Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Riepilogo

I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i macrofagi In vivo, Derivanti da macrofagi polarizzati aspirati di midollo osseo, e trasferendo adoptively macrofagi in topi. Queste tecniche consentono la determinazione del ruolo che i macrofagi polarizzati svolgono nella salute e nella malattia.

Abstract

I macrofagi hanno un ruolo critico nella risposta immunitaria innata alla sfida infettiva o lesioni, iniziando la risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Macrofagi disfunzione può comportare l'impossibilità di montare una risposta immunitaria appropriata e, come tale, è stata implicata in molti processi patologici, quali le malattie infiammatorie intestinali. I macrofagi visualizzare fenotipi polarizzati che sono approssimativamente suddivise in due categorie. Classicamente macrofagi attivati, attivato dalla stimolazione con LPS o IFNy, svolgono un ruolo essenziale nella risposta alla sfida batterica che macrofagi attivati ​​alternativamente, attivato da IL-4 o IL-13, partecipare detriti scavenging e rimodellamento tissutale e sono stati implicati nella risoluzione fase di infiammazione. Durante una risposta infiammatoria in vivo, i macrofagi si trovano in mezzo a una miscela complessa di infiltrare cellule del sistema immunitario e possono partecipare mediante l'esasperazione o resolving infiammazione. Per definire il ruolo di macrofagi in situ in un modello animale intero, è necessario esaminare l'effetto di esaurire macrofagi dall'ambiente complesso. Per porre domande circa il ruolo del fenotipo dei macrofagi in situ, fenotipicamente definite macrofagi polarizzati, può essere derivata ex vivo, da aspirati di midollo osseo e aggiunto nuovamente ai topi, con o senza previa deplezione dei macrofagi. Nel protocollo qui presentata clodronato liposomi contenenti, rispetto ai controlli iniettati PBS, sono stati utilizzati per esaurire macrofagi colon durante destrano solfato sodico (DSS)-colite indotta nei topi. Inoltre, macrofagi polarizzati sono stati ottenuti ex vivo e trasferito topi mediante iniezione endovenosa. Un avvertimento di questo approccio è che clodronato contenenti liposomi esaurire tutte le fagociti professionali, comprese sia le cellule dendritiche ei macrofagi in modo da garantire l'effetto osservato da deplezione dei macrofagi è specifico, la ricostituzione of fenotipo mediante trasferimento adottivo di macrofagi è necessario. Deplezione macrofagi nei topi possono anche essere ottenuto topi reincrocio su un CD11b-DTR fondo, che è un ottimo approccio complementare. Il vantaggio di clodronato contenente mediata da liposomi esaurimento è che non richiede il tempo ei costi legati in topi reincrocio e può essere utilizzato in topi indipendentemente dal fondo dei topi C57BL / 6, BALB / c, o sfondo mista ).

Protocollo

1. I macrofagi riducono Utilizzo clodronato contenenti liposomi

1. I liposomi vengono conservati a 4 ° C. Due ore prima dell'iniezione, rimuovere clodronato contenenti liposomi, PBS contenenti liposomi, o PBS sterile (iniezione controllo) dal frigorifero per consentire loro di la temperatura ambiente (18 ° C).
2. Invertire le provette contenenti liposomi 8-10 volte per assicurare una distribuzione uniforme prima di caricare 200 pl in una siringa da 1 ml. Attaccare a 26 gauge all'inizio della siringa.
3. Utilizzando la sinistra, nuca del mouse appena sotto le orecchie in possesso di pelle abbastanza per immobilizzare la testa e gli arti.
4. Inclinare il mouse modo che la sua testa è leggermente verso il suolo in modo organi interni allontanarsi dal sito di iniezione, che si trova nel quadrante inferiore destro dell'addome.
5. Arrotolare la siringa tra i palmi delle mani e capovolgere 6 volte per distribuire uniformemente la soluzione di liposomi prima dell'iniezione.
6. Inserire l'ago nella parte in basso a destra dell'addome del mouse ad un angolo di 30-40 gradi. Iniettare 200 pl di soluzione di liposomi o PBS.
7. Nel corso di un modello sperimentale di infiammazione indotta, come la colite indotta da DSS, iniettare topi 4 giorni prima della comparsa di infiammazione sperimentale per garantire la deplezione dei macrofagi residenti e ogni 2 giorni durante il protocollo di esaurire nuovi macrofagi infiltranti.
8. Alla fine dell'esperimento, insieme con previste analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide per confermare esaurimento macrofagi con colorazione immunoistochimica.

2. Derivazione dei macrofagi polarizzati da aspirati di midollo osseo

1. Il midollo osseo di topi tra gli 8 e 12 settimane di età fornisce il più alto rendimento di midollo osseo macrofagi. Euthanize il mouse, si trovava sulla sua schiena, e definire con precisione le sue zampe, che si estende gli arti, per quanto possibile.
2. Lavorare in uno sterile hood, rimuovere femore e tibia, tagliando via come muscolo più possibile.
3. Midollo filo da ossa utilizzando IMDM con 10% FCS caricato in una siringa da 5 ml dotato di un ago calibro 26.
4. Diluire midollo osseo aspira a 40 ml in IMDM con 10% FCS, cellule posto in un centimetro 75 ² pallone di coltura tissutale, e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ per 4 ore. Questo passaggio rimuove aderenti cellule mesenchimali o macrofagi maturi da progenitori ematopoietici.
5. Trasferire il surnatante di coltura contenente non aderenti progenitori ad un tubo da 50 ml conica Falcon e centrifugare per 5 min a 1200 rpm.
6. Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di IMDM, 10% FCS e contare le cellule nucleate diluendo sospensione cellulare 1 a 20 in acido acetico. Questa procedura lisa tutte le cellule, comprese le cellule rosse del sangue e dei nuclei restante può essere contato su un emocitometro.
7. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 10 ⁶ cellule / ml in mezzo completo; IMDM, 10% FCS, 150 monotioglicerolo pM (MTG), e 10 ng / ml o di MCSF, GM-CSF o IL-3. MCSF derivati ​​da macrofagi attivati ​​sono classicamente macrofagi, mentre i macrofagi GM-CSF o IL-3-derivati ​​sono attivati ​​alternativamente.
8. Sostituire media al giorno 4, riducendo la velocità cellule non aderenti e restituirli al pallone, e al 7 ° giorno, scartando cellule non aderenti.
9. Inoltre, IFNy (10 ng / ml) o IL-4 (10 ng / ml) può essere aggiunto a fiasche contenenti MCSF cellule derivate al giorno 7 di macrofagi un'inclinazione a un classico attivato o un fenotipo alternativa attivato, rispettivamente. Incubare le cellule per altri 3 giorni.
10. Al giorno 10, rimuovere i supporti e sollevare le cellule fuori del pallone di coltura tissutale con dissociazione cellulare Buffer (Gibco-BRL). Porre 5 ml di tampone sulle cellule per 5 min a temperatura ambiente (18 ° C) e poi battere il lato del pallone con il tallone del palmo della mano più volte fino. Assicurarsi che le cellule hanno sollevato del pallone esaminando il pallone sottomicroscopio. Pipettare risospese le cellule in una provetta da 15 ml Falcon e lavare il pallone con un ulteriore 10 ml di IMDM, 10% FBS. Pool e far girare le cellule per 5 min a 300 × g.
11. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e risospendere ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml in PBS sterile pH 7,4. I macrofagi sono pronti per l'iniezione in topi.
12. Riserva 1.0 × 10 ⁶ macrofagi per la valutazione del fenotipo dei macrofagi. Classicamente macrofagi attivati ​​stimolati con lipopolisaccaridi secernono livelli elevati di ossido nitrico e dei livelli di IL-12p70 e bassi livelli di IL-10 rispetto ai macrofagi attivati ​​alternativamente. In alternativa macrofagi attivati ​​esprimono costitutivamente YM1 e arginasi I (Argi), che può essere rilevato da Western immunoblotting.

3. Tranferring macrofagi in topi

1. Macrofagi Risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml. Ciò permette una intravenous iniezione di 10 ⁶ macrofagi in un volume totale di 100 pl, che è un volume che può essere sicurezza e comodità iniettate in topi dalla vena caudale.
2. Topi calda usando una piastra elettrica o di calore giro per 5-10 min per dilatare la vena della coda. Monitorare il mouse in qualsiasi momento per i segni di ipertermia.
3. Trasferire il mouse per un apparecchio di contenzione che permette l'accesso alle vene della coda.
4. Ruotare la coda di 90 ° in modo che la vena è rivolta verso l'alto. Vene eseguire lateralmente su entrambi i lati della coda e sia vena può essere utilizzato.
5. Pulire il sito di iniezione con un tampone imbevuto di alcol e lentamente iniettare 100 microlitri (10 ⁶ macrofagi) con una siringa da 1 ml con un ago calibro 26 o 28. Inserire l'ago con il lato smusso rivolto verso l'alto e con una leggera angolazione, quasi parallela alla vena.
6. Se l'ago è inserito correttamente non resistenza dovrebbe essere sentito e la vena dovrebbe essere chiaro dopo l'iniezione. Se l'ago non è nellavena, la coda si rigonfiamento. In questo caso, rimuovere l'ago e riprovare prossimale l'ultimo tentativo o in altra vena. Un nuovo ago deve essere utilizzato per ogni iniezione, come la coda è dura e gli aghi diventare opachi rapidamente durante l'iniezione coda vena.
7. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago, applicare una leggera pressione sul sito dell'iniezione, fino a quando il sanguinamento si arresta, e controllare il mouse di un ulteriore 5 minuti per garantire che il sanguinamento si è fermato.
8. Ripetere le iniezioni macrofagi ogni 4 giorni per garantire una erogazione continua di macrofagi polarizzati durante la procedura sperimentale.
9. Alla fine dell'esperimento, insieme con analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide o formalina per confermare la consegna efficace di macrofagi polarizzati mediante colorazione immunoistochimica.

4. Risultati rappresentativi

Il numero e fenotipo di macrop residentehages in ogni dato tessuto dipende dal tessuto in esame e cambierà durante l'infezione o infiammazione. Analogamente, la capacità di clodronato liposomi contenenti da esaurire macrofagi da un tessuto dipenderà dalla via di somministrazione e consegna efficace al tessuto bersaglio. Iniezione intraperitoneale di clodronato contenenti risultati liposomi in una diminuzione F4/80 ⁺ macrofagi nel colon mouse durante DSS-colite indotta evidenti dalla colorazione immunoistochimica per il marcatore macrofagi, F4/80 (Figura 1A). Colorazione istologica può anche essere usato per determinare differenze quantitative numero macrofagi e fenotipo in sezioni di tessuto. Figura 1B mostra che una media del 55% dei macrofagi è impoverito dalla clodronato liposomi contenenti rispetto al non deplezione rilevato in due punti topo quando i topi sono iniettati con PBS da solo come un controllo dell'iniezione. Ogni valore è determinato dal conteggio F4/80 e Argi macchiaEd cellule positive in sezioni di tessuto seriali topi da 6 a 3 punti, in 3 sezioni per il mouse con il conteggio viene effettuato da due individui ciechi alle condizioni sperimentali. Questi risultati dimostrano che iniezioni intraperitoneali di liposomi clodronato riducono macrofagi colon nei topi.

Determinazione dei macrofagi da midollo osseo in presenza di diversi fattori di crescita rese macrofagi che sono classicamente attivati ​​(MCSF-derivato o MCSF-derivati ​​e trattati con IFNy) o in alternativa attivato (GM-CSF o IL-3-derivato o MCSF-derivati ​​e trattati con IL-4). Flushing midollo osseo da 2 femore e tibia 2 da un mouse 8 settimane vecchia produce tipicamente 6 × 10 ⁷ cellule nucleate per il mouse e le rese 8 × 10 ⁶ MCSF derivate dai macrofagi, 10 × 10 ⁶ GM-CSF-derivate dai macrofagi, o 12 × 10 ⁶ IL-3-macrofagi derivati. Figura 2A mostra nitrito e il rapporto IL-12p70/IL-10 in macrofagi supernatants trattati con lipopolisaccaride per 24 ore 2B La figura mostra una tipica analisi Western blot di 0,5 × 10 ⁶ macrofagi da MCSF + / -. IL-4 condizioni di derivazione sondato con gli anticorpi per marcatori macrofagi attivati, in alternativa, Argi, i YM1, o con GAPDH come carico di controllo. Questi dati dimostrano che dal midollo osseo macrofagi può essere inclinato ad un fenotipo polarizzato durante la derivazione.

Efficace trasferimento di ex vivo macrofagi derivati ​​polarizzate ad un tessuto dipende dalla via di somministrazione e l'accesso al tessuto. Durante DSS-indotta colite, macrofagi iniettato per via endovenosa recarsi nel sito di infiammazione e macrofagi alternativamente attivati ​​ridurre la gravità della malattia. Figura 3A mostra il numero totale di macrofagi e il numero di macrofagi Argi + (in alternativa attivato) contate in sezioni istologiche da topi iniettati con polarizzata midollo osseo-Macrofagi derivati. L'impatto di trasferimento di macrofagi polarizzati al colon durante DSS-colite indotta è mostrato per indice di attività della malattia, un punteggio additivo basato sulla perdita di peso, emorragia rettale, e consistenza delle feci diminuita (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che ex vivo derivato, macrofagi adoptively trasferiti può traffico al colon e infiammazione indotta impatto. Macrofagi M1 non influenzare l'infiammazione, mentre i macrofagi M2 ridurre in modo significativo Disease Activity Index.

Figura 1. Clodronato contenente liposomi in modo efficace e riducono F4/80 + F480 + + Argi cellule in due punti del mouse in vivo. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × sfondo 129Sv è stata data al 5% DSS per 7 giorni e IP iniettato con PBS (controllo) o clodronato contenenti liposomi (clodronato) 4 giorni prima del DSS trattamentoe ai giorni 0, 2, 4 e 6 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e il marcatore dei macrofagi M2, Argi. (B) La determinazione quantitativa di F4/80 Argi + + e macrofagi. Cellule colorate positivamente sono stati contati da due persone in cieco per condizione sperimentale a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / mouse e da 6 topi / gruppo. * P <0,01.

Figura 2. MCSF-macrofagi derivati ​​esprimere un fenotipo classicamente attivato e MCSF derivati ​​macrofagi trattati con IL-4 esprimere un fenotipo macrofagi attivati ​​alternativamente. (A) In accordo con un fenotipo classicamente attivato, MCSF derivati ​​macrofagi producono alti livelli di ossido nitrico in risposta al lipopolisaccaride e può essere misurata con il test Griess, che rileva il suo metabolita valle, nitrito. Essi alsO produrrà un rapporto IL-12p70/IL-10, che può essere misurata mediante ELISA. * P <0,01 per n = 3. (B) In accordo con un fenotipo alternativamente attivato, MCSF derivati ​​macrofagi trattati con IL-4 esprimono costitutivamente YM1 e Argi, che può essere rilevato dal immunoblotting occidentale. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con risultati simili.

Figura 3. Iniettato per via endovenosa, ex-vivo derivato in alternativa il traffico macrofagi attivati ​​al colon e ridurre l'infiammazione intestinale. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × 129Sv sfondo sono stati dati 5% nel DSS l'acqua da bere per sei giorni. Macrofagi M1 e M2 sono state iniettate ev ai giorni 0 e 4 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e un indicatore dei macrofagi M2 (Argi).La quantificazione dei macrofagi per il controllo PBS topi iniettati (C), topi iniettati con macrofagi M1 (+ M1) e topi iniettati con macrofagi M2 + M2) sono stati eseguiti da conteggio delle cellule colorate positivamente a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / del mouse e da 6 topi / gruppo. Il conteggio è stato eseguito da due individui ciechi alla condizione sperimentale. (B) L'attività della malattia è stata monitorata e ha segnato tutti i giorni durante il trattamento ed è un punteggio additivo a base di perdita di peso, sanguinamento rettale, e la consistenza delle feci è diminuito. * P <0,05 per n = 6 topi in 2 esperimenti indipendenti.

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Discussione

I macrofagi sono cellule fagocitiche che svolgono un ruolo importante nel sistema immunitario. Essi sono responsabili per l'avvio della risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Tipicamente, macrofagi attivati ​​classicamente vengono attivati ​​da IFNy o LPS e sono responsabili per eliminare patogeni e montare una risposta infiammatoria ^1. Viceversa, in alternativa macrofagi attivati ​​sono attivati ​​da IL-4 o IL-13 e gioca un ruolo in detriti di lavaggio e...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Clodronato liposomi contenenti	Clodronateliposomes.org
PBS liposomi contenenti	Clodronateliposomes.org
Sterile PBS pH 7,4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Siero fetale bovino (FCS)	Invitrogen	12483
acido acetico	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monotioglicerolo (MTG)	Sigma	96-275
Recombinant murino MCSF	StemCell Technologies	02951
Ricombinante murino GM-CSF	StemCell Technologies	02935
Ricombinante murino IL-3	StemCell Technologies	02903
Ricombinante murino IFNy	StemCell Technologies	02746
Ricombinante murino IL-4	StemCell Technologies	02714
Dissociazione cellulare Buffer	Invitrogen	13150-016
Ratto anti-F4/80 Anticorpo	ABD Serotec	MCA497GA
Topo anti-Argi Anticorpo	BD Transduction Laboratories	610708