve iğne kuyruk damarından enjeksiyon sırasında çabuk sıkıcı hale yeni bir iğne her enjeksiyon için kullanılmalıdır.
7. Enjeksiyonu takiben, iğneyi çıkarın kanama durana kadar enjeksiyon yerinde hafifçe basınç uygulayın ve bu kanama durdu sağlamak için ek bir 5min için fare izlemek.
8. Deneysel işlem sırasında polarize makrofajların sürekli teslim olması için her türlü 4 gün makrofaj enjeksiyonları tekrarlayın.
9. Deney sonunda, deneysel analizleri ile birlikte, ilgi sitesinden dokuların kaldırmak ve immünohistokimyasal polarize makrofajların etkili teslim onaylamak için paraformaldehid veya formalin ile sabitleyin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Ikamet macrop sayısı ve fenotipHerhangi bir dokuda hages incelenen doku bağlıdır ve enfeksiyon veya inflamasyon döneminde değişecek. Benzer şekilde, bir doku makrofajlar tüketeceğinden klodronat-içeren lipozomlar yeteneği idare ve hedef doku için etkili bir teslimat güzergahı bağlı olacaktır. F4/80 azalma ⁺ makrofaj işaretleyici, F4/80 (Şekil 1A) için immünhistokimyasal boyama ile belirgindir DSS bağlı kolit sırasında fare kolon makrofajlarda klodronat içeren lipozomlar sonuçları intraperitoneal. Histolojik boyama de doku kesitlerinde makrofaj sayısı ve fenotip nicel farklılıkları belirlemek için kullanılabilir. Şekil 1B farelere enjekte edildiğinde makrofajların 55 ortalama% fare kolon tespit hiçbir tükenmesi göre klodronat içeren lipozomlar tarafından tüketilmiş olduğunu gösterir enjeksiyon kontrol olarak PBS yalnız. Her değer F4/80 ve Argi leke sayarak belirlenirsayma deneysel durumu bilmeyen iki kişi tarafından gerçekleştirilen ile fare başına 3 bölümde 3 noktada 6 fare, seri doku kesitlerinde ed pozitif hücreler. Bu sonuçlar, klodronat lipozomlar intraperitoneal farelerde kolon makrofajlar tüketen göstermektedir.

(GM-CSF veya IL-3-türevi veya MCSF-türetilen ve klasik olarak aktive (MCSF-türetilen ya MCSF-türetilen ve IFNγ ile muamele) ya da alternatif olarak aktive edilir farklı büyüme faktörleri verim makrofajlar varlığında kemik iliği makrofajlar türetilmesi ), IL-4 ile muamele edilmiştir. 8 haftalık bir fareden 2 femur ve 2 tibia kemik iliği Flushing genellikle fare başına 6 × 10 ⁷ çekirdekli hücreler ve verimleri 8 × 10 ⁶ MCSF kökenli makrofajlar, 10 × 10 ⁶ GM-CSF kökenli makrofajlar, ya da 12 verir × 10 ^6, IL-3-türevi makrofajlar. Şekil 2A makrofaj nitrit ve IL-12p70/IL-10 oranı sup gösterirernatants 24 saat boyunca lipopolisakkarit ile muamele Şekil 2B 0,5 tipik bir Western blot analizi × MCSF den 10 makrofajlar ⁶ + / gösterir -. IL-4 türetilmesi koşulları alternatif aktive makrofajlar belirteçler, Argi, YM1 yönelik antikorlar ile probed, ya da bir şekilde GAPDH ile kontrolü yükleniyor. Bu veriler, kemik iliği kaynaklı makrofajlar türetme sırasında kutuplaşmış bir fenotipi etkiye sahip olabileceğini göstermektedir.

Bir doku ex vivo elde polarize makrofajların etkin transferi yönetim ve doku erişim yolu bağlıdır. DSS indüklenen kolit sırasında, makrofajlar enflamasyon sitesine seyahat ve alternatif olarak aktive makrofajlar hastalığı şiddetini azaltmak damardan enjekte edilir. Şekil 3A makrofajlar toplam sayısını gösterir ve farelerin histolojik bölümlerde sayıldı Argi + (alternatif olarak aktif) makrofajların numarası polarize enjekte kemik iliğiMakrofaj kaynaklı. DSS bağlı kolit sırasında kolon polarize makrofajların transferi etkisi hastalık aktivite indeksi, kilo kaybı, rektal kanama, dışkı kıvamı ve azalmış (Şekil 3B) dayalı bir katkı puanı ile gösterilir. Bu sonuçlar, ex vivo olarak türetilmiş olduğunu göstermek, adoptively transfer makrofajlar kolon ve etkisini indüklenen inflamasyon trafik yapabilirsiniz. M2 makrofajlar önemli hastalık aktivite indeksi azaltmak ise M1 makrofajlar inflamasyon etkisi yoktur.

Şekil 1. Klodronat içeren lipozomlar etkili F4/80 incelten + ve F480 + Argi + in vivo fare kolon hücreleri. Karışık C57BL / 6 × 129Sv arka plan üzerinde vahşi tip farelerin bir F2 nesil tedavi DSS önce PBS (Kontrol) veya klodronat içeren lipozomlar (Klodronat) 4 gün ile 7 gün ve enjekte IP için% 5 DSS verildive gün 0, 2, 4, ve 6 DSS tedavi sırasında on. (A) Kolonlar, kaldırıldı sabit ve bölümler olgun makrofajlar (F4/80) ve M2 makrofaj işaretleyici, Argi immünohistokimyasal olarak boyandı edildi. F4/80 (B) kantitasyonu + ve Argi + makrofajlar. Pozitif boyanan hücreler 3. bölüm / fareden ve 6 farelerin / gruptan 6 alanda 40 × büyütmede kullanılan deney koşullarını bilmeyen iki kişi tarafından sayıldı. * P <0.01.

Şekil 2,. MCSF-türevi makrofajlar, bir klasik olarak aktive fenotip ifade edebilir ve IL-4 ile muamele MCSF-türetilmiş bir alternatif aktive makrofajlar makrofaj fenotip ifade eder. (A) bir klasik olarak aktif fenotip ile uyumlu olarak, MCSF-türevi makrofajlar lipopolisakkarid yanıt olarak nitrik oksit daha yüksek seviyelerde üretmek ve onun aşağı metaboliti, nitrit algılar Griess deneyi ile ölçülebilir. Onlar alsELISA ile ölçülebilir daha yüksek bir IL-12p70/IL-10 oranı, üretmek o. * P n = 3 <0.01. (B) bir alternatif aktive fenotipi ile uyumlu olarak, IL-4 yapısal olarak ifade YM1 ve Argi ile tedavi MCSF kökenli makrofajlar, hangi Batı immunoblotting tarafından tespit edilebilir. Veri benzer sonuçlar ile 3 bağımsız deneyler temsilcisi vardır.

Şekil 3. İntravenöz enjeksiyonlu, ex vivo kaynaklı alternatif kolon makrofajlar trafik aktif ve bağırsak iltihabı azaltır. Bir karma C57BL / 6 × 129Sv arka plan üzerinde vahşi tip farelerin bir F2 kuşak altı gün süreyle içme suyu içinde% 5 DSS verildi. M1 ve M2 makrofajlar DSS tedavi sırasında Gün 0 ve 4 IV enjekte edildi. (A) Kolonlar, kaldırıldı sabit ve bölümler olgun makrofajlar (F4/80) için immünhistokimya ve M2 makrofaj işaretleyici (Argi) tarafından boyandı edildi.Kontrolü PBS enjekte fareler (C) makrofajlar kantitasyonu, M1 makrofajlar (+ M1) ve M2 makrofajlar (+ M2) enjekte edilmiş farelere enjekte edilen farelerde 3 bölümden / fareden 6 alanda 40 × büyütme ile pozitif boyanan hücrelerin sayımı ile yapıldı ve 6 fare / grup. Sayma deneysel durumu bilmeyen iki kişi tarafından gerçekleştirildi. (B) Hastalık aktivitenin izlendiği ve tedavi sırasında günlük attı ve kilo kaybı, rektal kanama, dışkı kıvamı ve azalmış dayanan bir katkı puanı dir. * P n <0.05, 2 bağımsız deneyde = 6 fareler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Makrofajlar, bağışıklık sisteminin önemli bir rol oynamaktadır fagositik hücrelerdir. Onlar doğuştan gelen bağışıklık yanıtı başlatılması ve edinilmiş bağışıklık yanıtı yönetmenlik sorumludur. Tipik olarak, klasik olarak aktive makrofajlar IFNγ veya LPS ile aktive ve patojenlerin ortadan kaldırılması ve bir inflamatuvar yanıt ¹ montajı için sorumludurlar. Bunun tersine, alternatif olarak aktive makrofajlar, IL-4 ve IL-13 ile aktive ve inflamasyon ¹ çözünürlü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Klodronat-içeren lipozomlar	Clodronateliposomes.org
PBS-içeren lipozomlar	Clodronateliposomes.org
Steril PBS pH7.4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Fötal Buzağı Serumu (FCS)	Invitrogen	12483
asetik asit	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monotiyogliserol (MTG)	Sigma	96-275
Recombyapıldıktan sonra aynı operas fare MCSF	Stemcell Teknolojileri	02951
GM-CSF Rekombinant murin	Stemcell Teknolojileri	02935
Rekombinan sıçan, IL-3	Stemcell Teknolojileri	02903
Rekombinant fare IFNγ	Stemcell Teknolojileri	02746
Rekombinan sıçan, IL-4	Stemcell Teknolojileri	02714
Hücre Ayrılma Tampon	Invitrogen	13150-016
Anti-F4/80 Antikor sıçan	AbD Serotec	MCA497GA
Fare anti-Argi Antikor	BD İletimi Laboratuvarları	610708