Kontrollü Sentezi ve yüksek Düzgün Poli Floresan Takibi (<em&gt; K</em&gt; -isopropylacrylamide) Mikrojeller

Özet

Sigara karıştırıldı çökelti polimerizasyonu uyaranlara duyarlı poli (N -isopropylacrylamide) dar bir boyut dağılımı mikrojelleri sentezi için hızlı, kopyalanabilir bir prototip bir yaklaşım sağlar. Bu protokol sentezinde, ışık saçılması karakterizasyonu ve geniş alan mikroskopisi kurulumunda bu mikrojellerin tek parçacık floresan izleme gösterilmiştir.

Özet

Uyaranlara duyarlı poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrojeller çeşitli prospektif pratik uygulamalar ve temel araştırma kullanır. Bu çalışmada, hızlı bir olmayan karıştırılmış yağış polimerizasyon prosedürü ile ayarlama mikrojel boyutu için bir vitrin olarak bir floresan etiketli PNIPAM jellerinin izleme tek parçacık kullanın. Bu yaklaşım, yeni reaksiyon bileşimlerini ve koşullannı prototip ya da ürünün büyük miktarlarda ihtiyaç uygulamalar için son derece uygundur. dinamik ve statik ışık saçılması ile mikrojel sentezi, partikül büyüklüğü ve yapısı belirlenmesi protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir. Fonksiyonel komonomerlerin ilavesi partikül çekirdeklenme ve yapısı üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğunu gösterilir. geniş alan floresan mikroskobu ile tek parçacık izleme olmayan etiketli mikrojellerin konsantre matris içinde etiketli izleyici mikrojellerin difüzyon soruşturma izin veren bir sistem tarafından kolaylıkla araştırılmamıştırDinamik ışık saçılımı gibi diğer yöntemler.

Giriş

Uyaranlara duyarlı poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrojeller ^1,2 nedeniyle çeşitli akıllı uygulamalar kendi potansiyeline son yirmi yılda sürekli ilgi çekmiştir. Kanıtlanmış kullanım durumları değiştirilebilir emülsiyon dengeleyiciler ^3-8, mikromercekleri ^9, kolay bir hücre hasat ^10,11 hücre kültürü substratlar, ve düşük molekül ağırlıklı bileşikler için, akıllı taşıyıcılar ve diğer biyomedikal ¹² kullanımları içerir. Görünüşünün temel araştırma açısından bu parçacıklar koloidal etkileşimleri ^13-15 ve polimer-solvent etkileşimleri ^16-18 gibi konuları araştırmak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Herhangi bir uygulamada PNIPAM mikrojelleri ve türevleri başarılı kullanımı, tipik olarak parçacık büyüklüğü dağılımının ortalama parçacık boyutu ve genişliği bilgi gerektirir. PNIPAM mikro içeren deneysel sonuçların doğru yorumlanması içinjeller, fonksiyonel komonomer etkilenebilir parçacık yapısı, bilinen edilmesi gerekir. Dinamik ve statik ışık saçılımı (DLS ve sırasıyla SLS) bu yöntemlerin hızlı ve kullanımı nispeten kolay, çünkü bu bilgileri elde etmek için benzersiz uygundur; ve onların doğal ortamından (dağılım) 'de non-invaziv parçacık özelliklerini sınayın. DLS ve SLS da mikroskopi yöntemleri için tipik küçük örneklem büyüklükleri, doğan önyargı kaçınarak parçacıkların çok sayıda veri toplamak. Bu nedenle, bu çalışmanın ilk amacı kolloidal karakterizasyonu yeni uygulayıcılar için ışık saçılmasına ilişkin iyi uygulama tanıtmaktır.

Tipik olarak, yağış polimerizasyon laboratuvar ölçeğinde yürütülen ve belirli parçacık özellikleri zahmetli olması ve sentez birçok tekrarlar gerektirebilir için doğru reaksiyon koşulları bulgudur. Büyük toplu sentezi aksine olmayan karıştırıldı çökelti polimerizasyonu ^19,20 arAPID prosedür farklı reaktif bileşimin toplu dar bir boyut dağılımı aynı zamanda verimli partikülleri polimerize edilebilir. Aynı anda polimerizasyonu deney varyasyonu en aza indirir ve büyük çıkış doğru reaksiyon koşulları, reaksiyon upscaling hızlı bulunabilir anlamına gelir. Dolayısıyla, bizim ikinci amacı prototipleme ve ürünün büyük miktarda gerektirmeyen uygulamalarda olmayan karıştırılan yağış polimerizasyon yararlılığını göstermektir.

sentez ve karakterizasyonu farklı yönlerini kolloidal etkileşim araştırmalarında floresan etiketli PNIPAM mikrojellerin uygulama örneğinde bir araya gelir. Burada geniş bir matris konsantrasyon aralığında etiketsiz matris mikrojellerin dağılım etiketli izleyici mikrojellerin difüzyon araştırmak ve konsantre kolloidal dispersiyon kafes etkisi çözmek için son derece doğru tek parçacık izleme özelliğini kullanabilirsiniz. Geniş alan floresan mikroskopi iyi fo uygundurr bunun bu amaç potansiyel olarak farklı matris türlerinin çok sayıda arasında bir kaç izleyici moleküllerin belirli davranışını karakterize edebilir. Bu büyük bir sistemde prob parçacıkların az sayıda davranışını çözemeyen, bu nedenle sistemin topluluk ortalama özelliklerini ölçmek ve DLS, SLS ve reoloji gibi tekniklerle, aksine bulunmaktadır. Bundan başka, bu özel örnekte, geleneksel ışık saçılma yöntemleri nedeniyle herhangi bir standart analiz geçersiz mutlaka çok dağılmasına neden olur, yüksek partikül konsantrasyonu, aynı zamanda kullanılan olamaz. otomatik veri işleme ve istatistiksel yöntemlerin kullanılması büyük örnek boyutları üzerinde ortalama tek parçacık takibi için de genel sistem davranışı, analiz sağlar.

Protokol

1. Microgel Sentezi

Not: N -isopropylacrylamide (NIPAM) n-heksandan yeniden kristalize edilmiştir. Alınan gibi diğer reaktifler kullanılmıştır.

1. Poli (NIPAM) matris mikrojelleri konvansiyonel Toplu sentezi
   1. Süzüldü 245 ml 1.8 g NIPAM ve 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) çözülür (0.2 um rejenere selüloz (RC) membran filtre) bir geri akış kondansatörü ile donatılmış 500 ml'lik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe içinde iki kez damıtılmış su, bir karıştırıcı ve bir kauçuk septumu.
   2. Bir termometre ve septum yoluyla azot girişi için 120 mm iğne takın.
   3. karıştırılırken, 60 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır. 40 dakika boyunca azot ile durulama işlemi çözelti oksilenlendirilmesi.
   4. Aynı zamanda oksijenin çıkarılması için iki kez damıtılmış su ve kabarcık azot ile çözelti süzüldü, 5 ml 155 mg potasyum persülfat (KPT) bir başlatıcı solüsyon hazırlanır.
   5. tam 5 ml KPS s Transferi120 mm'lik bir iğne ile donatılmış, bir azot yıkanmış bir şırınga içinde ların çözüme.
   6. üç boyunlu bir şişe içinde çözelti derecesinin üzerinde Azot iğnesi kaldırın ve reaktöre lastik septum ile hızlı bir şekilde KPH'nin çözeltisi ilave edilir.
   7. Polimerizasyon 60 ° C'de azot akışı ve yavaş karıştırma altında 1 saat boyunca sürmesine izin verin.
   8. Büyük agrega atmak için sıcak reaksiyon çözeltisinin filtre bir Buchner hunisi ve filtre kağıdı kullanın. dağılım soğumasını edelim.
   9. Santrifüj 257.000 x g'de dispersiyon 40 dakika boyunca üç kez yeniden disperse ve son olarak çift damıtılmış suyun minimum bir canlı miktarda tortu yeniden disperse vb. Genellikle bu 2-4 ml.
   10. depolamak için dispersiyon liyofilize.
2. Floresan Etiketli Poli (NIPAM) mikrojellerin Olmayan karıştırılmış Sentez
   1. cam kapta 257,7 mg NIPAM, 3.5 mg BİS ve 1.5 mg methacryloxyethyl tiokarbamoil rodamin B (boya) tartılır ve filtre çift distill 10 ml ekleyined su.
   2. Ultrasonicate, 15 dakika boyunca, boya-monomer çözeltisi su içinde boya çözülmesi için.
   3. Ayrı bir cam kap içine boya olmadan aynı çözüm hazırlayın.
   4. Çeşitli boya konsantrasyonları ile konsantrasyon serisi elde etmek için boya olmadan monomer çözeltisi kullanılarak boya monomer çözeltisinin çeşitli dilüsyonları hazırlayın. Bu çalışmada, 0.02-0.1 mmol / L konsantrasyon aralığında boya kullanır.
   5. başlatıcı çözüm elde etmek için çift distile su filtrelenmiş 10 ml 8.4 mg KPS çözülür.
   6. Nihai reaksiyon çözümleri elde etmek ve kauçuk septa ile mühür 10 mm çaplı test tüplerine KPH'nin çözeltisi 0.5 konsantrasyonu serisi ml ve 0.5 ml aktarın.
   7. 63 ° C'ye kadar bir ısıtma sirkülasyon pompasına bağlı bir çift-duvarlı cam kap içinde, bir yağ banyosu önceden ısıtın.
   8. 20 dakika boyunca 120 mm'lik iğneler üzerinden azot ile durulama işlemi Reaksiyon çözüm Deoxygenize.
   9. af içine tüpler yerleştirinplatformu loating ve önceden ısıtılmış yağ banyosu içine platformu batırmayın. 60 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlayın. Oda sıcaklığı çözümleri banyo soğumasını olarak banyosunda Başlangıçta yüksek sıcaklık gereklidir. yüksek hassasiyetli partikül boyutu ayarı için ilk reaksiyon sırasında sıcaklık kontrolü genellikle 0.1 ° C ±, titiz olmak zorundadır.
   10. Reaksiyon, uygun bir süre devam edelim. Tipik 1 saat yeterlidir.
   11. 60 ° C'de bir fırında hızlı bir şekilde reaksiyon tüpleri aktarın ve DLS karakterizasyonu için, PNIPAM hacim faz geçiş sıcaklığı (VPTT, 32 -34 ° C), ¹ üzerinde ısıtılmış iki kez damıtılmış su, süzüldü, 10 ml sıcak dispersiyonun bir damlası, koyun daraltılmış devlet.
   12. dağılımların kalanı oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve santrifüj tüplerine içine aktarabilirsiniz.
   13. 257.000 x g'de çözelti 40 dakika boyunca üç kez santrifüj ve iki defa destillenmiş su fo süzüldü 2 ml son mikrojellerinin seyreltikizleyici parçacıklar halinde r kullanım.

2. Işık saçılması Karakterizasyonu

1. Dinamik ışık saçılımı tarafından Daraltılmış Devlette Hidrodinamik Radius Belirlenmesi
   1. küvetleri yıkayın ve aseton buharı ile züccaciye.
   2. Isı PNIPAM VPTT üzerinde filtre (örneğin, 200 nm ya da daha küçük bir RC filtresi) iki kez damıtılmış 10 ml su.
   3. önceden ısıtılmış bir iğne (0.9 x 40 mm) ve şırınga (1 mi) ile süzülür, su, sıcak dispersiyonun bir damla aktarın.
   4. 50 ° C'ye kadar DLS goniometer endeksi maç banyosu öfke ve soğumasını izin vermeden alete örnek aktarmak.
   5. dağınık yoğunluğu test ölçümlerini gerçekleştirerek korelogram elde etmek için yeterli olan en büyük saçılma açısı bulun.
      1. Örnek küvet (parçacığı dispersiyonunun 1 ml 10 mm çapında bir cam tüp) yerleştirin. küçük saçılma açısı (burada 30 °) dedektör kolunu hareket ettirin.
      2. fo ışın profili kontrolr çoklu saçılma: vb primer ışın, hiçbir çoklu saçılma, etrafında hiçbir kızdırma sayısı aralığı en düşük saçılma açıyla ölçümü için uygun olup olmadığını kontrol edin (yaklaşık 30 ile 600 kHz arasında, yazılım penceresinin sağ üst köşesine..)
      3. En yüksek saçılma açısı goniometer kolunu (120 ° burada seçin). sayım oranı (30 ile 600 kHz arası) hala ölçümü için yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin. yoğunluğu çok düşük ise, açı saçılma düşürmek için kolu hareket ettirin.
   6. Olay kiriş etrafında kızdırma birden saçılma gözlenmesi halinde gerçekleşir, en düşük saçılma açıyla toluen banyo camından görsel ışını kontrol edin. Bu durumda, lazer yoğunluğu azaltmak ya da daha yüksek bir seyreltme kullanın.
   7. 60 sn minimum satın alma süresi ile - (140 ° örneğin, 30 °) minimum ve maksimum saçılma açısı arasındaki 20 correlograms kazanır. zayıf yoğunluğu büyük saçılma açıları için satın alma süresini artırınEğer gerekliyse.
2. Veri Analizi ³⁷
   1. göre saçılma açısı için vektörel büyüklükleri saçılma hesaplayın N, dispersiyonun kırılma indisi olduğu, vakumla Lazerin dalga boyu ve saçılma açısı.
   2. durumunda ölçüm yazılımı yoğunluğu korelasyon fonksiyonu sağlar , Elektrik alan korelasyon fonksiyonuna dönüştürmek göre . Parametre dağınık ışık ove mekansal bütünlük derecesi ile ilişkili bir ilgi çekmeyen enstrümantal parametredirDedektör alanı r.
   3. Yani, correlograms üzerinde kümülan analizi yapın, her elektrik alan korelasyon fonksiyonunun logaritmik olarak ikinci derece polinom uygun doğrusal en küçük kareler. uyum kesişim olarak görünür ve tam değer veri analizi açısından önemli değildir. Azami amplitüd% 20 - korelasyon genlik 10 olduğu şekilde, örneğin, anlamlı bir gecikme süresi τ değerine uygun kısıtlama. birinci dereceden terimin katsayısı, korelasyon fonksiyonunun ortalama çürüme oranı .
   4. ortalama difüzyon katsayısı için en olası değeri bulun doğrusal en küçük kareler tarafından parçacıkların sığdırmak . Eğer karşısında Doğrusal görünür ve hata içinde kökeni geçmez, tanecik boyutu dağılımı geniş ve hidrodinamik yarıçap yetersiz tanımlanmış olacaktır olduğunu.
   5. Stokes-Einstein ilişkiden ortalama hidrodinamik yarıçapı hesaplayın , burada Boltzmann katsayısıdır mutlak sıcaklık ve Dispersiyonun viskozitesi . standart sapması yayma için .
3. Statik ışını tarama ile partikül Yapı Tayini
   1. küvetleri yıkayın ve aseton buharı ile züccaciye. silindirik mercek etkisini en aza indirmek için 20 mm çapında veya daha büyük küvetler kullanın.
   2. Filtre (200 nm RC filtresi veya daha küçük), bir cam şişeye iki kez damıtılmış suyun yaklaşık 20 ml şişeye saflaştırılarak dispersiyonun bir damla aktarın. Üretim sürecinden geri kalan kirleri çıkarmak için numune hazırlama için kullanmadan önce 10 ml su ile filtre yıkayın.
   3. herhangi bir ortam ışığı kaynağına karşı örnek edin. mavi renk tonu gözlenirse, numune çok konsantre olması muhtemeldir. buna göre seyreltin.
   4. küvete filtrelenmiş su ile birden çok kez yıkama arka plan su numunesinin hazırlanması ve daha sonra küvete ve enstrüman lazer konumuna bağlı olarak, uygun numune hacmine kadar doldurun. Lazer menisküs gelen kırılan olmadan numune geçmelidir.
   5. instrum kalibreent bir toluen numune kullanılarak.
   6. Mevcut açısal aralığı boyunca su saçılmasını (arka plan) ölçün.
   7. tercihen birkaç dalga boylarında uygun bir açısal aralığında numuneden saçılma yoğunluğu ölçülür. ileri saçılma yoğunluğu normalize saçılma desen form faktörü olarak bilinmektedir.
   8. parçacık yapısı biliniyorsa, farklı dalga boylarında ölçülen veri setleri küresel uyum hesaplamak için uygun bir model ifadesini kullanın.
   9. (Örneğin FitIt! ³³⁾ direkt regularized bilinmeyen parçacık yapısı kullanımı veya daha genel bir dolaylı ters Fourier için parçacığın yaklaşık sınıflandırma için (sadece küresel partiküller için) çifti mesafesi dağılım fonksiyonunun deconvolution ^23,24 ile birlikte ^21,22 rutin dönüşümü yazın.
   10. durumunda uydurma veya inversiyon rutin polidispersiteye hesaplamak, parçacık yarıçap dağılım işlevinin bir tahmin sağlargöstergesi (kendi ortalama bölünmesi dağılımının standart sapma).

Geniş alan Floresan Mikroskopi 3. Parçacık Takibi

Not: 20 ° C'de 465 ± 7 nm ve 405 ± 7 nm hidrodinamik yarıçaplarının izleyici ve matris parçacıklarının sırasıyla partikül izleme için kullanıldı.

1. Örnek hazırlama
   1. iki kez damıtılmış su bilinen miktardaki liyofilize etiketlenmemiş mikrojelin bilinen miktarda yeniden dağıtılmasıyla konsantre matris mikrojel dağılımı hazırlanır. etiketli izleyici parçacıkların küçük bir hacim.
   2. mikroskop uygun izleyici mikrojel konsantrasyonunu onaylayın. izleyici parçacık parça alımı sırasında çapraz olasılığı ihmal edilebilir ve böylece yeterince düşük izleyici konsantrasyonuna sahip olurken optimum konsantrasyon, parça maksimum sayıda eşzamanlı satın almalar arasında bir uzlaşmadır.
   3. buharlaştırılmasıyla konsantre dispersiyonların hazırlanmasıbir fırın içinde su. buharlaştırma öncesi numunenin orijinal ağırlığa dispersiyonun ağırlığı karşılaştırarak ağırlıkça konsantrasyonunun belirlenmesi.
2. Veri Toplama ve Analizi
   1. İstenilen büyütme uygun bir objektif lens kullanın ve örnek izleyicilerin uyarılması ve eşzamanlı floresan toplama diyafram. Bu çalışmada, 100X / 1.3 NA yağ daldırma objektif lens kullanabilirsiniz.
   2. Ticari bir mikroskop sığar bir xyz-piezo masanın üzerine nem odasına yerleştirin.
   3. kurumasını örnek önlemek için, kayma üzerine istenilen konsantrasyonda nem odası ve poli (NIPAM) ve pipet 10 ul dağılım içine plazma temizlenmiş kapak kayma yerleştirin.
   4. floresan boya eksitasyon ve emisyon spektrumlarına göre, uyarma için uygun bir lazer uygun kullanılır ve lazer gücü ayarlar. yoğunluğu boyaların hızlı bir photobleaching önlemek için yeterince düşük, fakat en olmalıdırDoğru tek parçacık konumlandırma için yeterince güçlü aynı zamanda (aşağıya bakınız). Bu çalışmada, bir 561 nm diyot pompalı katı-hal lazer kullanımı ve tüm ölçümler için 16 mW (yaklaşık 0.5 kW cm ^-2 numune at) lazer gücü sabit tutmak.
   5. Homojen örnek aydınlatma elde etmek için, burada açıklanan kritik aydınlatma kurulum kullanmak. Bunun için, çift modlu fiber lazer (NA 0.22 ± 0.02, 0.6 mm çekirdek çapı), sırayla dışarı geçici ortalama lazer benekler bir vorteks cihazı kullanılarak lif sallamak, ve elyaf numunesi düzlem içine sonuna proje.
   6. kapak kayma arka yansıması z mesafeyi kalibre ve hafif yukarı objektif hareket ettirerek numune içine birkaç mikrometre odaklanma ve z-kompansatör kullanılarak z konumunu düzeltmek. Bu lamel arabirim etkileri önler.
   7. floresan sinyal gücü, poz süresi olarak dedektör parametreleri, ayarlayın. Bu durumda, bir EMCCD kamera kullanımı0.1 sn pozlama süresi ile, elektron modu ve 50 kazanç çarparak.
   8. numunenin farklı bölgelerindeki mikrojellerin ortalama kare yer değiştirmesini hesaplamak için yeterli gecikme süresini elde etmek için kare uygun sayıda birkaç film Edinme. Bu çalışmada, 500 veya 1000 kare edinimi çerçeve numaralarını kullanabilirsiniz.
   9. Gauss uydurma ²⁵ kullanılarak her çerçeve içinde parçacıklar konumlandırma verileri analiz etmek ve ortalama kare deplasman elde etmek için uygun bir partikül izleme algoritması ²⁶ kullanın. ²⁷ hesaplayın bütün filmlerde tüm parçaları üzerinden ortalama değerleri ve standart sapma. doğrusal regresyon uzun gecikme süresi difüzyon katsayılarını hesaplamak , nerede ortalama kare yer değiştirme, D ortalama difüzyon katsayısı ve gecikme zaman sabitleri.
   10. Avustralya, Brezilya ve Kuzey Amerika ülkelerinin kullandığı saat uygulamasıanormal difüzyon denklemi anomali parametre y Imate , Logaritmik ölçek verileri dönüştürerek verimli tarafından . anomali parametresi arsa türevi verilir. Türev polinom fonksiyonlar ile veri noktalarını uydurma ve analitik ayırt veri noktalarının sonlu farklar tahmin ya da edilebilir. polinom düzeni artırmak için uygun artığı ve kalan norm çizerek polinom uyum fonksiyonlarının yeterli derecesini belirlemek.
   11. mikrojel matrislerin farklı konsantrasyonları için aynı işlemi tekrarlayın.

Sonuçlar

Toplu PNIPAM mikrojel parçacıkların sayısı, ve bu yüzden son partikül hacmi, tiokarbamoil rodamin B toplu partikül sayısı yoğunluğuna azaltarak çekirdeklenmesini etkiler çekirdeklenme fazı ²⁰ Hidrofobik ko-monomer boya metakriloksietil sırasında reaksiyonun erken safhasında, belirlenir. Iki farklı başlangıç ​​NIPAM konsantrasyonları partikül konsantrasyonundaki azalma, Şekil 1 ...

Tartışmalar

fonksiyonel komonomer küçük miktarlarının eklenmesi PNIPAM türetilmiş mikrojelleri parçacık boyutu ve yapısı üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Eşzamanlı küçük ölçekli test tüpü polimerizasyon tür değişiklikleri açıklamak için iyi bir yöntem olduğunu ve hızla gerektiği gibi bir tepki upscaling için hedef partikül büyüklüğü için doğru tepkin kompozisyonlar bulmak için yardımcı olur. Par?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	VWR Chemicals	KRAF13455
Bisacrylamid	AppliChem	A3636
n-Hexane	Merck	104374
N-Isopropylacrylamide	Fisher Scientific	AC412785000	recrystallized from n-hexane
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences	23591
Potassium peroxodisulfate	Merck	105091
Silicone oil 47 V 350	VWR Chemicals	83851
Toluene	Sigma Aldrich	244511
F12 Refrigerated/heating circulator	Julabo	9116612
Microscope	Olympus	IX83
XY(Z) Piezo System	Physik Instrumente	P-545.3R7
100X Oil immersion objective	Olympus	UPLSAPO
QuadLine Beamsplitter	AHF Analysentechnik	F68-556T
Cobolt Jive 150 laser	Cobolt	0561-04-01-0150-300
Multimode Fiber	Thorlabs	UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD camera	Andor	DU-897U-CS0-BV
Laser goniometer	SLS Systemtechnik	Mark III
CF40 Cryo-compact circulator	Julabo	9400340
Laser goniometer system	ALV GmbH	ALV / CGS-8F
Multi-tau corretator	ALV GmbH	ALV-7004
Light scattering electronics	ALV GmbH	ALV / LSE 5004
Photon counting module	PerkinElmer	SPCM-CD2969	2 units in pseudo cross-correlation mode
633 nm HeNe Laser	JDS Uniphase	1145P
F32 Refrigerated/heating circulator	Julabo	9312632