L'épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Résumé

Les macrophages jouent un rôle central dans l'homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les macrophages In vivo, Dérivant macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse, et le transfert adoptif des macrophages à des souris. Ces techniques permettent de déterminer le rôle que les macrophages polarisés jouer dans la santé et la maladie.

Résumé

Les macrophages sont des acteurs essentiels dans la réponse immunitaire innée au défi infectieuse ou d'une blessure, les initiateurs de la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. Macrophage dysfonctionnement peut conduire à une incapacité de monter une réponse immunitaire appropriée et en tant que telle, a été impliqué dans de nombreux processus pathologiques, y compris les maladies inflammatoires de l'intestin. Les macrophages afficher phénotypes polarisés qui sont largement divisés en deux catégories. Macrophages activés Classiquement, activées par la stimulation avec IFNy ou LPS, jouent un rôle essentiel dans la réponse au défi alors que les macrophages bactérienne alternativement activés, activée par l'IL-4 ou d'IL-13, participer à des débris de balayage et le remodelage des tissus et ont été impliqués dans la résolution la phase de l'inflammation. Lors d'une réponse inflammatoire in vivo, les macrophages se trouvent au milieu d'un mélange complexe d'infiltrer les cellules immunitaires et peuvent participer en exacerbant ou résolvinel'inflammation g. Pour définir le rôle des macrophages in situ dans un modèle animal entier, il est nécessaire d'examiner l'effet de l'épuisement des macrophages à l'environnement complexe. Pour poser des questions sur le rôle du phénotype des macrophages in situ, phénotypiquement définis macrophages polarisés peuvent être dérivées ex vivo, à partir de ponctions de moelle osseuse et rajoutées à la souris, avec ou sans l'épuisement préalable des macrophages. Dans le protocole présenté ici clodronate liposomes contenant, par rapport aux témoins injectés PBS, ont été utilisés pour épuiser les macrophages du côlon au cours du sulfate de sodium dextran (DSS) de colite induite chez la souris. En outre, les macrophages ont été polarisées dérivée ex vivo et transféré à des souris par injection intraveineuse. Une mise en garde de cette approche est que les liposomes contenant du clodronate épuiser toutes les phagocytes professionnels, y compris les deux cellules dendritiques et les macrophages afin d'assurer l'effet observé par l'épuisement est macrophages spécifique, la reconstitution ophénotype f par transfert adoptif de macrophages est nécessaire. L'épuisement des macrophages systémique chez la souris peut également être obtenu par rétrocroisement souris sur un fond CD11b-DTR, qui est une excellente approche complémentaire. L'avantage du clodronate liposome contenant médiée par l'épuisement, c'est qu'il ne nécessite pas le temps et les frais engagés pour les souris et rétrocroisement il peut être utilisé chez la souris indépendamment de l'origine des souris (C57BL / 6, BALB / c, ou d'origine mixte ).

Protocole

1. Les macrophages appauvrissant la couche d'Utilisation clodronate liposomes contenant

1. Les liposomes sont conservés à 4 ° C. Deux heures avant l'injection, retirez le clodronate contenant des liposomes, PBS contenant des liposomes, ou PBS stérile (commande d'injection) du réfrigérateur afin de leur permettre de s'acclimater à la température ambiante (18 ° C).
2. Inverser les tubes contenant des liposomes 8-10 fois pour assurer une répartition avant même de charger 200 pi dans une seringue de 1 ml. Fixer une aiguille de calibre 26 vers le haut de la seringue.
3. En utilisant votre main gauche, nuque la souris juste au-dessous des oreilles détenant assez de peau pour immobiliser la tête et des membres.
4. Inclinez la souris de façon à sa tête est légèrement vers le sol afin organes internes s'éloigner du site d'injection, qui est situé dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen.
5. Rouler la seringue entre les paumes de vos mains et la retourner 6 fois pour répartir uniformément la solution de liposomes avant l'injection.
6. Insérer l'aiguille dans la partie inférieure droite de l'abdomen de la souris à un angle de 30-40. Injecter 200 ul de solution de liposomes ou de PBS.
7. Au cours d'une inflammation induite par le modèle, comme la colite induite par DSS, injecter souris 4 jours précédant l'apparition de l'inflammation expérimentale pour assurer l'épuisement des macrophages résidents et tous les 2 jours pendant le protocole d'épuiser nouveaux macrophages infiltrant.
8. A la fin de l'expérience, ainsi que des analyses expérimentales prévues, éliminer les tissus à partir du site d'intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde pour confirmer l'épuisement des macrophages par coloration immunohistochimique.

2. Dérivation des macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse

1. La moelle osseuse de souris entre 8 et 12 semaines d'âge fournit le plus haut rendement de la moelle osseuse macrophages dérivés. Euthanasier la souris, posez-le sur le dos, et cerner ses pattes, étirant ses membres autant que possible.
2. Travailler dans un stérile hood, enlever les fémurs et les tibias, coupant le muscle autant que possible.
3. La moelle des os en utilisant Flush IMDM avec 10% FCS chargé dans une seringue de 5 ml munie d'une aiguille de calibre 26.
4. Diluer la moelle osseuse aspire à 40 ml en IMDM avec 10% de FCS, les cellules de lieu dans un flacon de ⁷⁵ cm2 de culture tissulaire, et incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 4 heures. Cette étape supprime adhérentes des cellules mésenchymateuses ou des macrophages matures à partir de progéniteurs hématopoïétiques.
5. Surnageant de culture contenant de transfert non-adhérentes progéniteurs dans un tube conique de 50 ml Falcon et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm.
6. Resuspendre culot cellulaire dans 5 ml IMDM, 10% de SVF et de compter les cellules nucléées en diluant 1 suspension cellulaire dans 20 dans l'acide acétique. Cette procédure lyse toutes les cellules dont les globules rouges et les noyaux restants peuvent être comptées sur un hématimètre.
7. Resuspendre les cellules à une concentration de 0,5 × 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu complet; IMDM, 10% de FCS, 150 monothioglycérol uM (MTG), et 10 ng / ml soit MCSF, GM-CSF, ou de l'IL-3. MCSF macrophages dérivés sont classiquement macrophages activés alors que les macrophages GM-CSF ou IL-3-dérivés sont alternativement activés.
8. Remplacer moyenne au 4 e jour, la filature par les cellules non adhérentes et de les retourner dans le ballon, et à 7 jours, en rejetant les cellules non adhérentes.
9. En outre, l'IFNy (10 ng / ml) ou de l'IL-4 (10 ng / ml) peuvent être ajoutés à des flacons contenant des cellules dérivées de MCSF au jour 7 de macrophages fausser à un. Classique activé ou d'un phénotype encore activé, respectivement Incuber les cellules pendant 3 jours de plus.
10. Au jour 10, retirer le support et soulevez les cellules hors du flacon de culture tissulaire en utilisant la dissociation cellulaire tampon (Gibco-BRL). Placer 5 ml de tampon sur les cellules pendant 5 min à température ambiante (18 ° C) puis taper le côté du ballon avec le talon de la paume fermement plusieurs fois. Faire en sorte que les cellules ont soulevé du flacon en examinant le ballon sous uneMicroscope. Pipeter remis en suspension les cellules dans un tube de 15 ml conique Falcon et laver la fiole avec un supplément de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscine et centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 × g.
11. Compter les cellules viables au moyen d'un hémocytomètre et remettre en suspension à une concentration de 10 ⁷ cellules / ml dans du PBS stérile pH 7,4. Les macrophages sont prêtes pour l'injection à des souris.
12. Réserve 1,0 × 10 ⁶ macrophages pour l'évaluation du phénotype des macrophages. Macrophages activés Classiquement stimulées par les niveaux élevés de lipopolysaccharide sécrètent de l'oxyde nitrique et les niveaux d'IL-12p70 et basse de l'IL-10 par rapport aux macrophages activés alternativement. Macrophages activés alternativement expriment constitutivement YM1 et l'arginase I (Argi), qui peut être détecté par Western immunoblot.

3. Tranferring macrophages à des souris

1. Remettre en suspension dans les macrophages du PBS stérile à une concentration de 10 ⁷ cellules / ml. Cela permet pour un end'injection intraveineux de 10 ⁶ macrophages dans un volume total de 100 pi, ce qui est un volume qui peut être en toute sécurité et confortablement injectées à des souris par la veine de la queue.
2. Souris chaude avec un coussin chauffant ou sur les genoux de la chaleur pendant 5-10 min pour dilater la veine de la queue. Surveiller la souris en tout temps pour des signes d'hyperthermie.
3. Transfert de la souris à un dispositif de retenue qui permet d'accéder aux veines de la queue.
4. Tournez la queue 90 ° de sorte que la veine est orientée vers le haut. Les veines de fonctionner latéralement vers le bas des deux côtés de la queue et soit la veine peut être utilisé.
5. Nettoyer le site d'injection avec un tampon imbibé d'alcool et lentement, injecter 100 ml (10 ⁶ macrophages) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26 ou 28. Insérez l'aiguille avec le côté conique vers le haut et à un léger angle, presque parallèle à la veine.
6. Si l'aiguille est insérée correctement aucune résistance devrait se faire sentir et la veine devrait devenir claire après l'injection. Si l'aiguille n'est pas dans laveine, la queue sera renflement. Si cela se produit, retirez l'aiguille et essayez à nouveau à proximité de la dernière tentative ou dans la veine des autres. Une nouvelle aiguille doit être utilisée pour chaque injection, la queue est dure et les aiguilles deviennent ternes rapidement lors de l'injection veine de la queue.
7. Après l'injection, retirez l'aiguille, appliquer une légère pression au site d'injection jusqu'à ce que le saignement s'arrête, et de surveiller la souris pour un 5min supplémentaires pour veiller à ce que le saignement a cessé.
8. Répéter les injections macrophages tous les 4 jours pour assurer une livraison continue des macrophages polarisés au cours de la procédure expérimentale.
9. A la fin de l'expérience, ainsi que des analyses expérimentales, éliminer les tissus à partir du site d'intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde ou de formol pour confirmer la livraison effective des macrophages polarisés par coloration immunohistochimique.

4. Les résultats représentatifs

Le nombre et le phénotype des macrop résidentHages dans n'importe quel tissu donné dépend sur le tissu en cours d'examen et va changer lors de l'infection ou l'inflammation. De même, la capacité du clodronate liposomes contenant d'épuiser les macrophages à partir d'un tissu dépendra de la voie d'administration et la prestation efficace du tissu cible. L'injection intrapéritonéale des résultats des liposomes contenant du clodronate à une diminution de F4/80 ⁺ macrophages dans le côlon de la souris pendant DSS-colite induite en évidence par la coloration immunohistochimique pour le marqueur des macrophages, F4/80 (figure 1A). Coloration histologique peut également être utilisé pour déterminer les différences quantitatives en nombre des macrophages et du phénotype dans des coupes de tissus. Figure 1B montre qu'en moyenne 55% des macrophages est appauvri par le clodronate liposomes contenant par rapport à aucun épuisement détecté dans deux points de la souris lorsque les souris sont injectées avec PBS seul comme un contrôle de l'injection. Chaque valeur est déterminée par comptage F4/80 et Argi tachecellules éd positifs dans des coupes de tissus de série à partir de 6 souris à 3 points, en 3 sections par la souris avec comptage étant effectué par deux individus aveuglés à l'état expérimental. Ces résultats démontrent que les injections intra-péritonéales de liposomes clodronate épuiser les macrophages du côlon chez des souris.

Dérivation des macrophages de la moelle osseuse en présence de facteurs de croissance différents des macrophages rendements qui sont classiquement activés (MCSF-dérivé ou MCSF dérivé et traitée avec IFNy) ou encore activé (GM-CSF ou IL-3-dérivé ou MCSF dérivés et traitée avec de l'IL-4). Flushing moelle osseuse à partir de 2 fémurs et tibias 2 à partir d'une souris de 8 semaines donne généralement de 6 × 10 ⁷ cellules nucléées par la souris et les rendements de 8 × 10 ⁶ MCSF macrophages dérivés, 10 × 10 ⁶ GM-CSF macrophages dérivés, ou 12 × 10 ⁶ IL-3-macrophages dérivés. La figure 2A montre le nitrite et le rapport IL-12p70/IL-10 dans les macrophages supernatants traitée avec un lipopolysaccharide pendant 24 heures la figure 2B montre une analyse par transfert de type Western de 0,5 × 10 ⁶ macrophages de MCSF + / -. IL-4 conditions de dérivation sondé avec des anticorps pour les marqueurs des macrophages activés, alternativement, des Argi YM1, ou avec la GAPDH comme un le chargement de contrôle. Ces données démontrent que la moelle osseuse macrophages dérivés peuvent être faussés à un phénotype polarisé au cours de dérivation.

Un transfert effectif de ex vivo des macrophages dérivés polarisées à un tissu dépend de la voie d'administration et l'accès à du tissu. Au cours de DSS-colite induite par les macrophages injecté par voie intraveineuse se rendre sur le site de l'inflammation et les macrophages alternativement activés réduire la sévérité de la maladie. Figure 3A montre le nombre total des macrophages et le nombre de macrophages Argi + (alternativement activé) comptés dans les coupes histologiques de souris injectées avec des polarisée moelle osseuseDérivé des macrophages. L'impact du transfert des macrophages polarisés au niveau du côlon au cours DSS-colite induite est représenté par l'indice activité de la maladie, un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué (figure 3B). Ces résultats démontrent que ex vivo dérivés, les macrophages adoptive transférés peuvent le trafic au niveau du côlon et de l'inflammation induite par l'impact. Macrophages M1 n'ont pas d'impact alors que l'inflammation des macrophages M2 réduire de façon significative l'indice d'activité de la maladie.

Figure 1. Le clodronate liposomes contenant effectivement épuiser F4/80 + et + F480 + Argi cellules dans deux points de souris in vivo. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × fond 129SV ont été donnés DSS 5% pendant 7 jours et IP injecté avec du PBS (contrôle) ou le clodronate liposomes contenant (clodronate) 4 jours avant le traitement au MASet aux jours 0, 2, 4, et 6 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et le marqueur des macrophages M2, Argi. (B) La quantification de F4/80 + et + de Argi macrophages. Cellules colorées positivement ont été comptés par deux individus aveuglés à l'état expérimental à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. * P <0,01.

Figure 2. MCSF macrophages dérivés exprimer un phénotype classique activé et MCSF macrophages dérivés traités avec de l'IL-4 exprimer un phénotype des macrophages activés alternativement. (A) Conformément à un phénotype classique activé, MCSF macrophages dérivés de produire des niveaux plus élevés d'oxyde nitrique en réponse aux lipopolysaccharides et peut être mesurée par le dosage de Griess, qui détecte son aval métabolite, le nitrite. Ils also produire un rapport plus élevé IL-12p70/IL-10, qui peut être mesurée par la méthode ELISA. * P <0,01 pour n = 3. (B) Conformément à un phénotype alternativement activée, MCSF macrophages dérivés traités avec de l'IL-4 YM1 expriment constitutivement et Argi, qui peut être détectée par immuno-Ouest. Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes avec des résultats similaires.

Figure 3. Injecté par voie intraveineuse, ex vivo dérivé alternativement activé la circulation des macrophages dans le côlon et réduire l'inflammation intestinale. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × 129SV fond ont été donnés 5 DSS% dans leur eau potable pendant six jours. Macrophages M1 et M2 ont été injecté par voie IV aux jours 0 et 4 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et un marqueur de macrophages M2 (Argi).La quantification des macrophages pour les souris injectées PBS contrôle (C), les souris injectées avec des macrophages M1 (M1 +) et des souris injectées avec des macrophages M2 (M2 +) ont été réalisées par comptage des cellules colorées positivement à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. Le comptage est effectué par deux individus aveuglés à l'état expérimental. (B) activité de la maladie a été contrôlée et a marqué tous les jours pendant le traitement et a réalisé un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué. * P <0,05 pour n = 6 souris dans 2 expériences indépendantes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Les macrophages sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle important dans le système immunitaire. Ils sont responsables pour initier la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. En règle générale, les macrophages activés classique sont activés par IFNy ou LPS et sont responsables de l'élimination des pathogènes et le montage d'une réponse inflammatoire ^1. A l'inverse, les macrophages activés alternativement sont activés par l'IL-4 ou d'I...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Clodronate contenant des liposomes	Clodronateliposomes.org
PBS contenant des liposomes	Clodronateliposomes.org
PBS stérile pH 7,4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Sérum de veau foetal (FCS)	Invitrogen	12483
l'acide acétique	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monothioglycérol (MTG)	Sigma	96-275
Recombinant murin MCSF	StemCell Technologies	02951
Recombinant GM-CSF murin	StemCell Technologies	02935
Recombinant IL-3 murine	StemCell Technologies	02903
Recombinant murin IFNy	StemCell Technologies	02746
Recombinant IL-4 murine	StemCell Technologies	02714
Cellule tampon de dissociation	Invitrogen	13150-016
Rat anti-F4/80 Anticorps	AbD Serotec	MCA497GA
Souris anti-Argi Anticorps	Transduction Laboratories BD	610708