Истощение и разведения макрофагов у мышей

Резюме

Макрофаги играют центральную роль в поддержании гомеостаза и патологии во многих тканях. Протокол, представленные здесь описываются методы истощения макрофагов В естественных условиях, Получения поляризованных макрофаги из костного мозга аспирационной и восприимчиво передачи макрофагов мышам. Эти методы позволяют определить ту роль, которую поляризованных макрофаги играют в здоровье и болезни.

Аннотация

Макрофаги являются важнейшими игроками на врожденный иммунный ответ на инфекционные проблемы или травмы, начала врожденного иммунного ответа и направления приобретенного иммунного ответа. Макрофагов дисфункция может привести к невозможности установить соответствующий иммунный ответ и, таким образом, был замешан во многих болезненных процессов, в том числе воспалительных заболеваний кишечника. Макрофаги отображение поляризованных фенотипов, которые разделены на две категории. Классически активированными макрофагами, активируются стимуляции IFNγ или ЛПС, играют важную роль в ответ на бактериальные задачей в то время как альтернативы активированные макрофаги, активированные ИЛ-4 и IL-13, участвовать в мусор очистки и тканей реконструкции и были вовлечены в разрешение фазы воспаления. В ходе воспалительной реакции в живом организме, макрофаги находятся на фоне сложной смеси проникают иммунные клетки и могут принимать участие, обостряя или resolvinг воспаления. Для определения роли макрофагов в месте, в целом модель животного, необходимо изучить влияние истощения макрофаги из сложных условиях. Чтобы задавать вопросы о роли макрофагов фенотип на месте, фенотипически определенный поляризованных макрофаги могут быть выведены бывшие естественных условиях, от аспирационной костного мозга и добавил к мышам, с или без предварительного истощения макрофагов. В протоколе, представленные здесь клодронат содержащих липосомы, против PBS вводится контроль, были использованы для разрушающих толстой макрофагов в декстран сульфата натрия (DSS), индуцированного колита у мышей. Кроме того, поляризованный макрофаги были получены бывшим естественных и переданы мышей путем внутривенной инъекции. Предостережение такого подхода является то, что клодронат содержащих липосомы, разрушающих все профессиональные фагоциты, в том числе и дендритных клеток и макрофагов, с тем чтобы обеспечить наблюдаемый эффект от истощения макрофагов конкретных, о восстановлениие фенотип приемными передачи макрофаги необходимо. Системный истощение макрофагов у мышей также может быть достигнуто путем обратного скрещивания мышей на CD11b-DTR фон, который является отличным взаимодополняющий подход. Преимущество клодронат содержащих липосомы опосредованного истощение является то, что он не требует времени и средств, участвующих в беккросс мышей и он может быть использован в мыши независимо от того, на фоне мышей (C57BL / 6, BALB / с, или смешанного происхождения ).

протокол

1. Разрушающих Макрофаги Использование клодронат содержащих липосомы

1. Липосомы хранятся при температуре 4 ° C. За два часа до инъекции, удалять клодронат содержащих липосомы, содержащие PBS липосомы, или стерильной PBS (введение контроля) из холодильника, чтобы они могли привыкнуть к комнатной температуре (18 ° C).
2. Переверните пробирки, содержащие липосомы, в 8-10 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение загрузки до 200 мкл в 1 мл шприц. Приложите на 26 иглы в верхней части шприца.
3. Используя левую руку, загривок мыши чуть ниже ушей проведение достаточно кожи, чтобы обездвижить его головы и конечностей.
4. Наклоните мыши так что его голова немного на землю, чтобы внутренние органы отойти от места инъекции, которая находится в правом нижнем квадранте живота.
5. Раскатайте шприц между ладонями и инвертировать его 6 раз, чтобы распределить равномерно липосомы решение перед инъекцией.
6. Вставьте иглу в нижней правой части живота мыши на 30-40 градусов. Вводите 200 мкл липосом решение или PBS.
7. Во время индуцированного воспаления модель, как и DSS-индуцированной колит, вводят мышам за 4 дня до начала экспериментального воспаления обеспечить истощение житель макрофагов и каждые 2 дня в протокол, чтобы исчерпать новое проникновение макрофагов.
8. В конце эксперимента, наряду с запланированными экспериментальные исследования, удаление тканей с сайта интерес и закрепить параформальдегид подтвердить макрофагов истощение иммуногистохимического окрашивания.

2. Вывод поляризованный макрофаги из костного мозга всасывает

1. Костный мозг мышей от 8 до 12 недель обеспечивает самую высокую доходность костномозгового происхождения макрофагов. Усыпить мышь, положите его на спину и придавить ее лапами, растяжения конечностей, насколько это возможно.
2. Работа в стерильных ухг, удалить бедра и голени, срезая столько мышц, насколько возможно.
3. Флеш мозг из костей с использованием IMDM 10% FCS загружается в 5 мл шприц оснащен 26 иглы.
4. Развести костный мозг всасывает до 40 мл в IMDM с 10% FCS, место клеток в 75 см ² колбы культуре ткани и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО ₂ в течение 4 часов. Этот шаг снимает сторонник мезенхимальных клеток или зрелые макрофаги из гемопоэтических предшественников.
5. Передача культуры супернатант, содержащий не соблюдают предшественники в 50 мл коническую трубку Сокол и центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту.
6. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл IMDM, 10% FCS и рассчитывать ядерных клеток путем разбавления клеточной суспензии 1 к 20 в уксусную кислоту. Эта процедура лизирует всех клеток, включая эритроциты и остальных ядер, можно пересчитать по гемоцитометра.
7. Ресуспендирования клеток в концентрации 0,5 · 10 ^{6 кл} / мл в полной среде; IMDM, 10% FCS, 150 мкМ монотиоглицерин (MTG), и 10 нг / мл или MCSF, GM-CSF или IL-3. MCSF производные макрофаги классически активированными макрофагами, тогда как GM-CSF или IL-3-производные макрофаги альтернативы активирован.
8. Замените среды на 4-й день, летел вниз, не прилипшие клетки и возвращения их в колбу, и на 7 день, отбрасывая не соблюдают клеток.
9. Кроме того, IFNγ (10 нг / мл) или ИЛ-4 (10 нг / мл) могут быть добавлены в колбы, содержащие MCSF клеток, полученных в 7-й день, чтобы исказить макрофагов в классическом активировать или альтернативно активированный фенотип, соответственно. Инкубируйте клетки в течение 3 дней.
10. На 10-й день, удалить СМИ и поднимать клетки от сосуда тканевой культуре использованием клеточной диссоциации буфера (Gibco-BRL). Место 5 мл буфера на клетки в течение 5 мин при комнатной температуре (18 ° C), а затем ударить по части колбы с пяткой ладони крепко несколько раз. Убедитесь, что клетки стартовал в колбе, изучив колбемикроскопом. Внесите ресуспендировали клеток в 15 мл коническую трубку Сокол и мыть колбы на 10 мл IMDM, 10% FBS. Бассейн и спином вниз клетки в течение 5 мин при 300 × г.
11. Граф жизнеспособные клетки, используя гемоцитометра и ресуспендируют в концентрации 10 ⁷ клеток / мл в стерильном PBS pH7.4. Макрофаги готовы к инъекции в мышей.
12. Резервный 1,0 × 10 ⁶ макрофагов для оценки фенотипа макрофагов. Классически активированные макрофаги стимулировали липополисахарида выделяют высокий уровень оксида азота и ИЛ-12p70 и низкий уровень IL-10 в сравнении с альтернативно активированными макрофагами. Кроме того активированными макрофагами конститутивно выразить YM1 и аргиназы I (Арги), которые могут быть обнаружены западными иммуноблоттинга.

3. Tranferring макрофаги мышей в

1. Ресуспендируйте макрофагов в стерильном PBS в концентрации 10 ⁷ клеток / мл. Это позволяет вtravenous инъекции 10 ⁶ макрофагов в общем объеме 100 мкл, что объем, который можно безопасно и комфортно мышам в хвостовую вену.
2. Теплый мышей с использованием грелки или тепла коленях в течение 5-10 мин, чтобы расширить хвостовую вену. Мониторинг мыши на все времена признаки гипертермии.
3. Передача мыши сдерживающим устройство, которое обеспечивает доступ к хвосту вен.
4. Поверните хвост 90 °, так что вены вверх. Вены работать с боков вниз обе стороны хвоста и как вены могут быть использованы.
5. Очистите место инъекции спиртом и медленно вводят 100 мкл (10 ⁶ макрофаги), используя 1 мл шприц с 26 или 28 иглы. Вставьте иглу с наклонной вверх и под небольшим углом, почти параллельно вене.
6. Если игла вставлена ​​никакого сопротивления должно ощущаться и вены должно стать ясно после инъекции. Если игла не находится ввены, хвост будет деформироваться. Если это произойдет, удалите иглу и попробуйте еще раз проксимальнее последняя попытка или в другом ключе. Новая игла должна быть использована для каждой инъекции, как хвост жесткие и иглы быстро притупляются в хвост инъекции вену.
7. После инъекции, удалите иглу, применить легкое давление в месте инъекции, пока кровотечение не останавливается, и следить за мышью на дополнительные 5 минут, чтобы кровотечение остановилось.
8. Повторите макрофагов инъекции каждые 4 дня, чтобы обеспечить непрерывную доставку поляризованных макрофагов при экспериментальном порядке.
9. В конце эксперимента, а также экспериментальные исследования, удаление тканей с сайта интерес и закрепить параформальдегид или формалина для подтверждения эффективности оказания поляризованных макрофагов иммуногистохимического окрашивания.

4. Представитель Результаты

Количество и фенотип резидентов macrophages в той или иной ткани зависит от ткани рассматривается и будет меняться в течение инфекции или воспаления. Кроме того, способность клодронат содержащих липосомы, чтобы исчерпать макрофаги из ткани будет зависеть от способа введения и эффективной доставки в ткани-мишени. Внутрибрюшинного введения клодронат содержащих липосомы приводит к снижению в F4/80 ⁺ макрофагов у мышей толстой кишки в течение DSS-индуцированной колит очевидным иммуногистохимического окрашивания для макрофагов маркер, F4/80 (рис. 1А). Гистологическое окрашивание также может быть использован для определения количественных различий в число макрофагов и фенотип в срезах тканей. Рисунок 1B показывает, что в среднем 55% макрофагов исчерпывается клодронат содержащих липосомы, по сравнению с истощением не обнаружили у мышей двоеточия, когда мышам вводили PBS только в виде инъекций управления. Каждое значение определяется путем подсчета F4/80 и Арги пятноизд-положительных клеток в серийных срезов ткани от 6 мышей на 3 балла, на 3 секции на мышь с подсчетом выполняется на двух человек, ослепленный экспериментальных условиях. Эти результаты показывают, что внутрибрюшинного введения клодронат липосомы разрушают толстой макрофагов у мышей.

Вывод макрофаги из костного мозга в присутствии различных факторов роста урожайности макрофаги, которые классически активирован (MCSF, полученных или MCSF, полученных и обработанных IFNγ), либо активировать (GM-CSF и IL-3-производных или MCSF, полученных и относились с IL-4). Промывка костного мозга от 2 бедренные кости голени и 2 из 8-недельных мышей обычно дает 6 × 10 ⁷ ядросодержащих клеток на мышь и дает 8 × 10 ⁶ MCSF производные макрофаги, 10 × 10 ⁶ GM-CSF производные макрофаги, или 12 × 10 ⁶ IL-3-производных макрофагов. Рисунок 2А показывает, нитритов и IL-12p70/IL-10 соотношение макрофагов вирernatants относиться с ЛПС в течение 24 часов рис. 2б показана типичная Западная блоттинга 0,5 × 10 ⁶ макрофагов MCSF + / -. IL-4 вывод условиях исследовали с антителами в качестве альтернативы активированного макрофагов маркеры, Арги, YM1, или как GAPDH загрузки контроля. Эти данные показывают, что костный мозг производные макрофаги могут быть искажены в поляризованном фенотип при выводе.

Эффективная передача бывших естественных получены поляризованные макрофагов в ткани зависит от способа введения и доступа к ткани. В DSS-индуцированной колит, макрофаги вводят внутривенно поехать в месте воспаления и наоборот активированными макрофагами уменьшить тяжесть заболевания. 3А показывает общее количество макрофагов и число Арги + (или активирована) макрофаги учитываются в гистологических срезов от мышей вводили с поляризованными костный мозг, Полученных макрофагов. Влияние переноса поляризованного макрофагов в толстой кишке в течение DSS-индуцированной колит проявляется болезнь индекс активности, добавка оценка основана на потере веса, ректальное кровотечение, и снижение консистенции стула (рис. 3В). Эти результаты показывают, что бывший естественных получены, восприимчиво переданы макрофаги могут трафика на толстой кишке и влияние индуцированного воспаления. M1 макрофаги не влияют воспаление в то время как М2 макрофаги значительно снизить индекс активности заболевания.

Рисунок 1. Клодронат содержащих липосомы эффективно разрушают F4/80 + и F480 + Арги + клеток у мышей двоеточия в естественных условиях. F2 поколение мышей дикого типа на смешанной C57BL / 6 × 129Sv фоне были даны 5% DSS в течение 7 дней, а введенный IP с PBS (контроль) или клодронат содержащих липосомы (клодронат) за 4 дня до лечения DSSи на 0, 2, 4 и 6 в DSS лечения. (A) Колоны были удалены, фиксированы, и срезы окрашивали по иммуногистохимии для зрелых макрофагов (F4/80) и М2 маркер макрофагов, Арги. (B) Количественная оценка F4/80 + + и Арги макрофагов. Положительно окрашенных клеток были подсчитаны по два человека знали о экспериментальных условиях при 40-кратном увеличении в 6 полей с 3 разделов / мыши и мыши с 6 / группы. * P <0,01.

Рисунок 2. MCSF производные макрофаги выразить классическим активированный фенотип и MCSF производные макрофаги относиться с IL-4 выразить альтернативы активированного макрофагов фенотипа. (А) В соответствии с классическим активированный фенотип, MCSF производные макрофаги производят более высокий уровень окиси азота в ответ на ЛПС и может быть измерен Грисса тест, который обнаруживает ее вниз по течению метаболитов, нитритов. Они ALSО производить более IL-12p70/IL-10 отношение, которое можно измерить с помощью иммуноферментного анализа. * P <0,01 для п = 3. (B) в соответствии с альтернативно активированный фенотип, MCSF производные макрофаги относиться с IL-4 конститутивно экспресс YM1 и Арги, которые могут быть обнаружены западными иммуноблоттинга. Данные представитель 3-х независимых экспериментов с аналогичными результатами.

Рисунок 3. Внутривенный впрыском, экс-живом, полученные альтернативы активированными макрофагами трафик на толстой кишки и уменьшить воспаление кишечника. F2 поколение мышей дикого типа на смешанной C57BL / 6 × 129Sv фоне были даны 5% DSS в питьевой воде в течение шести дней. М1 и М2 макрофагов вводили IV на 0, 4 во время лечения DSS. (A) Колоны были удалены, фиксированы, и срезы окрашивали по иммуногистохимии для зрелых макрофагов (F4/80) и М2 маркер макрофагов (Арги).Количественный макрофагов для контроля PBS вводили мышам (C), мышей вводили M1 макрофагов (+ М1) и мышей вводили M2 макрофагов (+ M2) проводили путем подсчета положительно окрашенных клеток при 40-кратном увеличении на 6 полей из 3 разделов / мышь и от 6 мышей / группу. Подсчет проводился на двух человек, ослепленный экспериментальных условиях. (B), болезни деятельность контролировалась и забил ежедневно во время лечения и добавка оценка основана на потере веса, ректальное кровотечение, и снижение консистенции стула. * P <0,05 для п = 6 мышей в 2-х независимых экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Макрофаги являются фагоциты, которые играют важную роль в иммунной системе. Они несут ответственность за развязывание врожденного иммунного ответа и направления приобретенного иммунного ответа. Как правило, классически активированные макрофаги активируются IFNγ или LPS и несут ответс?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Клодронат содержащих липосомы	Clodronateliposomes.org
PBS-содержащих липосомы	Clodronateliposomes.org
Стерильные PBS pH7.4	Invitrogen	14190
IMDM	Invitrogen	12440
Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS)	Invitrogen	12483
уксусная кислота	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Монотиоглицерин (MTG)	Сигма	96-275
Recombinant мышиных MCSF	Stemcell технологии	02951
Рекомбинантный мышиный GM-CSF	Stemcell технологии	02935
Рекомбинантный мышиный IL-3	Stemcell технологии	02903
Рекомбинантный мышиный IFNγ	Stemcell технологии	02746
Рекомбинантный мышиный ИЛ-4	Stemcell технологии	02714
Клеточная диссоциация буфер	Invitrogen	13150-016
Крыса anti-F4/80 антител	Абд Serotec	MCA497GA
Мышь против Арги антител	Лаборатории BD трансдукция	610708