Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Resumo

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar macrófagos In vivo, Derivando macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea, e adotivamente transferência de macrófagos em camundongos. Estas técnicas permitem a determinação do papel que os macrófagos desempenham polarizadas na saúde e na doença.

Resumo

Os macrófagos são jogadores importantes na resposta imune inata ao desafio infecciosa ou lesão, iniciando a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Macrófago disfunção pode levar a uma incapacidade para montar uma resposta imune adequada e, como tal, tem sido implicada em muitos processos de doença, incluindo doenças inflamatórias intestinais. Macrófagos exibir fenótipos polarizadas que são amplamente divididos em duas categorias. Macrófagos activados Classicamente, activado por estimulação com IFN-y ou LPS, desempenham um papel essencial na resposta ao desafio bacteriano enquanto os macrófagos alternativamente activados, activado por IL-4 ou IL-13, participar em detritos de limpeza e remodelação do tecido e têm sido implicados na resolução fase de inflamação. Durante uma resposta inflamatória in vivo, os macrófagos são encontrados no meio de uma mistura complexa de infiltração de células imunes e podem participar de exacerbando ou Resolvininflamação g. Para definir o papel de macrófagos in situ num modelo animal como um todo, é necessário examinar o efeito de esgotar macrófagos a partir do ambiente complexo. Para fazer perguntas sobre o papel do fenótipo de macrófagos in situ, fenotipicamente definidos macrófagos polarizadas podem ser derivadas ex vivo, a partir de aspirados de medula óssea e adicionada de volta para ratos, com ou sem depleção prévia de macrófagos. No protocolo aqui apresentado clodronato contendo lipossomas, versus controlos injectados com PBS, foram utilizados para esgotar macrófagos do cólon durante dextrano sulfato de sódio (DSS)-colite induzida em ratos. Além disso, os macrófagos foram derivados polarizadas ex vivo e transferidos para ratinhos por injecção intravenosa. Uma advertência a esta abordagem é que os lipossomas contendo clodronato esgotar todos os fagócitos profissionais, incluindo ambas as células dendríticas e macrófagos de modo a assegurar o efeito observado por depleção de macrófagos é específico a reconstituição, ofenótipo f por transferência adoptiva de macrófagos é necessário. Depleção de macrófagos sistémica em ratinhos pode também ser conseguida por ratinhos retrocruzamentos sobre um fundo CD11b-DTR, que é um excelente abordagem complementar. A vantagem da depleção de clodronato contendo mediada por lipossomas é que ele não exige que o tempo ea despesa envolvidos em ratinhos retrocruzamentos e pode ser utilizado em ratinhos, independentemente do fundo dos ratinhos (C57BL / 6, BALB / c, ou fundo misto ).

Protocolo

1. Os macrófagos destroem Usando clodronato contendo lipossomas

1. Os lipossomas são armazenados a 4 ° C. Duas horas antes da injecção, remover o clodronato contendo lipossomas, PBS contendo lipossomas, ou PBS estéril (injecção de controlo) a partir do refrigerador para permitir que eles se adapte à temperatura ambiente (18 ° C).
2. Inverter os tubos contendo lipossomas 8-10 vezes para assegurar uma distribuição uniforme antes de carregar 200 ul para uma seringa de 1 ml. Anexar uma agulha de calibre 26 para o topo da seringa.
3. Usando a sua mão esquerda nuca, o mouse logo abaixo das orelhas que prendem a pele o suficiente para imobilizar a sua cabeça e membros.
4. Inclinar a rato pelo que a sua cabeça é ligeiramente para o chão de modo órgãos internos afastar-se do local de injecção, que está localizado no quadrante inferior direito do abdómen.
5. Rolar a seringa entre as palmas das mãos e invertê-lo 6 vezes para distribuir uniformemente a solução de lipossomas antes da injeção.
6. Inserir a agulha no lado inferior direito do abdômen do mouse em um ângulo de 30-40. Injectar 200 uL de solução de lipossoma ou PBS.
7. Durante um modelo de inflamação induzida, como DSS induzida colite, injectar ratinhos 4 dias antes do início da inflamação experimental para assegurar a depleção de macrófagos residentes e cada 2 dias, durante o protocolo de esgotar novos macrófagos infiltrantes.
8. No final da experiência, juntamente com planeadas análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído para confirmar a depleção de macrófagos por coloração imuno-histoquímica.

2. Derivação de macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea

1. A medula óssea de ratinhos entre 8 e 12 semanas de idade fornece o maior rendimento de osso derivadas de medula macrófagos. Euthanize o mouse, coloque-o em suas costas, e fechar as suas patas, esticando seus membros, tanto quanto possível.
2. Trabalhando em um estéril hood, remova o fémur ea tíbia, cortando tanto músculo como possível.
3. Lave medula de ossos utilizando IMDM com FCS 10% carregado para uma seringa de 5 ml equipado com uma agulha de calibre 26.
4. Diluir aspirados de medula óssea para 40 ml em IMDM com FCS 10%, as células lugar em um frasco de cultura de 75 centímetros ² de tecido, e incubar a 37 ° C, _5% de CO2 durante 4 horas. Este passo remove aderentes células mesenquimais ou macrófagos maduros a partir de progenitores hematopoiéticos.
5. Sobrenadante de cultura contendo transferência não-aderentes progenitores a um cónico de 50 ml tubo Falcon e centrifugar durante 5 min a 1200 rpm.
6. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml IMDM, FCS 10% e contar as células nucleadas, diluindo suspensão de células em 1 20 em ácido acético. Este procedimento lisa todas as células, incluindo células vermelhas do sangue e os núcleos restante pode ser contadas num hemocitómetro.
7. Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 10 ⁶ células / ml em meio completo; IMDM, FCS 10%, 150 uM monotioglicerol (MTG), e 10 ng / ml de MCSF, GM-CSF, ou IL-3. MCSF macrófagos derivados de macrófagos activados são classicamente enquanto os macrófagos GM-CSF ou IL-3-derivados são alternativamente activados.
8. Substituir médio em dias 4, fiação para baixo as células não aderentes e devolvê-las para o balão, e no dia 7, descartando as células não aderentes.
9. Além disso, IFNy (10 ng / ml) ou IL-4 (10 ng / ml) podem ser adicionados para frascos contendo MCSF células derivadas ao dia 7 de macrófagos inclinar para um. Classicamente activado ou um fenótipo alternativamente activados, respectivamente Incubar as células durante 3 dias.
10. No dia 10, meios de comunicação e remover levantar células fora do balão de cultura de tecidos utilizando tampão de dissociação celular (Gibco-BRL). O local de 5 ml de tampão em células durante 5 min à temperatura ambiente (18 ° C) e, em seguida, bater a parede lateral do balão com o calcanhar da palma da mão vezes firmemente vários. Assegurar que as células têm levantado para fora do frasco através da análise do balão sob umamicroscópio. Pipetar ressuspensas células em uma cónico de 15 ml tubo Falcon e lavar o frasco com um adicional de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscina e girar as células por 5 min a 300 × g.
11. Contar as células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro e ressuspender a uma concentração de 10 ⁷ células / ml em PBS estéril pH 7,4. Os macrófagos estão prontos para injeção em ratos.
12. Reserve 1,0 × 10 ⁶ macrófagos para a avaliação do fenótipo de macrófagos. Macrófagos activados Classicamente estimuladas com níveis elevados de lipopolissacarídeo secretam óxido nítrico e os níveis de IL-12p70 e baixos de IL-10 em comparação com os macrófagos alternativamente activados. Macrófagos alternativamente activados expressam constitutivamente YM1 e arginase I (Argi), que pode ser detectado por inmunotransferência.

3. Tranferring Macrófagos em Ratos

1. Ressuspender macrófagos em PBS estéril a uma concentração de 10 ⁷ células / ml. Isto permite a um eminjecção venosa de 10 ⁶ macrófagos em um volume total de 100 uL, que é um volume que pode ser segura e confortavelmente injectada em ratinhos pela veia da cauda.
2. Ratinhos quente usando uma almofada de aquecimento ou colo de calor durante 5-10 min para dilatar a veia da cauda. Monitore o mouse em todos os momentos de sinais de hipertermia.
3. Transferir o rato para um dispositivo de retenção que permite o acesso para as veias da cauda.
4. Rodar a cauda 90 ° de modo que a veia é voltada para cima. Veias corre lateralmente para baixo ambos os lados da cauda e, ou veia pode ser usado.
5. Limpar o local de injecção com uma compressa com álcool e injectar lentamente 100 ul (10 ⁶ macrófagos) usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 26 ou 28. Inserir a agulha com o lado voltado para cima bisel e com um ângulo ligeiro, quase paralelamente à veia.
6. Se a agulha é inserida corretamente nenhuma resistência deve ser sentida e da veia deve ficar claro após a injeção. Se a agulha não se encontra naveia, a cauda vai bojo. Se isso acontecer, remover a agulha e tente novamente proximal para a última tentativa ou na veia outro. Uma nova agulha deve ser utilizada para cada injecção como a cauda é resistente e as agulhas se tornar opaca rapidamente durante a injecção veia da cauda.
7. Após a injecção, retire a agulha, aplique uma leve pressão ao local da injeção até o sangramento parar, e monitorar o mouse para um 5min adicional para garantir que o sangramento parou.
8. Repita injecções de macrófagos cada 4 dias para assegurar um fornecimento contínuo de macrófagos polarizadas durante o procedimento experimental.
9. No final da experiência, juntamente com análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído ou de formalina para confirmar a entrega eficaz de macrófagos polarizados por coloração imuno-histoquímica.

4. Os resultados representativos

O número e fenótipo das macrop residentehages em qualquer dado tecido depende do tecido a ser examinado e irá alterar durante a infecção ou inflamação. Do mesmo modo, a capacidade do clodronato lipossomas contendo a esgotar macrófagos de um tecido vai depender da via de administração e entrega eficaz para o tecido alvo. Injecção intraperitoneal de resultados clodronato contendo lipossomas em uma diminuição no F4/80 ⁺ macrófagos no cólon do rato durante DSS induzida colite evidente por coloração imuno-histoquímica para o marcador de macrófagos, F4/80 (Figura 1A). Coloração histológica também pode ser utilizado para determinar diferenças quantitativas em número de macrófagos e fenótipo em secções de tecido. A Figura 1B mostra que uma média de 55% de macrófagos é esgotada por clodronato lipossomas contendo comparação com nenhuma depleção detectada em dois pontos de rato quando os ratinhos são injectados com PBS sozinho como um controlo de injecção. Cada valor é determinado pela contagem de F4/80 e Argi manchaed células positivas em cortes de tecido de série dos 6 camundongos com 3 pontos, em 3 seções por rato com a contagem que está sendo executada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. Estes resultados demonstram que injecções intraperitoneais de lipossomas clodronato empobrecem macrófagos de cólon em ratinhos.

Derivação de macrófagos da medula óssea na presença de factores de crescimento diferentes rendimentos macrófagos que são classicamente activados (MCSF-derivado ou MCSF-derivada e tratado com IFN-y) ou alternativamente activados (GM-CSF ou IL-3-derivada ou MCSF-derivada e tratados com IL-4). Lavagem da medula óssea a partir de 2 fémures e tíbias 2 a partir de um rato 8 semanas de idade normalmente produz 6 × 10 ⁷ células nucleadas por rato e os rendimentos de 8 × 10 ⁶ MCSF-macrófagos derivados de 10 × 10 ⁶ GM-CSF-macrófagos derivados, ou 12 × 10 ⁶ IL-3-macrófagos derivados. A Figura 2A mostra o nitrito eo rácio IL-12p70/IL-10 em macrófagos supernatants tratado com lipopolissacarídeo durante 24 horas Figura 2B mostra uma análise de mancha ocidental típica de 0,5 x 10 ⁶ MCSF macrófagos de + / -. IL-4 condições de derivação sondadas com anticorpos para marcadores de macrófagos alternativamente activados, Argi e YM1, ou com GAPDH como um carregamento de controle. Estes dados demonstram que derivadas da medula óssea macrófagos pode ser inclinado para um fenótipo polarizada durante derivação.

Transferência eficaz de ex vivo macrófagos derivados polarizados para um tecido é dependente da via de administração eo acesso ao tecido. Durante DSS induzida colite, macrófagos injectado por via intravenosa viajar para o local da inflamação e macrófagos alternativamente activados reduzir a gravidade da doença. Figura 3A mostra o número total de macrófagos e do número de macrófagos Argi + (alternativamente activados) contados em secções histológicas de ratinhos injectados com polarizada medula ósseaDerivado de macrófagos. O impacto da transferência de macrófagos polarizados para o cólon durante DSS induzida colite é mostrado pelo índice de actividade da doença, uma pontuação de aditivo com base na perda de peso, sangramento rectal, e consistência das fezes diminuiu (Figura 3B). Estes resultados demonstram que ex vivo derivado, macrófagos adotivamente transferidos podem tráfego para o cólon e inflamação induzida por impacto. Macrófagos M1 não impactar inflamação enquanto os macrófagos M2 reduzir significativamente o índice de atividade da doença.

Figura 1. Clodronato contendo lipossomas eficazmente empobrecem F4/80 + e F480 + + Argi células em dois pontos de rato in vivo. Uma geração F2 de ratinhos do tipo selvagem em um C57BL misto / 6 × fundo 129Sv foram dadas DSS 5% durante 7 dias e IP injectado com PBS (controlo) ou clodronato lipossomas contendo (clodronato) 4 dias antes da DSS tratamentoe nos dias 0, 2, 4, e 6, durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) eo marcador de macrófagos M2, Argi. (B) A determinação quantitativa de F4/80 + e Argi + de macrófagos. Células positivamente coradas foram contados por dois indivíduos cegos a condição experimental em uma ampliação de 40 × em 6 campos de 3 seções / mouse e de 6 ratos / grupo. * P <0,01.

Figura 2. MCSF macrófagos derivados de expressar um fenótipo classicamente activado e MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 expressar um fenótipo de macrófagos alternativamente activados. (A) Em conformidade com um fenótipo classicamente activado, MCSF macrófagos derivados de produzir níveis mais elevados de óxido nítrico em resposta a lipopolissacárido e pode ser medido pelo ensaio de Griess, que detecta o seu metabolito jusante nitrito,. Eles alsó produzir uma maior proporção IL-12p70/IL-10, que pode ser medido por ELISA. * P <0,01 para n = 3. (B) Em conformidade com um fenótipo alternativamente activados, MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 constitutivamente expresso YM1 e Argi, que pode ser detectado por imunotransferência Western. Os dados são representativos de 3 experiências independentes com resultados semelhantes.

Figura 3. Injectado por via intravenosa, ex-vivo derivado alternativamente activados tráfego macrófagos para o cólon e reduzir a inflamação intestinal. Uma geração F2 de ratos selvagens em um misto C57BL / 6 × 129Sv fundo foram dadas 5 DSS% na água de beber durante seis dias. Macrófagos M1 e M2 foram injetados IV nos dias 0 e 4 durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) e um marcador de macrófagos M2 (Argi).A determinação quantitativa dos macrófagos para ratinhos de controlo de PBS injectados (C), ratinhos injectados com macrófagos M1 (+ M1) e ratinhos injectados com macrófagos M2 (+ M2) foram realizadas por contagem de células coradas positivamente a uma ampliação de 40 × em 6 campos a partir de 3 secções / ratinho ea partir de 6 ratinhos / grupo. Contagem foi realizada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. (B) A atividade da doença foi monitorada e marcou diário durante o tratamento e é uma pontuação aditivo com base na perda de peso, sangramento retal, e consistência das fezes diminuiu. * P <0,05 para n = 6 ratos em 2 experimentos independentes.

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Discussão

Os macrófagos são células fagocíticas que desempenham um papel importante no sistema imune. Eles são responsáveis ​​por iniciar a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Tipicamente, os macrófagos activados classicamente são activados por IFNy ou LPS e são responsáveis ​​pela eliminação de patógenos e montar uma resposta inflamatória ^1. Inversamente, os macrófagos alternativamente activados são activados por IL-4 ou IL-13 e desempenhar um papel na detritos de limp...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
O clodronato lipossomas contendo	Clodronateliposomes.org
PBS contendo lipossomas	Clodronateliposomes.org
PBS estéril pH 7,4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Soro fetal de vitelo (FCS)	Invitrogen	12483
ácido acético	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monotioglicerol (MTG)	Sigma	96-275
Recombinant murino MCSF	Stemcell Technologies	02951
Recombinante murino GM-CSF	Stemcell Technologies	02935
Recombinante IL-3 murina	Stemcell Technologies	02903
Recombinante murino IFN-y	Stemcell Technologies	02746
Recombinante IL-4 de murídeo	Stemcell Technologies	02714
Tampão de dissociação celular	Invitrogen	13150-016
Rato anti-F4/80 Anticorpo	Abd Serotec	MCA497GA
Rato de anticorpos anti-Argi	Transdução de Laboratórios BD	610708