Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Özet

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Özet

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Giriş

Kinesin-1 kendi kargolar ^1,2 ileriye taşınmasını aracılık eden motor proteindir. Bu kinesin hafif zincir 1 (KLC1) ve kinesin ağır zincirler, iki alt-birimden (KHCs) iki alt birimden oluşan bir heterotetramer olup. KIF5B ^1, bir KHC, N-terminal, ATP hidroliz ile mikro boyunca hareket için mekanik enerjiye kimyasal enerjiyi dönüştürür bir motor fonksiyonun içerir. Bu C-terminal bölgesidir kargoyla ilişkilendiren KLC1, etkileşimde dimerizasyon alanı içerir. Kinesin-1 gibi veziküller, organeller ve mRNA'ların ^3,4 olarak kargoları taşır. Son zamanlarda, KIF5B sitoplazma ⁵ proteozomal degradasyon nükleer transkripsiyon faktörü, c-myc taşımak için gösterilmiştir. Üç yöntemleri (Kimyasal inhibitör, siRNA / shRNA ve dominant negatif mutantı) kinesin-1 fonksiyonunu inhibe etmek için kullanıldı. Hepsi sitoplazmada c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Son yöntem, c-myc, sadece hakim negat etkilenmiştirMutant, genel (mikrotübül bozulması) gibi hücre içi bileşenleri üzerindeki etkileri ya da protein agregasyonu üzerinde uyguladığı etmediğini ortaya koyarak, ilgili başka bir KIF5A motoru proteininin göre KIF5B bir mutantı ive değil. KIF5B dominant negatif mutantı da transkripsiyon faktörleri ile ilgili genel etkilere neden etmediğini ortaya koyarak, bir transkripsiyon faktörü etkilemedi. Aksine, bu dominant negatif mutant kendi kargolar üzerinde spesifik etkileri baskı oluşturduğunu düşündürmektedir.

baskın negatif mutantlarının kullanımı motor proteinlerinin alanında yaygındır. kinesinlerin ve Miyosinler Benzer motorsuz mutantlar daha önce kullanılmıştır. Onlar esas olarak kendi kargolar hücre içi lokalizasyonu veya hücresel fonksiyonları ^6-12 mutantların etkilerini göstermek için kullanılmıştır. Daha az vurgu mutantlar ve onlar tarafından etkilenen kargoların arasındaki mekansal ilişki konulmuştur. Bununla birlikte, bazı olaylar olarak, mutasyonlar, CA ile birlikte lokalize olduğu gözlenmiştirrgos ^6,10.

KIF5B ve ilgili proteinler arasındaki etkileşimin daha önce in vivo olarak maya iki-hibrid tahlili ve ko-immünopresipitasyon ve in vitro olarak açılan deneylerinde ^13-16 biyokimyasal açılan deneyleri ile teyit edilmiştir. Bu yazıda, ek bir görsel yöntem kullanarak floresan mikroskopi KIF5B kargo proteinleri tespit etmek açıklanmıştır. yöntem, bir baskın negatif mutant olarak hareket eden bir motorsuz KIF5B mutant kullanır. Bu sitoplazmalarında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır.

¹⁷ tdTomato floresan protein vahşi tip ve motorsuz KIF5B mutantının etiketleme flüoresans mikroskopisi ile görselleştirme sağlar. etiketli KIF5B proteinleri uygun KIF5B etiketten ayrıldı spektral özelliklere sahip bir farklı floresan proteinine aday protein ile birlikte ifade edilebilir. etiketli proteinler canlı hücrelerde doğrudan gözlenirfloresan mikroskobu altında. Motorsuz KIF5B mutant tarafından aday proteini birikiminin indüksiyon aday protein KIF5B in vivo kargo olduğunu teyit edecektir. Ayrıca, tdTomato-etiketli KIF5B proteinleri endojen kargo proteinleri üzerindeki etkilerini incelemek için hücreler tek başına ifade edilebilir. Daha sonra, immünofloresan mikroskopi, bir floresan boya ile konjüge edilmiş uygun bir ikincil antikor, ardından transfekte edilmiş hücreler, sabit ve endojen bir aday proteinine karşı spesifik bir antikor ile boyanmış olan gerçekleştirilir. Bu durumda, kendi fizyolojik olarak endojen Aday Protein incelenmiştir. Diğer motorlu proteinlerinin benzer motorsuz mutantlar da yüklerin tespit etmek hazırlanabilir.

Protokol

tdTomato-etiketli doğal tip ve motorsuz KIF5B Proteinler 1. Klonlama

1. Tablo 1 'de primerler kullanılarak insan vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinleri için cDNAlar yükseltin, Taq DNA polimerazı (100 uL, 5 birim), dNTP karışımı (her bir deoksinükleotit 2 mM) ve 30 devir için 10 X tamponu. Her döngü denatürasyon, aşama (30 saniye için 95 ° C) bir tavlama etabı (30 saniye için 45 ° C) ve bir uzatma aşamasından oluşuyordu (3 dakika için 72 ° C) meydana gelir.
2. fenol / kloroform eşit hacimde Yükseltilmiş DNA ürünü ekstrakte (1: 1).
   Not: Fenol yanıcı ve yanıklara neden olabilir. Kloroform tehlikelidir. Onlarla doğrudan temastan kaçının ve bir kimyasal davlumbaz altında bunları kullanmak. Seçenek olarak ise, PCR ürünleri, çeşitli kitleri ile saflaştırılabilir.
   1. 1 dakika için oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g'de dönerler. yeni bir tüpe, sulu çözeltisini ve kloroform eşit hacimde ile ekstrakte edin.
   2. dönüş0.5 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 xg'de. yeni bir tüpe sulu çözelti aktarın.
   3. 3 M Na-asetat onda biri hacmi ve mutlak etanol iki hacim sulu çözelti ile karıştırılır.
   4. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g'de dönerler. Sulu çözüm atın.
   5. % 75 etanol, iki hacim DNA pelet yıkayın. Sulu çözelti atın ve 5 dakika hava vermek için oda sıcaklığında DNA pelet kurutulur. 34 ul su DNA pelletini.
3. sınırlama 40 ul'lik nihai hacimde amplifiye ürünleri sindirmek SalI (10 birim) ve BamHI (10 birim) ve iki saat süre ile 37 ° C 'de kendi 10X tampon maddesi 4 ul enzim. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jeli içinde dijeste ürünleri (100 V'ta% 1.0) giderin.
   Not: Etidyum bromür güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. Nedenle, W, doğrudan ya da dolaylı olarak temas önlemek için önemlidiri etidyum bromür.
4. sütunlarla arıtma için doğru bantları kesip. DNA fragmanını içeren agaroz jeli tartılır. Daha sonra yaklaşık 20 dakika süreyle, 37 ° C de çözücü tampon (0.1 g, 300 ul) içinde çözülür.
5. 5 saniye boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj bir sütun ve bir dönüş sonuçlandı çözüm ekleyin. flow-through atın.
6. adım 1.5 tekrar 0.5 mi solübilizasyon, tampon ile kolon yıkayın. adım 1.5 tekrarlayarak 0.75 ml yıkama tamponu ile tekrar kolon yıkayın. 2 dk kalan yıkama tamponu kurtulmak için sütun Spin.
7. adım 1.5 tekrar 50 ul su ile DNA fragmanını yıkayın. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jel (100 V'ta% 1.0), bir DNA büyüklüğü merdiveni karşı bunu bir kısım çalıştırarak DNA fragmanının konsantrasyonu tahmin.
8. Daha önce th ile sindirilmiş ptdTomato C1 vektörü ¹⁷ (yaklaşık 100 ng) ile saflaştırılmış ürünleri (yaklaşık 100 ng) ligateE aynı restriksiyon 16 saat oda sıcaklığında T4 DNA ligazı (2.000 ünite), 1 ul 10x ligasyon tamponu kullanılarak 10 ul enzim.
   Not: vahşi tip ve motorsuz mutant sırasıyla 2 ila 963 963 ve 584 amino asit ihtiva eder. Daha önce, daha büyük bir motorsuz KIF5B mutan işlevini ⁹ tespit etmek için kullanıldı. Daha küçük bir motorsuz KIF5B mutantı olarak ifade seviyelerini arttırmak amacıyla, bu çalışmalar için kullanılmıştır.

2. İmmünofloresan Mikroskopi

1. Canlı hücre ya da ya da 40X aşağıdaki büyütme ile dolaylı flüoresan görüntüleme için, 1 ml komple ortam içinde 0,2-0.300.000 HeLa hücrelerini tohum her bir gözündeki [Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu ile (DMEM) (FBS)] altı plaka. _% 5 CO2 37 ° C'de büyütülmüştür.
2. 40X üstünde büyütme ile dolaylı immünfloresan çalışmaları, kapak gözlük yıkamak için, mutlak etanol kısaca ve (18 mm x 18 mm 1.5 kalınlık) onları havada kurutunBir biyogüvenlik kabini içinde altı plaka kuyuları, kontaminasyonu önlemek için.
   1. 1 tohum ,2-0.300.000 hücre altı gözlü bir plakanın her çukuruna DMEM ortamı tam ml.
3. Transfeksiyon Kompleksinin Hazırlanması
   1. Sonraki gün, bir biyo-güvenlik kabini içinde, bir kargo aday protein için bir ekspresyon plazmidi varlığında ya da yokluğunda tdTomato-etiketli doğal tip veya motorsuz KIF5B için ekspresyon plazmidi, 0.6 ug (toplam) seyreltin (pTagCFP-c-myc ⁵ ) 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı ile.
      Not: Vector pTagCFP-c-myc TagCFP-etiketli c-myc ifade eder.
   2. Başka bir 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı transfeksiyon reaktifi 1.8 ul ekle. Tipik olarak, 12 örnek için yeterli seyreltilmiş transfeksiyon reaktif bir ana karışımı hazırlayın.
   3. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
   4. seyreltilmiş 0.1 ml DNA'lar seyreltilmiş 0.1 ml transfeksiyon reaktifı ilave edin. Mitüpleri tersine çevirerek içindekileri x. Bir mikrosantrifüj 5 saniye boyunca tüpler Spin.
   5. Oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile inkübe edilir.
4. Hücrelerin Yıkama
   1. transfeksiyon kompleksi oluşumu için kuluçka süresi boyunca serpilmiş hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkanır.
   2. Her seribaşı hücrelerin orta değiştirin iyi ile 0.8 ml önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı. 37 ° C'de inkübatör plakaları dönün.
5. Hücrelerin transfeksiyonu
   1. 45 dakika inkübasyondan sonra, plakanın her bir DNA / transfeksiyon reaktifi (adım 2.3 hazırlandı) kompleksi damla damla 0.2 ml ilave ediniz.
   2. bunlar, 37 ° C'de kuluçka makinesine geri döndürülmüştür önce 5 saniye yavaşça 6 plaka sallayın.
   3. 6-8 saat sonra, tam bir DMEM ortamıyla yapılan orta yerine.
6. Canlı hücre Floresans Görüntüleme ¹⁸ için
   1. İnkübasyon karışımını bir ek 16 saat sonraT 37 ° C, 1 uM nihai konsantrasyona kadar orta DNA interkalasyon leke Hoechst 33342 ekleyin.
      Not: Hoechst 33342 hücre çekirdekleri lekeleyen bir hücre geçirgen DNA interkalasyon boyadır.
   2. 40X objektif kullanılarak flüoresan mikroskopi ile floresan proteinleri ekspresyonu için bunları incelemeden önce 37 ° C'de inkübatör içinde 10 dakika süre ile transfekte edilmiş hücreler inkübe edin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) 'dir.
      Not: Arka nedeniyle tam bir DMEM ortamı otomatik floresan yüksekse, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır.

Dolaylı İmmünoflöresan Çalışmaları 3.

1. Paraformaldehyde Çözüm hazırlanması
   1. paraformaldehit tozu (100 ml PBS başına 4 gr) tartılır ve PBS ekleyin.
      Not: Paraformaldehyde yanıcı katı ve potansiyel kanser hazar olduğunud. Bu gözleri, solunum sistemini ve deriyi tahriş edicidir. Nedenle, bu paraformaldehit ile temas veya inhalasyon önlemek için önemlidir.
   2. çözeltisi (150 ul 10 N NaOH / 100 mi) NaOH ekleyin.
   3. Ara sıra çalkalanarak 2-3 saat boyunca 42 ° C'ye kadar 37 ° C'de çözelti tutun.
   4. eritilir paraformaldehit toz sonra çözelti (yaklaşık 75 ul / 100 mi), buzlu asetik asit eklenerek 7.0 pH'a ayarlamak.
2. Hedef proteinler Boyama
   1. 37 ° C'de 16 saat daha inkübasyondan sonra, 5 saniye için, altı oyuklu plaka dönen tarafından bir kez PBS ile oda sıcaklığında transfekte hücreler yıkayın.
   2. oyuk başına taze hazırlanmış,% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml hücreleri saptamak. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. bir kez 5 saniye altı-plaka için dönen PBS ile hücreleri yıkayın. çözüm atın.
   4. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (PBS içinde) Triton-X-100, 1 ml kuluçkaya bırakılır. dethücre içi hedeflere antikorların erişmesine izin vermek için hücre zarı permeabilize olacak Triton-X 100 ergent.
   5. 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez hücreleri yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın.
   6. 4 saat sallayarak, oda sıcaklığında PBS çözeltisi içinde bir% 10 FBS içinde, (0.1 ug / ml c-myc tavşan antikoru veya p53 fare antikoru) birincil antikor 1 ml kuluçkaya bırakılır.
   7. 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın.
   8. 2 saat sallayarak karanlıkta, oda sıcaklığında PBS içinde% 10 FBS içinde, (0.5 ug / ml ve Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan veya anti-fare IgG antikoru) fluoresan boya-konjüge edilmiş ikincil antikor, 1 ml kuluçkalayın.
   9. 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın.
3. Nükleer Boyama ve Montaj
   DNA araya eklenen boyanın 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, 1 ml kuluçkaya bırakılır. kapak gözlük kullanılmaktadır zaman 3.4 adıma geçin.
   Not: DAPI hücre çekirdekleri lekeleyen bir DNA interkalasyon boyadır.
   1. Her bir mikroskop lamı üzerine monte çözeltisi 10 ul uygulanır. bir mikroskop lamı üzerine montaj çözümü üzerinde her cam kapak monte edin.
   2. gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. oje ile kapak gözlük kenarları mühür. Gecede oje duman kaldırmak için bir davlumbaz içine karanlıkta yerleştirin.
4. Floresan Mikroskopi ¹⁹
   1. Ertesi gün, 40X objektif kullanılarak floresan mikroskop ile hücrelerin inceleyin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) 'dir.

Sonuçlar

Eksojen c-MYC çekirdeği (Şekil 1A) ağırlıklı çıktı ise yabani tip KIF5B, sitoplazmada homojen çıktı dile getirdi. Ancak, motorsuz KIF5B mutant sitoplazma (Şekil 1A) içinde agrega kurdu. motorsuz KIF5B agregasyonu c-myc agregasyonunu neden olmuştur. hücrelerin yüzdesi düşük doğal tipte KIF5B ifade eden hücrelerde TagCFP-etiketli c-myc birleştirilmiş ifade edilmesi. Bununla birlikte, motorsuz KIF5B (Şekil 1A), birlikte ifade edildiğinde önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. C-myc mutant KIF5B gözlenen ortak yeri (Şekil 1) KIF5B c-myc ve hücre içi lokalizasyonu düzenler ve c-myc Kinesin-1 'deki bir kargo olduğunu göstermektedir. Konstrukt tek başına ifade edildiği Negatif kontroller Şekil 1A alt panelde yer almaktadır. Sonuçlar floresan emissio anlamlı boşaltma yoluyla olduğunu göstermektedirn. Motorsuz KIF5B da endojen c-myc (Şekil 1B) ve transkripsiyon faktör p53 (Şekil 2) 'nin birarada toplanmasını neden olduğunu belirten c-myc ve p53 hem Kinesin-1 yükler ve KIF5B hem endojen proteinlerin hücre içi lokalizasyonu düzenler. Birlikte kinesin-1 inhibitörü, c-myc ve p53 ⁵ hem de bengal lakton (RBL) yüksek molekül ağırlıklı türlerin ²⁰ indükler oluşumunu yükseldiğini sonuçları p53 olasılıkla Kinesin-1 bir kargo olup. C-MYC gibi nükleer transkripsiyon faktörü p53, aynı zamanda proteozomal bozulması ^21,22 için sitoplazmaya çekirdekten dışa dikkat çekicidir. Motorsuz KIF5B mutantının sentezleme hücre içi lokalizasyonu, c-fos etkiler ya da bir araya getirmek için (Şekil 3) sebep çünkü KIF5B transkripsiyon faktörlerinin hareket spesifiktir. Yukarıdaki veriler metoksi göstermektedirBu yayında kullanılan d kinesin-1 kargoların yüksek özgüllük tanımlanmasına izin verir. Benzer bir strateji, hem de diğer motorlu proteinlerine uygulanabilir.

Şekil 1: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-myc toplama indükler (A) HeLa hücreleri tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı) ve TagCFP-etiketli c-myc (mavi) ile transfekte edilmiştir.. MYC Cı-çekirdeği esas olarak ortaya TagCFP-etiketli ise tdTomato etiketli WT KIF5B sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada filamentli veya noktalı agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Mutant KIF5B ve c-MYC birlikte (pembe) co-lokalize. CFP-c-myc (%) ve bir toplanmayı gösteren hücreler (%) yüzdeleri gösterilmiştir. Sonuçlar olarak gösterilirSD (N = 3) ortalama ±. tdTomato etiketli KIF5B proteinler veya boş vektör (V) ile birlikte TagCFP-etiketli c-myc ekspresyonu ile Negatif kontroller alt panelde gösterilmektedir. (B) Benzer sonuçlar tdTomato etiketli WT, motorsuz KIF5B proteinleri (kırmızı) olarak ifade edilmiştir, endojen c-myc (yeşil) ile elde edilmiştir. tdTomato etiketli motorsuz KIF5B mutant sitoplazmada agrega oluşturulur ve endojen c-myc agregasyonunu neden olmuştur. agrega Her iki tür sitoplazmasında (turuncu) birlikte lokalize eş. çekirdekler boya Hoechst 33342 ve DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi t endojen p53 birikmesini uyarmaktadırendojen p53 (yeşil) çekirdekte esas olarak ortaya ederken HeLa hücrelerinde. sitoplazma, eksojen tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı), sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bunun aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi sitoplazma (sarı) içinde KIF5B eş-lokalizasyonu ve p53 ile sonuçlanan, p53 birikmesini arttırmaktadır. Deney üç kez uygulandı. çekirdek boyası DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-Fos agregasyonunu indüklemez vahşi tip tdTomato-etiketli (WT) KIF5B (kırmızı) çıktıesas olarak EGFP-c-fos (yeşil) çekirdekte esas çıktı ise HeLa hücrelerin sitoplazması içinde. Aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B İfade c-Fos toplanmasını teşvik etmedi. Deney dört kez uygulandı. hücrelerin çekirdekleri, boya DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ortak ters primer	5'-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 '
vahşi tip KIF5B ileri primer	5'-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 '
motorsuz KIF5B ileri primer	5'-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 '

Tablo 1: vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinlerini klonlamak için astar dizilerini sıralamaktadır.

Tartışmalar

tarif edilen yöntem, mikrotübül boyunca hareket yeteneği olmayan motorsuz KIF5B mutant özelliklerini kullanmaktadır, ama aynı kargo proteinleri ile etkileşim tetramerik proteini doğal tipte KIF5B olan dimerler ve böylece izin yeteneğini muhafaza eder yabani tip KIF5B olarak. Motorsuz KIF5B, bu nedenle, kargoyla agrega mislocalized dominant negatif mutant ve form olarak görev yapmaktadır. Bu yöntem (Şekil 1) ⁵ kinesin-1 kargo c-MYC tanımlamak için kanıtlanmıştır. Bu makalede, aynı motorsuz KIF5B mutant kinesin-1 bir başka potansiyel yük (Şekil 2) ve p53 tespit etmek için kullanıldı. Bu metodoloji Kinesin-1 ve diğer yüklerin tespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir. Bundan başka, mutant özgüllüğü negatif kontrol proteini, c-fos (Şekil 3) mutant etkisinin olmaması sağlanır.

Bu protokolde, vahşi ty tdTomato etiketliPE veya motorsuz KIF5B proteinin diğer bir floresan protein-etiketli bir aday kargo proteini ile birlikte eksprese edilmiştir. Bu durumda, canlı hücre, flüoresans mikroskopisi ve görüntüleme gerçekleştirilir. agrega oluşumu time-lapse görüntüleme ile izlenebilir. Alternatif olarak, tdTomato-etiketli protein tek başına ifade edilir ve fizyolojik düzeyde aday kargo protein spesifik antikorlar kullanılarak indirekt mikroskobik tarafından görüntülenmiştir. Floresan protein tdTomato parlaklığı ve Fotostabilitesi ¹⁷ için seçilir. Arka plan tam bir DMEM ortamıyla otomatik floresans dolayı yüksek ise, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır.

motorsuz KIF5B mutant stoikiometrik doğal tipte KIF5B olan dimerler oluşturur. Bu nedenle, kendi işlevini inhibe etmek ve agregatlar oluşturması için, vahşi tip muadilleri ile dimerleri meydana getirmek üzere motorsuz KIF5B mutantının yeterli miktarda ifade için çok önemlidir. , İfade optimizasyonu bu sorunu gidermek içinmotorsuz mutantının salgılamanın gereklidir. Bu dimerizasyon domenini ihtiva eden küçük bir motorsuz mutantı kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, uygun bir transfeksiyon reaktifi ve protokol optimizasyonu da gereklidir. DNA / transfeksiyon reaktifi ile HeLa hücre inkübasyon süresi ekzojen proteinleri ve hücre canlılığı ekspresyonu için, HeLa hücrelerinde optimize edilmiştir. İnkübasyon süresi, diğer hücre hatları için optimize edilmesi gerekebilir.

40X 4X arasındaki büyütme için, kapak gözlük gereklidir. Hücreler doğrudan kuyularda incelenebilir. Bu nedenle, bu durumda, iletişim kuralı, ucuz ve uygundur. 40X Yukarıdaki büyütme için, hücreler boyandıktan sonra, yağ daldırma hedefleri kapsamında incelenmek üzere mikroskop slaytlar üzerine monte edilmiştir, kuyularda kapak camları yetiştirilir ve edilmektedir.

motorsuz KIF5B protein agregatları gözlenmesi sitoplazma büyüklüğü ile sınırlıdır. Tespit etmek kolaydırBirçok memeli hücrelerinde toplar. Bununla birlikte, sitoplazma hacmi çekirdekleri yaklaşık ve nöritlere küçük olduğunda nöronal hücrelerde agrega gözlemlemek nispeten zordur.

Protokol, in vivo maya iki-hibrid ve biyokimyasal açılan deneyleri ^13-16 ilave olarak KIF5B ve yükler arasındaki ilişkiyi göstermek için kullanılır. Bütün bu deneyler farklı fiziksel koşullarda ilişkisini belirlemek ve bunların sonuçları birbirini tamamlayabilir. Ayrıca, diğer testlere göre, bu flüoresans deneyi avantajı KIF5B ile yüklerin hücre içi lokalizasyonu düzenlenmesini göstermektedir ki, (1 Şekil 2).

Protokol KIF5B ile sınırlı değildir ve başka bir kinesin motorların ^{3 ve} yükler ³ hücre içi ulaşım kullanılan miyozin motorlar ^23,24 gibi bazı diğer motorlu proteinlerin yükleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu motor proteinler de oligomerization için kinesin motorlar ve miyozin motorlar için mikrofilamentlerin, ve helezonik-coil kesimleri için mikrotübül boyunca hareket için motorlu etki içerir. Çoğu homodimerler ^3,23 oluşturur. Bu durumda, benzer bir strateji şekilde yüklerini belirlemek üzere motorsuz baskın negatif mutantlar oluşturarak bunlara uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
absolute ethanol (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Opti-MEM-I (transfection medium)	Life Technologies	51985
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961
formaldehyde, para	Fisher Scientific	O4042-500
Triton-X100	Fisher Scientific	BP151-500
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche	6365787001
Taq DNA polymerase	Life Technologies	10342020
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)	Roche	12111424
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-541A
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder	Life Technologies	SM1333
PureLink Quick Gel Extraction kit	Life Technologies	K210012
BamHI	New England Biolab	R0136
SalI	New England Biolab	R0138
T4 DNA ligase	New England Biolab	M0202T
Ethidium bromide	Thermo Scientific	17898
DMEM	Life Technologies	11995-065
c-MYC rabbit antibody	Cell Signaling	5606
p53 mouse antibody	Santa Cruz	sc-126
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody	Life Technologies	A11008
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody	Life Technologies	A11059
fluorescent microscope	Olympus IX71_Fluoview
computer software for imaging	cellSens