Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Zusammenfassung

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von Makrophagen In-vivo-, Ableiten polarisierte Makrophagen aus Knochenmarkaspirate und adoptiv Übertragung Makrophagen in Mäusen. Diese Techniken erlauben die Bestimmung der Rolle, die polarisierte Makrophagen spielen in Gesundheit und Krankheit.

Zusammenfassung

Makrophagen sind wichtige Akteure der angeborenen Immunantwort auf infektiöse Herausforderung oder Verletzungen, Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Macrophage Dysfunktion kann zu einer Unfähigkeit führen, um eine geeignete Immunantwort und als solche ist in vielen Krankheitsprozessen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt ist. Makrophagen zeigen polarisiert Phänotypen, die grob in zwei Kategorien unterteilt sind. Klassisch aktivierten Makrophagen, aktiviert durch Stimulation mit IFN-oder LPS, spielen eine wesentliche Rolle in Reaktion auf bakterielle Herausforderung während alternativ aktivierten Makrophagen, aktiviert durch IL-4 oder IL-13, in Schutt und Scavenging Gewebeumbildung teilnehmen und wurden in der Auflösung in Verbindung gebracht Phase der Entzündung. Während einer Entzündungsreaktion in vivo werden Makrophagen unter einem komplexen Gemisch von infiltrierenden Immunzellen und kann durch Verschärfung oder Resolvin Teilnahmeg Entzündung. Um die Rolle von Makrophagen in situ definiert in einem ganzen Tier-Modell ist es notwendig, die Wirkung der Erschöpfung Makrophagen aus dem komplexen Umgebung zu untersuchen. Um Fragen über die Rolle von Makrophagen-Phänotyp in situ fragen, können phänotypisch definierten polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet werden, aus Knochenmarkaspirate und wieder hinzugefügt, um Mäuse, mit oder ohne vorherige Depletion von Makrophagen. In der hier dargestellten Protokoll Clodronat-haltigen Liposomen, gegen PBS injiziert Kontrollen wurden verwendet, um Kolon Makrophagen während Dextran Natriumsulfat (DSS)-induzierte Colitis bei Mäusen führen. Darüber hinaus wurden polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet und in Mäusen durch intravenöse Injektion. Ein Vorbehalt bei diesem Ansatz ist, dass Clodronat-haltige Liposomen führen alle professionellen Phagozyten, einschließlich der beiden dendritischen Zellen und Makrophagen so zu gewährleisten, die Wirkung durch eine Verarmung zu beobachten ist Makrophagen-spezifische, Rekonstitution of Phänotyp durch adoptiven Transfer von Makrophagen erforderlich ist. Systemische Makrophagen-Depletion bei Mäusen auch durch Rückkreuzung Mäusen auf eine CD11b-DTR Hintergrund erreicht werden kann, ist das eine ausgezeichnete Ergänzung. Der Vorteil von Clodronat-haltigen Liposomen-vermittelte Abreicherung ist, dass es nicht erforderlich, die Zeit und Kosten bei Rückkreuzung Mäusen beteiligt und es kann in Mäusen verwendet, unabhängig von dem Hintergrund der Mäuse (C57BL / 6, BALB / c oder gemischte Hintergund ).

Protokoll

1. Depleting Makrophagen mit Clodronat-haltige Liposomen

1. Liposomen werden bei 4 ° C gelagert Zwei Stunden vor der Injektion, zu entfernen Clodronat-haltigen Liposomen, PBS-enthaltenden Liposomen oder sterilem PBS (Einspritzsteuerung) aus dem Kühlschrank, damit sie auf Raumtemperatur (18 ° C) zu gewöhnen.
2. Kehren Sie die Röhrchen mit Liposomen 8-10 mal um eine gleichmäßige Verteilung vor dem Einlegen in 200 pl einer 1 ml Spritze zu gewährleisten. Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an die Spitze der Spritze.
3. Mit der linken Hand, scruff die Maus unter den Ohren hält genug Haut, ihre Kopf-und Gliederschmerzen zu immobilisieren.
4. Kippen Sie die Maus so sein Kopf ist leicht in Richtung Boden, so innere Organe weg von der Injektionsstelle, die in der rechten unteren Quadranten des Abdomens befindet.
5. Rollen Sie die Spritze zwischen Ihren Handflächen und invertieren Sie 6-mal um die Liposomen-Lösung gleichmäßig vor der Injektion zu verteilen.
6. Führen Sie die Nadel in der rechten unteren Seite der Maus Bauch zu einem Winkel von 30-40 Grad. Injizieren Sie 200 ul Liposomen-Lösung oder PBS.
7. Während einer Entzündung Modell, wie DSS-induzierter Kolitis, injizieren Mäuse 4 Tage vor Beginn der experimentellen Entzündung zur Depletion von Makrophagen und alle 2 Tage während des Protokolls zum neuen infiltrierenden Makrophagen führen zu gewährleisten.
8. Am Ende des Experiments, zusammen mit geplanten experimentellen Analysen, Gewebe zu entfernen von der Website von Interesse und fixieren mit Paraformaldehyd zu Makrophagen-Depletion durch immunhistochemische Färbung zu bestätigen.

2. Ableitung von Polarized Makrophagen aus Knochenmarkaspirate

1. Knochenmark von Mäusen zwischen 8 und 12 Wochen alt bietet die höchste Ausbeute von Knochenmark abgeleiteten Makrophagen. Euthanize die Maus, legen Sie es auf seinem Rücken, und festzunageln den Pfoten, Stretching seine Glieder so weit wie möglich.
2. Die Arbeit in einem sterilen hood, zu entfernen Oberschenkel-und Unterschenkelknochen, Wegschneiden so viel Muskelmasse wie möglich.
3. Flush Mark aus Knochen mit IMDM mit 10% FCS in ein 5 ml-Spritze mit einer 26 Gauge-Nadel eingepasst wird.
4. Verdünnen Sie Knochenmarkaspirate bis 40 ml in IMDM mit 10% FCS, Platz Zellen in einem 75 cm ² Zellkulturflasche, und inkubieren Sie bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 4 Stunden. Dieser Schritt entfernt adhärenten mesenchymalen Zellen oder Makrophagen, die von reifen hämatopoetischen Vorläuferzellen.
5. Übertragen Kulturüberstand, die nicht-adhärenten Vorläuferzellen in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben Falcon-Röhrchen und für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute.
6. Resuspendieren Zellpellet in 5 ml IMDM, 10% FCS und zählen kernhaltigen Zellen durch Verdünnung Zellsuspension von 1 zu 20 in Essigsäure. Dieses Verfahren lysiert alle Zellen, einschließlich roter Blutzellen und die verbleibenden Kerne auf einem Hämocytometer gezählt werden können.
7. Die Zellen in einer Konzentration von 0,5 × 10 ⁶ Zellen / ml in vollständigem Medium, IMDM, 10% FCS, 150 uM Monothioglycerin (MTG), und 10 ng / ml entweder MCSF, GM-CSF oder IL-3. MCSF abgeleiteten Makrophagen sind klassisch Makrophagen aktiviert, während GM-CSF oder IL-3-Makrophagen alternativ aktiviert werden.
8. Ersetzen Medium an Tag 4, zum Stillstand kommen, nicht adhärente Zellen und sie dann wieder in den Kolben, und am Tag 7, Verwerfen nicht-haftenden Zellen.
9. Darüber hinaus kann IFN (10 ng / ml) oder mit IL-4 (10 ng / ml), um Flaschen zu MCSF abgeleiteten Zellen am Tag 7 zu neigen Makrophagen aufgenommen werden klassisch aktiviert oder alternativ aktivierten Phänotyp, jeweils. Inkubieren Sie die Zellen für 3 Tage.
10. Am Tag 10, zu entfernen Medien und heben Zellen aus der Zellkulturflasche mit Zelldissoziation Buffer (Gibco-BRL). Platz 5 ml Puffer auf die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur (18 ° C) und dann hauen die Seite der Kolben mit dem Handballen mehrmals kräftig. Sicherstellen, dass die Zellen aus der Flasche durch Prüfung der Kolben unter angehobenMikroskop. Pipettieren resuspendiert Zellen in einem 15 ml konischen Falcon-Röhrchen und wobei man den Kolben mit einem zusätzlichen 10 ml IMDM, 10% FBS. Pool und Spin-down die Zellen für 5 min bei 300 × g.
11. Anzahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren in einer Konzentration von 10 ⁷ Zellen / ml in steriler PBS pH 7,4. Makrophagen sind bereit für die Injektion in Mäuse.
12. Reserve 1,0 × 10 ⁶ Makrophagen für die Bewertung der Makrophagen-Phänotyp. Klassisch aktivierten Makrophagen sezernieren mit Lipopolysaccharid hohe Stickoxid und IL-12p70 und niedrige Spiegel von IL-10 stimuliert, um alternativ aktivierten Makrophagen verglichen. Alternativ aktivierten Makrophagen konstitutiv YM1 und Arginase I (Argi), die durch Western-Immunoblotting nachgewiesen werden kann.

3. Uberweisung Makrophagen in Mäuse

1. Resuspendieren Makrophagen in sterilem PBS bei einer Konzentration von 10 ⁷ Zellen / ml. Dies ermöglicht eine inintravenös Injektion von 10 ⁶ Makrophagen in einem Gesamtvolumen von 100 ul, die ein Volumen, das sicher und komfortabel in Mäuse können durch die Schwanzvene injiziert ist.
2. Warm-Mäuse mit einem Heizkissen oder Hitze Runde für 5-10 min, um die Schwanzvene erweitern. Überwachen Sie die Maus jederzeit auf Anzeichen von Hyperthermie.
3. Übertragen Sie die Maus auf eine Haltevorrichtung, die Zugriff auf den Schwanzvenen erlaubt.
4. Drehen Sie den Schweif 90 °, so dass die Vene nach oben zeigt. Venen laufen seitlich nach unten beiderseits des Schwanzes und entweder Vene eingesetzt werden kann.
5. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und langsam injizieren 100 ul (10 ⁶ Makrophagen) mit einer 1 ml Spritze mit einer 26 oder 28 Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel mit der Schräge nach oben und in einem leichten Winkel, fast parallel zur Ader.
6. Wenn die Nadel richtig eingesetzt wird, sollte kein Widerstand zu spüren und die Vene sollte sich nach der Injektion deutlich. Wenn die Nadel nicht in derVene, wird der Schwanz Ausbuchtung. Wenn dies geschieht, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut proximal der letzte Versuch oder in der anderen Vene. Eine neue Nadel muss für jede Injektion verwendet werden, da der Schwanz ist hart und die Nadeln werden stumpf schnell bei Injektion in die Schwanzvene.
7. Nach der Injektion die Nadel entfernen, sanften Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung stoppt, und überwachen Sie die Maus für eine weitere 5min um sicherzustellen, dass Blutung aufgehört hat.
8. Wiederholen Sie die Makrophagen-Injektionen alle 4 Tage, um eine kontinuierliche Lieferung von polarisiertem Makrophagen während der Versuchsdurchführung zu gewährleisten.
9. Am Ende des Experiments, mit experimentellen Analysen zu entfernen Gewebe von der Stelle von Interesse setzen und mit Paraformaldehyd oder Formalin eine effektive Bereitstellung von polarisiertem Makrophagen durch immunhistochemische Färbung zu bestätigen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Anzahl und Phänotyp der Bewohner macropHages in einem bestimmten Gewebe ist abhängig von dem Gewebe, das geprüft und wird während der Infektion oder Entzündung zu ändern. In ähnlicher Weise wird die Fähigkeit von Clodronat-haltigen Liposomen zu Makrophagen aus einem Gewebe führen auf der Route der Verabreichung und effektive Abgabe an das Zielgewebe abhängen. Die intraperitoneale Injektion von Clodronat-haltigen Liposomen führt zu einer Abnahme der F4/80 ⁺ Makrophagen in der Maus Kolons bei DSS-induzierter Colitis deutlich durch immunhistochemische Färbung für die Makrophagen-Marker, F4/80 (1A). Histologische Färbung kann ebenfalls verwendet werden, um quantitative Unterschiede in Anzahl und Makrophagen-Phänotyp in Gewebeschnitten zu bestimmen. 1B zeigt, dass ein Durchschnitt von 55% von Makrophagen durch Clodronat-Liposomen im Vergleich zu ohne Verarmungserhöhungs in Maus Doppelpunkte erkannt verarmt ist, wenn Mäuse mit eingespritzt PBS allein als Einspritz-Steuerung. Jeder Wert wird durch Auszählen F4/80 und Argi Fleck bestimmtED-positiven Zellen in Gewebeschnitten von seriellen 6 Mäusen an 3 Punkten, in 3 Abschnitte pro Maus mit dem Zählen von zwei Personen geblendet zu experimentellen Bedingungen durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass intraperitoneale Injektionen von Clodronat-Liposomen Kolon-Makrophagen in Mäusen führen.

Ableitung von Makrophagen aus dem Knochenmark in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren Ausbeuten Makrophagen, die klassisch aktiviert werden (MCSF gewonnenen oder MCSF abgeleiteten und mit IFN) oder alternativ aktiviert (GM-CSF oder IL-3-abgeleiteten oder MCSF-abgeleitet und Behandlung mit IL-4). Flushing Knochenmark aus zwei Oberschenkel-und Unterschenkelknochen 2 aus einem 8 Wochen alten Maus liefert typischerweise 6 × 10 ⁷ kernhaltige Zellen pro Maus und Renditen 8 × 10 ⁶ MCSF abgeleiteten Makrophagen, 10 × 10 ⁶ GM-CSF-abgeleiteten Makrophagen, oder 12 × 10 ⁶ IL-3-Makrophagen. 2A zeigt die Nitrit-und IL-12p70/IL-10 Verhältnis in Makrophagen supernatants mit Lipopolysaccharid für 24 Stunden behandelt 2B zeigt eine typische Western-Blot-Analyse von 0,5 × 10 ⁶ Makrophagen aus MCSF + / -. IL-4 Ableitung Bedingungen mit Antikörpern, um alternativ aktivierten Makrophagen-Marker, Argi, YM1, oder GAPDH als Ladekontrolle. Diese Daten zeigen, dass Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen zu einer polarisierten Phänotyp während der Ableitung verdreht werden kann.

Effektive Übertragung von ex vivo abgeleitet polarisierte Makrophagen an ein Gewebe ist abhängig von der Art der Verabreichung und den Zugang zu dem Gewebe. Während DSS-induzierter Colitis, injiziert Makrophagen intravenös zu reisen, um den Ort der Entzündung und alternativ aktivierten Makrophagen zu reduzieren Schwere der Erkrankung. 3A zeigt die Anzahl von Makrophagen und die Anzahl der Argi + (alternativ aktiviert) Makrophagen in histologischen Schnitten von Mäusen gezählt mit polarisiertem injiziert Knochenmark-Makrophagen. Die Auswirkungen der Übertragung von polarisierte Makrophagen auf den Dickdarm während der DSS-induzierter Kolitis wird durch Disease Activity Index, ein Additiv Punktzahl auf den Gewichtsverlust, rektale Blutungen und verminderte Stuhlkonsistenz (3B), basierend gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass ex vivo abgeleitet, adoptiv übertragen Makrophagen kann der Verkehr auf den Dickdarm und die Auswirkungen einer Entzündung geführt. M1 Makrophagen haben keine Auswirkungen auf Entzündungen, während M2 Makrophagen signifikant reduzieren Disease Activity Index.

Abbildung 1. Clodronat-haltige Liposomen effektiv führen und F4/80 + F480 + Argi + Zellen in Maus Doppelpunkte in vivo. Ein F2-Generation von Wildtyp-Mäusen auf einem gemischten C57BL / 6 × 129Sv Hintergrund wurden 5% DSS für 7 Tage und ip injiziert gegeben mit PBS (Kontrolle) oder Clodronat-haltige Liposomen (Clodronat) 4 Tage vor der Behandlung DSSund an den Tagen 0, 2, 4 und 6 während DSS-Behandlung. (A) Doppelpunkte entfernt wurden, fixiert, und die Schnitte wurden durch Immunhistochemie für reife Makrophagen (F4/80) und der Makrophagen-Marker M2, Argi gefärbt. (B) Quantifizierung von F4/80 + und Argi + Makrophagen. Positiv gefärbte Zellen wurden durch zwei Personen blind für experimentellen Bedingungen bei 40-facher Vergrößerung in 6 Felder von 3 Teilen / Maus und 6 Mäuse / Gruppe gezählt. * P <0,01.

Abbildung 2. MCSF abgeleiteten Makrophagen exprimieren ein klassisch aktivierten Phänotyp und MCSF abgeleiteten Makrophagen mit IL-4 behandelt Ausdruck einer alternativ aktivierten Makrophagen-Phänotyp. (A) in Übereinstimmung mit einer klassisch aktiviert Phänotyp erzeugen MCSF abgeleiteten Makrophagen höheren Stickoxid in Reaktion auf Lipopolysaccharid und kann durch die Griess-Assay, die die stromabwärtigen Metabolit, Nitrit erkennt gemessen werden. Sie ALSo erzeugen einen höheren IL-12p70/IL-10 Verhältnis, das durch ELISA gemessen werden kann. * P <0,01 für n = 3. (B) In Übereinstimmung mit einer alternativ aktivierten Phänotyp, MCSF abgeleiteten Makrophagen mit IL-4 konstitutiv YM1 und Argi behandelt, was durch Western Immunoblotting nachgewiesen werden. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit ähnlichen Ergebnissen.

Abbildung 3. Intravenöse injizierten, ex vivo gewonnenen alternativ Makrophagen-Verkehr auf den Dickdarm aktiviert und reduzieren Darmentzündungen. Ein F2-Generation von Wildtyp-Mäusen auf einem gemischten C57BL / 6 × 129Sv Hintergrund wurden 5% DSS im Trinkwasser für sechs Tage gegeben. M1 und M2 Makrophagen wurden iv an den Tagen 0 und 4 injiziert während DSS-Behandlung. (A) Doppelpunkte entfernt wurden, fixiert, und die Schnitte wurden durch Immunhistochemie für reife Makrophagen (F4/80) und einem M2 Makrophagen-Marker (Argi) gefärbt.Die Quantifizierung von Makrophagen zur Steuerung PBS-injizierten Mäusen (C) wurden die Mäuse mit M1 Makrophagen (+ M1) und Mäusen, die mit M2 Makrophagen (+ M2) eingespritzt durch Zählen positiv gefärbten Zellen bei 40-facher Vergrößerung in 6 Felder von 3 Teilen / Maus durchgeführt und von 6 Mäusen / Gruppe. Zählen wurde von zwei Personen geblendet zu experimentellen Bedingungen durchgeführt. (B) Die Krankheitsaktivität wurde überwacht und täglich während der Behandlung erzielt und ist ein Additiv Punktzahl auf den Gewichtsverlust, rektale Blutungen und verminderte Stuhlkonsistenz basiert. * P <0,05 für n = 6 Mäuse in zwei unabhängigen Experimenten.

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Diskussion

Makrophagen sind Phagozyten, die eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen. Sie sind verantwortlich für die Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Typischerweise werden klassisch aktivierten Makrophagen durch IFN oder LPS aktiviert und sind für die Beseitigung von Pathogenen und zum Montieren eines Entzündungsreaktion ^1. Umgekehrt werden alternativ aktivierten Makrophagen durch IL-4 oder IL-13 aktiviert und spielen eine Rolle in Schutt und Scavenging Gewebeum...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Clodronat-haltige Liposomen	Clodronateliposomes.org
PBS-haltigen Liposomen	Clodronateliposomes.org
Sterilem PBS pH-Wert 7,4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Fötalem Kälberserum (FCS)	Invitrogen	12483
Essigsäure	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monothioglycerol (MTG)	Sigma	96-275
Recombtionsabhängig murinen MCSF	StemCell Technologies	02951
Rekombinantes murines GM-CSF	StemCell Technologies	02935
Rekombinantes Mäuse-IL-3	StemCell Technologies	02903
Rekombinantes murines IFN	StemCell Technologies	02746
Rekombinantes murines IL-4	StemCell Technologies	02714
Zelldissoziation Buffer	Invitrogen	13150-016
Ratten-Antikörper anti-F4/80	AbD Serotec	MCA497GA
Maus-Antikörper anti-Argi	BD Transduction Laboratories	610708