마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

요약

Macrophages는 항상성의 중심 역할을하고 여러 조직의 병리. 여기에 제시된 프로토콜은 macrophages를 파괴하는 방법을 설명합니다 생체내에서, 골수 aspirates에서 편광 macrophages를 파생하고 adoptively 생쥐에 macrophages를 전송. 이 기술은 편광 macrophages 건강과 질병에서 재생하는 역할의 결정을 허용합니다.

초록

Macrophages는 타고난 면역 반응을 시작하고 후천성 면역 반응을 지시 전염성 도전이나 부상으로 타고난 면역 반응에서 중요한 선수입니다. 대식 세포 기능 장애는 적절한 면역 반응을 마운트 무능력으로 이어질 수 있으며, 같은, 염증성 장 질환 등 많은 질병 프로세스에 연루되었습니다. Macrophages는 크게 두 가지 범주로 나누어집니다 편광 phenotypes를 표시합니다. 고전 활성화 macrophages는 IFNγ 또는 LPS로 자극에 의​​해 활성화, 해상도 또는 활성화 macrophages 반면, IL-4 또는 IL-13에 의해 활성화, 소기 파편과 조직 리모델링에 참여하고 연루되어 세균의 도전에 대한 응답으로 중요한 역할을 염증의 위상. 생체내의 염증 반응 동안, macrophages는 면역 세포를 침투의 복잡한 혼합물 속에서 발견되고 exacerbating 또는 resolvin으로 참여할 수g 걸렸다. 전체 동물 모델에서 현장에서 macrophages의 역할을 정의하려면, 그것은 복잡한 환경에서 macrophages을 파괴의 효과를 조사할 필요가 있습니다. 현장에서 대식 세포의 표현형의 역할에 관한 질문을하려면 phenotypically 정의된 편광 macrophages는 골수 aspirates에서, 전직 생체내를 얻을 수와 함께 또는 macrophages의 사전 파괴하지 않고, 다시 생쥐로 추가했습니다. 프로토콜에서 clodronate 함유 liposomes 여기를 제시, 대 PBS 주입 제어, dextran 나트륨 황산 (DSS) 유발 생쥐의 대장염 동안 colonic macrophages를 고갈하는 데 사용되었다. 또한, 편광 macrophages는 전직 생체내를 파생되었으며 정맥 주사에 의해 생쥐로 전학 왔어. 이 방법에 주의해야 할 점은 그 clodronate 함유 liposomes 너무 고갈에 의해 관찰 효과는 대식 세포 관련, reconstitution O한지 돌기 세포 및 macrophages 모두를 포함한 모든 전문 phagocytes을 고갈이다macrophages의 입양 전송에 의한 F의 표현형이 필요합니다. 생쥐의 조직 대식 세포 고갈도 CD11b-DTR 배경에 backcrossing 마우스에 의해 달성될 수있는이 훌륭한 보완적인 접근 방법입니다. clodronate 함유 리포좀-매개 고갈의 장점은 backcrossing 마우스에 관련된 시간과 비용을 요구하지 않으며 그것에 관계없이 생쥐 (C57BL / 6, BALB / C, 또는 혼합된 배경의 배경 생쥐에서 사용될 수있다는 것입니다 ).

프로토콜

1. Clodronate 함유 Liposomes 이용 파괴 Macrophages

1. Liposomes는 4 ° C.에 저장됩니다 두 시간 전에 주사로, 그들은 상온 (18 ° C)에 적응하도록 냉장고에서 clodronate 함유 liposomes, PBS 함유 liposomes, 또는 무균 PBS (분사 제어)를 제거하십시오.
2. 1 ML의 주사기에 200 μl를로드하기 전에도 유통을 보장하기 위해 liposomes에게 8-10 번 들어있는 튜브를 반전. 주사기의 상단에 26 게이지 바늘을 연결합니다.
3. 단지 아기의 머리와 사지를 고정하기 위해 충분한 피부를 잡고 귀를 아래 왼손, 비듬에게 마우스를 사용합니다.
4. 내부 장기가 복부의 오른쪽 아래 사분면에 위치하고 있으며 주사 사이트에서 떨어져 움직일 수 있도록 아기의 머리가 땅에 향해 약간 수 있도록 마우스를 기울이십시오.
5. 손바닥 사이에 주사기를 올리고 사출에 고르게 이전 리포좀 솔루션을 배포하는 데 그것을 6 회로 바꾸란.
<리> 30-40도 각도에서 마우스 복부 하단 오른쪽에 바늘을 삽입합니다. 리포좀 용액 또는 PBS 200 μl를 주입.
6. 유도된 염증 모델 중에는 DSS 유도된 대장염처럼 처음 침투 macrophages를 고갈하는 프로토콜 중 주민 macrophages와 매 2 일간의 고갈을 보장하기 위해 사전에 실험적인 염증의 증상에 대한 사일 쥐는 주입.
7. 실험 끝에 계획된 실험적인 분석과 함께 관심있는 사이트에서 조직을 제거하고 immunohistochemical 염색법에 의해 대식 세포 고갈 확인을 위해 paraformaldehyde로 고정시킨다.

2. 골수 Aspirates에서 편광 Macrophages의 유도

1. 생후 8 12주 사이에 생쥐의 골수는 골수 파생 macrophages 가장 높은 수율을 제공합니다. 마우스를 안락사, 그것은 누워 있으며까지 가능한 자사의 팔다리를 스트레칭, 그 발 아래로 핀.
2. 후 멸균에 근무d는, 가능한 한 많은 근육으로 떨어져 절단, 대퇴골 및 tibias를 제거합니다.
3. 10% FCS와 IMDM를 사용하여 뼈를에서 플러쉬 골수는 26 게이지 바늘로 장착되어 5 ML의 주사기에 로드된.
4. 희석 골수 10 % FCS, 75cm ^두 조직 배양 플라스크에 장소 세포, 37에서 품어 ° C, 5 % 4 시간 동안 CO _2와 IMDM 40 ML에 aspirates. 이 단계는 조혈 progenitors에서 자기편 mesenchymal 세포 또는 성숙 macrophages를 제​​거합니다.
5. 1,200 rpm으로 5 분 동안 50 ML 원뿔 팔콘 튜브와 원심 분리기에 비 점착 성의 progenitors를 포함하는 전송 문화 뜨는.
6. Resuspend 세포 5 ML IMDM의 펠렛 10 % FCS하고 초산에 20 세포 현탁액 1 diluting하여 nucleated 세포를 계산합니다. 이 절차는 적혈구와 나머지 핵은 hemocytometer를 계산하실 수 있습니다 포함한 모든 세포를 lyses.
7. 0.5의 농도 × 10 ⁶ 세포 / 전체 매체에 ML에서 Resuspend 세포, IMDM 10 % FCS, 150 μm의 제품 monothioglycerol (MTG), 10 NG / MCSF, GM-CSF, 또는 IL-3 하나의 ML. GM-CSF 또는 IL-3-파생 macrophages는 또한 활성화되는 반면 MCSF 파생 macrophages는 고전적인 macrophages를 활성화됩니다.
8. 비 점착 성의 세포를 아래로 회전하고 플라스크에게 반환하고, 일 7시, 폐기 비 점착 성의 세포, 일 4에서 매체를 교체하십시오.
9. 또한, IFNγ (10 NG / ML) 또는 IL-4 (10 NG / ML)은 스큐 macrophages까지 일 7 시에 MCSF 파생 세포를 포함하는 flasks에 추가할 수있는 고전적인 각각 활성화하거나 또는 활성화 표현형. 3 번 정도 더 일 동안 세포를 품어.
10. 10 일째에, 미디어를 제거하고 세포 분열의 버퍼 (Gibco-BRL)를 사용하여 조직 배양 플라스크의 세포를 발사. 다음 장소 5 실온 (18 ° C)에서 5 분 세포에 대한 버퍼의 ML하고 손바닥의 뒤꿈치 단단​​히 여러 번 함께 플라스크의 측면을 두들겨도. 세포가 아래 플라스크를 검사하여 플라스크에서 떠낸했는지 확인현미경. Pipet는 15 ML 원뿔 팔콘 튜브에 세포를 resuspended하고 IMDM 10 % FBS의 추가 10 ML로 플라스크를 씻어. 풀 300 × g에서 5 분 대한 세포를 돌리다.
11. 멸균 PBS pH7.4에서 10 ⁷ 셀 / ML의 농도에 hemocytometer 및 resuspend를 사용하여 실행 가능한 세포를 세어보세요. Macrophages은 생쥐에 주입을위한 준비가되어 있습니다.
12. 예약 1.0 × 대식 세포 표현형 평가를위한 10 ⁶ macrophages. lipopolysaccharide의 분비 질소 산화물의 높은 수준과 IL-10의 IL-12p70 및 낮은 수준으로 자극 클래식한 활성화 macrophages가 번갈아 활성화 macrophages에 비해. 또한 활성 macrophages는 constitutively YM1과 서양이 immunoblotting까지 감지가 가능하다 arginase I (ArgI)를 표현.

3. 마우스로 Macrophages을 Tranferring

1. 10 ⁷ 세포 / ML의 농도에서 멸균 PBS에서 Resuspend macrophages. 이것에 대해 허용안전하고 편안하게 꼬리 정맥에 의해 생쥐에 주입 수있는 볼륨입니다 100 μl의 총 판매량 10 ⁶ macrophages의 travenous 주입.
2. 꼬리 정맥을 치료하는데 5-10 분 동안 가열 패드 또는 열 무릎을 사용하여 따뜻한 생쥐. 고열의 징후에 대해 항상 마우스를 모니터링합니다.
3. 꼬리 정맥에 대한 액세스를 허용 금지 장치에 마우스를 전송합니다.
4. 꼬리 90 ° 회전 정맥이 위를 향하게되도록. 정맥은 꼬리 양쪽 다운 laterally 실행하거나, 정맥을 사용할 수 있습니다.
5. 알코올 면봉으로 사출 사이트를 청소하고 느리게 26 또는 28 게이지 바늘로 한 ML의 주사기를 사용하여 100 μl를 (10 ⁶ macrophages) 주사. 최대 직면한 베벨 사이드와 함께 혈관에 거의 평행하게 약간 각도에서 바늘을 삽입합니다.
6. 바늘이 제대로 삽입되면 아무런 저항도 느껴 보지해야하며 정맥은 주사 후 맑은 수있게됩니다. 마약에 없으면정맥, 꼬리가 팽창됩니다. 이 경우 바늘을 제거하고 다시 마지막 시도하거나 다른 정맥에 대한 근위보십시오. 꼬리가 힘든이며 바늘은 꼬리 정맥 주입시 신속하게 무딘지고 새로운 바늘은 각 주사를 사용해야합니다.
7. 사출 이어, 바늘을 제거 출혈이 멈출 때까지 주입 사이트에 부드러운 압력을 적용, 그 출혈은 멈추었 있도록 추가로 5 분 용 마우스를 모니터합니다.
8. 실험 절차를 수행하는 동안 편광 macrophages의 지속적인 전달을 보장하기 위해 4 일에 한 대식 세포 주사를 반복합니다.
9. 실험이 끝나면 실험적인 분석과 함께 관심있는 사이트에서 조직을 제거하고 immunohistochemical 염색법에 의한 편광 macrophages의 효과적인 전달을 확인하는 paraformaldehyde 또는 포르말린으로 고정시킨다.

4. 대표 결과

주민 macrop의 번호와 표현형특정 조직의 hages가 조사중인 조직에 의존하고 감염이나 염증 동안 변경됩니다. 마찬가지로, 조직에서 macrophages를 고갈하기 clodronate 함유 liposomes의 능력은 관리 및 대상 조직에 대한 효과적인 전달 경로에 따라 달라집니다. F4/80의 감소 ⁺ 대식 세포 마커, F4/80 (그림 1A)에 대한 immunohistochemical 염색법에 의해 분명 DSS 유도된 대장염 동안 마우스 콜론의 macrophages의 clodronate 함유 liposomes 결과의 Intraperitoneal 주입. Histological 염색법은 또한 조직 섹션에있는 대식 세포 번호 및 표현형의 양적 차이를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1B는 마우스가 함께 주입되면 macrophages의 55 %의 평균은 마우스 콜론에서 검색된없이 고갈에 비해 clodronate 함유 liposomes으로 소진되는 보여줍니다 분사 제어와 같은 PBS 혼자. 각 값은 F4/80 및 ArgI는 얼룩 계산에 의해 결정됩니다계산은 실험적인 상태로 멀게 두 명에 의해 수행되고있는 마우스 당 3 섹션에서 3 점 6 생쥐에서 시리얼 조직 섹션에 에드 긍정적인 세포. 이러한 결과는 clodronate의 liposomes의 intraperitoneal 주사가 생쥐에서 colonic macrophages를 고갈 것을 보여줍니다.

(GM-CSF 나 IL-3-파생 또는 MCSF - 파생과 고전적인 활성 (MCSF-파생된 또는 MCSF - 유래와 IFNγ 대우) 또는 다른 방법으로 활성화되어 다양한 성장 요인의 수확량의 macrophages의 존재의 골수에서 macrophages의 유도 ) IL-4로 치료. 8주 옛 마우스에서 2 대퇴골과 2 tibias로부터 골수를 플러쉬 것은 일반적으로 마우스 당 6 × 10 ⁷ nucleated 세포 수율 8 × 10 ⁶ MCSF 파생 macrophages, 10 × 10 ⁶ GM-CSF-파생 macrophages, 또는 12를 얻을 × 10 ⁶ IL-3-파생 macrophages. 그림 2A는 대식 세포에서 아질산염과 IL-12p70/IL-10 비율 한모금 보여줍니다ernatants 24 시간 동안 lipopolysaccharide로 치료 그림 2B는 0.5의 전형적인 서양 얼룩 분석 × MCSF에서 10 ⁶ macrophages + / 보여줍니다 -. IL-4 파생 조건 또는 활성화된 대식 세포 마커, ArgI, YM1에 대한 항체와 탐지를하거나, 같은 GAPDH로 제어를 실었습니다. 이러한 데이터는 골수 파생 macrophages가 파생하는 동안 편광 표현형에 괴상한 수 있도록 보여줍니다.

티슈로 전직 생체내 파생 편광 macrophages의 효과적인 전송 관리 및 조직에 대한 접근의 경로에 따라 달라집니다. DSS 유도된 대장염 동안 macrophages는 염증의 사이트로 이동하고 또한 활성화 macrophages은 질병 심각도를 줄일 정맥 주입. 그림 3A는 macrophages의 총계를 보여줍와 생쥐에서 histological 섹션에 포함 ArgI + (또는 활성화) macrophages의 수가 편광 주사 골수macrophages를 파생. DSS 유도된 대장염 동안 콜론으로 편광 macrophages의 양도의 영향은 질병 활동 지수, 체중 감소, 직장 출혈, 그리고 감소 대변 일관성 (그림 3B)에 근거 첨가제 점수가 표시됩니다. 이러한 결과는 전 생체내가 파생된 것으로 입증, adoptively 양도 macrophages 콜론과 영향 유도된 염증에 대한 트래픽이 있습니다. M2 macrophages 크게 질병 활동 색인을 줄이는 반면 M1 macrophages는 염증에 영향을 미치지 않습니다.

그림 1. Clodronate 함유 liposomes 효과적 F4/80를 고갈 +와 F480 + ArgI + 생체내에서 마우스 콜론의 세포. 혼합 C57BL / 6 × 129Sv 배경에 야생 형 생쥐의 F2 세대는 치료를 DSS하기 전에 PBS (컨트롤) 또는 clodronate 함유 liposomes (Clodronate) 4 일 동안 칠일 및 주입 IP에 대해 5 % DSS을 받았고그리고 일 0, 2, 4 및 DSS 치료 중에 6. () 콜론은 제거 고정되어, 그리고 섹션은 성숙 macrophages (F4/80)과 M2 대식 세포 마커, ArgI위한 immunohistochemistry에 의해 물들어 있었다되었다. F4/80의 (B) Quantitation +와 ArgI + macrophages. 긍정적으로 얼룩진 세포는 3 섹션 / 마우스에서 6 생쥐 / 그룹에서 6 분야 40 × 확대 실험적인 상태로 멀게 두 명으로 집계되었다. * P <0.01.

그림 2. MCSF 파생 macrophages는 고전적인 활성화 표현형을 표현하고 IL-4로 치료 MCSF 파생 macrophages는 또는 활성화된 대식 세포의 표현형 표현. () 고전 활성화 표현형과 일치, MCSF 파생 macrophages은 lipopolysaccharide에 대한 반응으로 질산 산화 높은 수준의 생산과 그 하류 신진 대사, 아질산을 감지 Griess 분석에 의해 측정할 수있다. 그들 ALS엘리사에 의해 측정할 수 높은 IL-12p70/IL-10 비율, 생산 O. * P N = 3 <0.01. (B) 또는 활성화 표현형과 일치하는, IL-4 constitutively 명시 YM1와 ArgI 대우 MCSF 파생 macrophages는 어느 서양 immunoblotting까지 감지가 가능하다. 데이터는 유사한 결과를 3 개의 독립적인 실험의 대표입니다.

그림 3. 정맥 주입, 전직 생체내 - 파생 또는 콜론으로 macrophages 트래픽을 활성화하고 장의 염증을 줄일 수 있습니다. 혼합 C57BL / 6 × 129Sv 배경에 야생 형 생쥐의 F2 세대가 6 일 자신들의 식수의 5 % DSS를 받았습니다. M1과 M2 macrophages는 DSS 치료 기간 동안 일 0과 4 주사를 주입했다. () 콜론은 제거 고정되어, 그리고 섹션은 성숙 macrophages (F4/80)에 immunohistochemistry와 M2 대식 세포 마커 (ArgI)에 의해 물들어 있었다되었다.컨트롤 PBS 주입 생쥐 (C)에 대한 macrophages의 Quantitation는 M1 macrophages (+ M1) 및 M2 macrophages (+ M2)와 함께 주입 생쥐에 주입 생쥐는 3 구역 / 마우스에서 6 분야 40 × 확대 긍정적 스테인드 세포를 계수에 의해 수행되었다 6 생쥐 / 그룹에서. 계산은 실험적인 상태로 멀게 두 명에 의해 수행되었다. (B) 질병 활동 모니터링 및 치료 기간 동안 매일 점수 및 체중 감소, 직장 출혈, 그리고 감소 대변 일관성을 바탕으로 첨가제 점수가되었습니다. * P N을위한 <0.05이 독립적인 실험에서 = 6 생쥐.

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토론

Macrophages가 면역 체계에 중요한 역할을 phagocytic 세포입니다. 그들은 타고난 면역 반응을 시작하고 후천성 면역 응답을 감독 책임이 있습니다. 일반적으로 고전적인 활성화 macrophages는 IFNγ 또는 LPS에 의해 활성화하고 병원균을 제거하고 염증 반응 ^1을 장착 책임이 있습니다. 반대로, 또는 활성 macrophages는 IL-4 또는 IL-13에 의해 활성화되고 염증 ¹ 해상도 동안 소기 파편의 역할과 조?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
Clodronate 함유 liposomes	Clodronateliposomes.org
PBS 함유 liposomes	Clodronateliposomes.org
멸균 PBS pH7.4	Invitrogen	14,190
IMDM	Invitrogen	12,440
소태아 세럼 (FCS)	Invitrogen	12,483
초산	BDH Aristar	BDH3092-500MLP
Monothioglycerol (MTG)	시그마	96-275
Recombinant murine MCSF	Stemcell 기술	02,951
GM-CSF 재조합 murine	Stemcell 기술	02,935
재조합 murine IL-3	Stemcell 기술	02,903
재조합 murine IFNγ	Stemcell 기술	02,746
재조합 murine IL-4	Stemcell 기술	02,714
세포 분리 버퍼	Invitrogen	13150-016
anti-F4/80 항체를 밀고	AbD Serotec	MCA497GA
마우스 방지 ArgI 항체	BD의 형질 도입 연구소	610,708