Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Özet

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Özet

Bu kağıt gömülü polikarbonat (PC) ve kimyasal oksijen geçişlerini kombinasyonları altında hücre göçü incelemek için ince bir film ile polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikroakışkan cihaz bildirir. Hem kimyasal ve oksijen eğimleri büyük ölçüde in vivo hücre göçü etkileyebilir; Ancak, teknik sınırlamalar nedeniyle, çok az araştırma in vitro etkilerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu araştırmada geliştirilen cihaz istenilen kimyasal degradeler oluşturmak için serpantin şeklinde kanalların bir dizi yararlanır ve oksijen degrade üretimi için bir mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi patlatır. Kimyasal ve oksijen gradyanlar tarifi basit göç sonucu yorumlama sağlamak için birbirine diktir. etkin bir şekilde en az bir kimyasal tüketimi ile oksijen gradyanı elde etmek için, gömülü bilgisayar ince film bir gaz difüzyon engeli olarak kullanılır. geliştirilen mikroakışkan cihazşırınga pompaları ile çalıştırılan ve kurulumu basitleştirilmesi ve optimize edilmiş hücre kültürü koşulları sağlamak için hücre göçü deneyler sırasında, geleneksel bir hücre kuluçka makinesi içinde yerleştirilebilir. Hücre deneylerde, (stromal hücre türetilmiş faktör SDF-1α) ve oksijen gradyanları kemokinin kombinasyonları altında adenocarcinomic insan alveolar epitel hücrelerinin bazal, A549 ve göç çalışma cihazı kullanılır. Deney sonuçları cihazın kararlı bir şekilde dik olan kemokin ve oksijen gradyanlarını üretmektedir ve hücreler ile uyumlu olduğunu göstermektedir. göç çalışmanın sonuçları, oksijen gradyanlar geçişlerini kombinasyonları tek gradyan altında olanlardan tahmin edilemez altında hücre göçü yönlendirilmesinde önemli bir rol ve hücresel davranışı oynayabileceğini göstermektedir. Cihaz daha in vivo benzeri microenvi daha iyi hücre göçü çalışmaları teşvik edebilir hücre kültüründe kimyasal ve oksijen farkları arasındaki etkileşimleri çalışmak için araştırmacılar için güçlü ve pratik bir araç sağlarmının.

Giriş

Çözünebilir faktörleri ve oksijen geriliminin alansal dağılımı, in ^{vivo, 1, 2, 3, 4} önemli hücresel fonksiyonları da düzenler. Iyi hücreleri üzerindeki etkisini araştırmak için, kararlı bir şekilde, kimyasal ve oksijen gradyanlar üretme kabiliyetine sahip olan bir in vitro hücre kültürü platformu arzu edilen bir konudur. Çeşitli çözünür faktörler biyolojik faaliyetlerinde kilit rol oynayan ve hücresel davranışını etkiler. Son zamanlarda nedeniyle mikroakışkan tekniklerin ilerlemesi, stabil üreten kimyasal geçişlerini yeteneğine sahip mikroakışkan cihazların bir dizi hücre göçü ⁵ incelemek için geliştirilmiştir. Ayrıca birkaç çalışma, in vitro hücre kültürlerinde ^{6, 7, 8} için oksijen geriliminin gerekliliğini ortaya koymuştur. Ancak,Hücre kültürü için oksijen gerginlik kontrolü ağırlıklı olarak basınçlı gaz silindirleri ile oksijen tutucu veya hücre kuvöz için doğrudan kimyasal ek dayanır. Doğrudan kimyasal ilavesi, hücre kültürü ortamı değiştirir ve hücresel yanıtları etkiler. Oksijen kontrol kuluçka özel inkübatör tasarımı, hassas gaz akış kontrolü ve hipoksi koşulları elde etmek için azot gazı büyük bir hacmi gerektirir. Ayrıca, çeşitli oksijen gerginlikler ve degrade altında cep davranış çalışması geciktirir bu kurulum kullanarak oksijen dağılımını kontrol etmek olanaksız olduğunu. Bu sınırlamaları aşmak için, mikroakışkan cihazların bir dizi hücre kültürü uygulamaları ⁹ oksijen gradyanlar oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, çoğu buharlaşma ve kabarcık oluşturma sorunlara neden olabilir basınçlı gazlar kullanılarak işletilen edilir. Bu nedenle, genellikle karmaşık bir cihaz gerektirir ve uzun süreli hücre kültürü STUDIE güvenilir olmayabilirs.

Zorlukların üstesinden gelmek için ve daha fazla hücre göçü için kimyasal ve oksijen farkları arasındaki etkileşimleri çalışmak için, biz bir gömülü polikarbonat (PC) ince bir film ¹⁰ ile polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikroakışkan hücre kültürü cihazı geliştirdi. Cihaz bir PDMS membran ile ayrılmış, iki mikroakışkan kanal tabakadan oluşur. üst katman oksijen degrade nesil için bir PDMS-PC katmanı; alt tabaka, kimyasal gradyan üretimi ve hücre kültürü için PDMS yapılır. Cihaz aynı zamanda gaz tüpleri ve sofistike akış kontrol sistemleri kullanmadan dik kimyasal ve oksijen geçişlerini oluşturabilirsiniz. cihazda, PDMS büyük bir optik şeffaflık, gaz geçirgenliği ve hücre kültürü ve görüntüleme için biyolojik uyumluluk sağlar. Gömülü PC filmi verimli oksijen basıncı kontrolü için gaz difüzyon bariyeri olarak hizmet vermektedir. mikroakışkan kanal olarak, yılankavi şeklinde bir kanal kullanılan bir dizis kimyasal renk geçişlerini oluşturmak için. tasarım geniş dolayı onun güvenilirlik ve kolay deney düzeneği çeşitli uygulamalar için mikroakışkan cihazlar kimyasal renk geçişlerini oluşturmak için istismar edilmiştir. Ayrıca, kimyasal degrade profilleri sayısal simülasyon ile önceden kanal geometrileri değiştirilerek dizayn edilebilir. Oksijen degrade nesil için, daha önce laboratuarımızda ^{10, 11, 12} geliştirilmiştir mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi yararlandı. Oksijen azot tasfiye olmadan belirlenen alanlara temizlenmesi edilebilir. Biyolojik laboratuvarlarında pratik kullanım için, tüm deney düzeneği geleneksel hücre kültürü kuvöz ile uyumludur. Bu yöntemleri entegre ederek, aynı anda hücre göçü incelemek amacıyla toplu gaz tüpleri ve sofistike enstrümantasyon olmadan kararlı kimyasal ve oksijen geçişlerini oluşturabilirsiniz.

Protokol

Mikroakışkan Aygıt 1. Fabrikasyon

NOT: Tüm mikroakışkan cihaz yumuşak litografi çoğaltma kalıplama işlemi ¹³ kullanılarak imal edilir.

1. Mikroakışkan cihaz PDMS katmanları için kalıp imalatı
   1. mikroakışkan kanal desenleri piyasada mevcut illüstrasyon kullanarak veya çizim yazılımı tasarlayın. ¹⁴ baskı yüksek çözünürlüklü şeffaflık photomask için bir şirkete dosyayı gönderin.
   2. Aseton (≥99.5%), izopropil alkol ile temiz silikon gofret (IPA, ≥99.9%) ve etch tamponlu oksit (boe; 6: 1 _NH4 F.HF). deiyonize (DI) su ile durulayın ve bir azot tabancası ile gofret kurutmak.
   3. Negatif sesi Fotorezist Spin kat yaklaşık 20 g, SU-8 2050, 15 saniye için 500 rpm'de gofret üzerine ve daha sonra 2,000 rpm'de 30 saniye için.
      NOT: spin kaplama koşulu SU-8 2050 fotoğraf vermelidiroptik litografi sonra yaklaşık 75 mikron gofret üzerinde bir kalınlığa sahip katmanları karşı.
   4. Yumuşak fırında 65 ° C'de bir sıcak plaka üzerindeki gofret 3 dakika boyunca ve daha sonra 9 dakika süreyle 95 ° C de. Yumuşak fırında sonra, UV ışığı altında tasarlanmış şeffaflık maskeleri ile bir maske hizalama kullanarak gofret maruz; toplam maruz kalma enerjisi yaklaşık 300 mJ / cm ² olmalıdır. Maruz kalma sonrası fırında (PEB) 65 ° C 'de gofret, 2 dakika ve daha sonra da 7 dakika süre ile 95 ° C' de.
   5. PEB sonra mutlaka çalkalama ile ya da ultrasonik banyosuna 7 dakika boyunca (37 kHz ve 180 W etkili bir ultrasonik güç) SU-8 geliştirici gofret bırakın. Kalan SU-8 kaldırmak için aseton ve IPA ile gofret durulayın.
   6. yonga ve silan 100 ul (1 H, 1 H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) istenmeyen yapışmayı önlemek için ince bisküvi yüzeyi silanizasyon bir diyaframlı vakum pompası ile bağlantılı bir desikatör içinde 6 cm çapında Petri kabı içine. , 15 dakika süreyle pompa açmak kapatmakVe 30 dakika boyunca bir vakum desikatörde mühür.
   7. desikatöre dışına Silanlanmış gofret alın ve aşağıdaki ekran litografi işlemi için 15 cm çapında Petri onları bant:
2. İmalat ve PDMS tabakalarının takımı
   1. PDMS nin önceden polimerin hazırlanması
      1. 10 PDMS monomer (baz) ve sertleştirme ajanı karıştırın: 1 oranında (hac / hac). 60 dakika desiccator kurulumunda karışımı Degas.
   2. PC-gömülü üst tabakanın imalatı
      1. Üst tabaka akışkan kanal desenleri ile kalıp üzerine PDMS pre-polimer transferi 2 gr PDMS ince bir tabaka yapmak. 60 dakika boyunca gazının PDMS desiccator kurulumunda kalıp yerleştirin.
      2. PDMS kür için bir 60 ° C fırında kalıp gecede yerleştirin. Kalıp yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun.
      3. Oda sıcaklığına kadar kalıp serinleyin. kalıp üzerine PDMS nin önceden polimer ek bir 13 g dökün ve th PDMS şekilde gaz60 dakika için e desiccator kurulumu.
      4. Yavaş yavaş bir gaz difüzyon bariyeri olarak taze PDMS tabakası içine 1 mm kalınlığında PC filmi embed; Gerekirse kabarcıkları sınırdışı.
      5. 60 ° C fırında kalıp gecede koymak ve yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun.
      6. Oda sıcaklığına kadar tedavi PDMS serinleyin. Tüm kanal desenleri kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 cm ^{2 'lik} bir alana, bir neşter cihazı kesti ve kalıp PDMS levha soyulabilir.
      7. 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak giriş ve çıkışları için delikler. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal üst PDMS-PC katmanı saklayın.
   3. alt PDMS tabakanın imalatı
      1. Alt tabaka için kalıp üzerine PDMS nin önceden polimerin 11 g dökün. 60 dakika boyunca gazdan arındırın PDMS desikatör içinde kalıp yerleştirin. PDMS tedavisi için bir 60 ° C fırın içinde, kalıp bir gece boyunca devam edin. yatay bir düzlemde olduğundan emin olun.
      2. th soğumasınıOda sıcaklığına kadar e PDMS. Tüm kanal desenleri kapak ve kalıp kapalı soyulması yaklaşık olarak 5,5 x 5 cm ^{2 'lik} bir alana, cihazı kesin. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal alt PDMS katmanı saklayın.
   4. PDMS membran imalat
      1. Spin kat, yaklaşık 4 90 sn için, 100 rpm'de bir silanize boş gofret üzerine PDMS nin önceden g polimer ve daha sonra 4 saniye boyunca 3000 rpm. fırını içinde gece boyunca 60 ° C'de spin kaplı gofret fırında.
   5. cihazın montajı
      1. Fabrikasyon PDMS-PC üst tabaka ve yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir O ₂ plazma yüzey işleme makinesinde spin kaplı PDMS membran ile gofret yerleştirin. 40 sn için _O2 plazma B 90 PDMS yüzeylerin muamele.
      2. Sağ O ₂ plazma yüzey tedaviden sonra PDMS membran üzerine üst katmanı bağlamak. gümrüklü katmanları üst üste bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve onları koymakbağlanmayı teşvik etmek için 60 ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır.
      3. Oda sıcaklığına tabakadan soğutun ve her kanal için kalıpları kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 ^cm2'lik bir alana, bir neşter ile üst katmana birleştirilmiş örtüyü kesmesi. silikon gofret bağlı bir yapı soyulabilir ve 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak kimyasal degrade kanal girişlerine ve çıkışında delikler.
      4. 40 sn için 90 W plazma kullanılarak PDMS yüzeyler etkinleştirmek için, bağ yüzeyleri yukarı bakacak şekilde, O ₂ plazma yüzey işleme makinesinde membran bağlı üst tabaka ve fabrikasyon PDMS alt tabaka yerleştirin.
      5. yüzey işlemi hemen sonra bağlanması birlikte üst ve alt katmanları takın. tüm gümrüklü cihazın üstüne bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve fırın gecede 60 ° C koydu.
      6. fırın dışına tüm fabrikasyon cihazı alın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını.

2. mikroakışkan hücre gücü deneyi

NOT: Bu yazıda örnek olarak yaygın olarak kullanılan bir hücre hattı, adenocarcinomic insan alveoler bazal epitel hücre (A549), ve bir kemokin, stromal hücre kaynaklı faktör (SDF-1α), kullanın. diğer hücrelere ve kemokin üzerinde çalışan araştırmacılar için, buna göre deneysel süreçler ayarlayın lütfen.

1. Gün 0: Hücre hazırlığı
   1. Kültür DMEM F12 L-glutamin yerine,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti içeren tam büyüme ortamında A549 hücrelerinin hazır. % 0.25 tripsin-EDTA ile ayrışma ile alt kültür.
   2. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 140 x g'de ayrışmış hücreler santrifüj ile deneyler için hücre süspansiyonları hazırlanır. Mikroakışkan cihaz deneyler için, hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve tam 10 ml T75 şişesi içinde en az 1 x 10 ⁶ hücre tohumBüyüme ortamı.
      Not: Tüm hücre kültürü prosesleri, bir 37 ° C ve% 5 _CO2 atmosferi ile bir kuluçka gerçekleştirilir.
2. 1. Gün: Cihaz hazırlığı
   1. O ₂ plazma makinenin içine yerleştiriniz ve mikroakışkan kanal hidrofilik yüzeyler işlemek için 40 saniye boyunca 90 W O ₂ plazma ile tedavi.
   2. Hemen yüzey işleminden sonra, doğrudan kimyasal degrade kanal girişlerindeki PDMS katman içine delikli 2 mm çaplı deliklere iğneler takarak iki 14 G künt iğne yükleyin. iğneler mikroakışkan kanallarını bloke etmediğinden emin olun. Künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile GKD ₂ O 0.8 ml çizin. Su girişlerindeki hem iğnelerden akana kadar prizden kimyasal degrade kanala GKD ₂ O enjekte edilir.
   3. Dulbecco ve # ile fibronektin stok seyreltilmesi ile 50 ug / ml fibronektin çözeltisi 1 ml hazırlanması39 s Fosfat-Tamponlu Tuzu (DPBS).
   4. Çözelti girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından fibronektin çözeltisi infüzyonu.
   5. bilinen bir hücre kültürü inkübatöründe tüm cihazın bir gece boyunca inkübe edilir.
3. 2. Gün: Hücre tohumlama ve mikroskopi görüntüleme
   1. hücre tohumlama
      1. 0. günde yana kültürlenmiştir hücrelerden ortam aspire ve DPBS 5 mi 2 kez yıkama hücreleri. DPBS aspire tripsin-EDTA 2 ml ekleyin ve kap yüzeyinden hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübatör hücrelerin inkübe edin.
      2. şişeye hücreler ayrılmış ve çözelti içinde süspansiyona alınmış kadar bekleyin ve serumsuz ortam içinde 8 ml ekleyin (DMEM F12 +% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti). 15 ml konik bir tüp içine tüm sıvı transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 140 x g'de santrifüj o.
      3. Santrifüjden sonra süpernatan aspire ve nihai hücre yoğunluğu 1 x 10 ⁶ hücre / ml yapmak için serumsuz ortam, uygun bir miktarda ilave edin. Hemasitometre veya başka otomatik hücre sayım cihazı kullanarak hücre sayımı 1. Günden hazırlanan mikroakışkan cihaz çıkar.
      4. Orta girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından serumsuz ortam enjekte edilir. Kimyasal gradyan kanalın çıkışından hücre süspansiyonu 200 ul enjekte edilir.
      5. Hücreler mikroakışkan kanala girmiştir onaylamak için mikroskop altında cihazda hücre kültür odasının gözlemleyin. Nemli bir kap (örneğin, GKD ₂ O içinde bir plastik kutu) içine Cihazı ve aygıt yüzeyi üzerine hücre yapışmasını sağlamak için 5 saat için bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
   2. Reaktifler hazırlanmasıKimyasal gradyan üretimi için hastalar
      1. Serum-barındırmayan ortam içinde istenen konsantrasyonda (100 ng / ml) kimyasal (SDF-1α) hazırlayın. ve yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara kimyasal içermeyen serumsuz ortam çizin. daha sonra kullanmak için 1 ul / dk'lık bir akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın.
   3. Oksijen degrade üretimi için reaktiflerin hazırlanması
      1. 1 M NaOH çözeltisi 15 ml ve 200 mg / ml pirogalol çözelti 15 ml olun. sırasıyla yüksek saflıkta PTFE tüp ve yüksek saflıkta boru, bağlı iki ayrı 15 ml şırınga içine NaOH ve pirogallol çözümleri çizin. daha sonra kullanmak için 5 ul / dakika akış oranı ile bir şırınga pompası şırınga ayarlayın.
   4. Mikroakışkan cihaz kurulumu
      1. 5 saat inkübasyondan sonra, tüm cihaz çıkar ve 15 cm çapında Petri kabı üzerine yerleştirin. yapışkan macun kullanılarak Petri kabındaki cihazı sabitleyin. TransferiBir inkübatör canlı hücre görüntüleme mikroskop Petri kabı.
      2. Kimyasal degrade kanal girişlerine kimyasal degrade nesil için şırınga hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın.
      3. Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın.
      4. Nemli cihazı tutmak için Petri kabı GKD ₂ O yaklaşık 15 ml ekleyin. zaman lapsed görüntü yakalamak için canlı hücre görüntüleme mikroskobu kurmak ve bir görüntüyü her 15 dakika sürer.
4. 3. Gün: Veri toplama ve analizi
   1. Bir bilgisayara yakalanan görüntü dosyaları aktarın. açık kaynak kodlu bir görüntüsü, kullanarak görüntüleri analizalysis yazılım, ImageJ, Manuel İzleme için bir açık kaynak eklentisi (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) ve ücretsiz Kemotaksis Aracı yazılımı ile (http://ibidi.com/xtproducts / tr / Yazılım-ve-Görüntü-Analiz / Manuel Görüntü Analizi / Kemotaksis-ve-Göç-Aracı) ^{15, 16.}

Gradyanların 3. Karakterizasyonu

NOT: Kimyasal ve oksijen eğimleri önce veya hücre deneyleri sonrasında karakterize edilebilir.

1. Kimyasal degrade sayısal simülasyon
   1. hesaplamalı akışkan dinamiği (CFD) simülasyonu kullanarak Mikroakiskan laminar flow doğasını tahmin edin.
2. Oksijen degrade Deneysel karakterizasyonu
   1. 5 konsantrasyonda bir oksijen duyarlı fluoresan boya, tris (2,2'-bipiridil) rutenyum (III) klorür heksahidrat, su içinde bir çözelti hazırlamakmg / ml olmuştur.
   2. yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara oksijene duyarlı boya çözeltisini çizin. (Kimyasal gradyan üretimi için kullanılan akış hızı ile aynı) 1 ul / dk akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın.
   3. Kimyasal degrade kanal girişlerine şırıngalar hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın.
   4. 470 ± 20 nm optik filtreden geçen uyarım ışığı ile bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak fluoresans şiddetini ölçmek. serin bir CCD kamera kullanılarak 515 nm uzun geçiş emisyon filtresi aracılığıyla emisyon ışığı toplamak.
   5. Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen için şırınga ile şırınga pompası açıngradyan nesil.
   6. hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın.
   7. Oksijen degrade üretimi için akışını durdurmak ve oksijen üretim kanalına tüm boru bağlantısını kesin. Oksijen degrade kanalın çıkışına gaz silindirleri yüksek saflıkta tüp bağlayın.
   8. Oksijen gradyanı kanala bağlı boru içine hava, saf azot ve saf oksijen akışı olduğunda hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın.
   9. Kaynaklar 10 ve 11, uygun olarak Stern-Volmer denklemi kullanılarak floresans görüntüleri analiz ederek oksijen gradyanlar tahmin.

Sonuçlar

Fabrikasyon PDMS-PC melez mikroakışkan hücre kültürü aygıtı. İncir. 1 Bir fotoğraf ve mikroakışkan cihazın bir örneğini göstermektedir. alt tabaka altı farklı karışım oranları ile iki ayrı girişlerden tanıtıldı reaktif çözümler üretmek için serpantin şeklinde kanalların dört düzeyleri içerir. (Sol: sağ) 1: girişlerden kişiye iki çözelti arasındaki 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4 ve 0 Teorik olarak, altı farklı karışım oranları 1 bulunmaktadır. Altı farklı karıştırma oranı çözeltiler inşa kimyasal gradyanlar aşağı akış yönünde bulunan, hücre kültür odası içinde oluşturulabilir. Üst ve alt tabakalar, PDMS membran ile ayrılır. Üst katmanda, oksijen tutucu kimyasal reaksiyon için reaktif iki ayrı girişlerden mikroakışkan kanal içine yerleştirilir. Reaktifler hemen hücre kültür odası üzerine akan önce reaksiyon için birbirleri ile karıştırılırlardoğrudan kimyasal temas etmeden alt kanaldan oksijen, temizlemek. PDMS ile karşılaştırıldığında daha küçük bir gaz difüzyon katsayısı ile gömülü bilgisayar film, oksijen tutucu daha verimli hale getirir bir difüzyon bariyeri olarak görev yapar. Oksijen kademeli akış yönü boyunca bir oksijen gradyanı oluşturulması için alt bölgede PDMS geriye hücre kültür odası dağılır. oksijen tutucu kimyasal reaksiyonun mekansal sınırlı olduğundan, yalnızca yerel oksijen gerginlikler etkilenir. Bunun bir sonucu olarak, cihazın genel oksijen gerilimi değiştirmeden, geleneksel bir hücre kuluçka makinesi içinde kullanılabilir. Taşıma deneylerde, hücreler, gözlem için hücre kültür odası içinde tohumlanır. büyüme ortamı ve kimyasal reaktifler tam kontrollü akış oranları ile şırınga pompaları kullanılarak cihaza tanıtıldı.

Kimyasal ve oksijen geçişlerini karakterizasyonu cihazın içinde oluşturulan. Nedeniyle to akış davranışları hesaplamalı akışkan dinamiği (CFD) simülasyonu kullanılarak tahmin edilebilir, Mikroakiskan doğasını akış laminer. Bu yazıda bir 3D modeli inşa ve piyasada mevcut multiphysics modelleme yazılımı kullanılarak simülasyon yapıldı. İncir. 2 (a) floresan yoğunluğu ölçümleri ve sayısal simülasyon sonuçlarına göre hücre kültür odasının genişliği boyunca deneysel karakterize floresein konsantrasyon profilleri arasında bir karşılaştırma gösterir. deneysel ve simülasyon sonuçları arasındaki anlaşma CFD modeli de cihazın içinde üretilen kimyasal geçişlerini tahmin düşündürmektedir. İncir. (B) 2 hücre kültür odası içinde oluşturulan simüle SDF-1α gradyanı çizer. İncir. 3 hücreli deneyleri önce hücre kültür odası içinde oksijen duyarlı floresan boya akan oksijen degrade tanımlama sonuçlarını gösterir. Sonuç, bir oksijen Gradi belirtiryaklaşık 1 ile% 16 arası değişen ent, söz konusu protokolü kullanılarak tespit edilebilir.

Hücre göçü sonuçları. Bir gösteri olarak, 4 kemokin kombinasyonları (SDF-1α) ve oksijen gradyanlarıyla A549 hücre göçü çalışmalar yapılmıştır: (1) herhangi bir kemokin ile bir kontrol olarak oksijen gradyanlar, (2) bir kemokin gradyanı ile ve bir oksijen gradyan olmadan (3) bir oksijen gradyanı ile bir kemokin gradyanı olmaksızın ve (4) kemokin ve oksijen gradyanlar hem. İncir. 4 Tüm deney düzeneği fotoğrafını gösterir. Deneyler Bütün içine yerleştirilir (mikroakışkan cihazlar, şırınga pompaları ve canlı hücre görüntüleme mikroskoplar da dahil olmak üzere), tüm kurulumu ile, geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe gerçekleştirildi. Hücre göçü, sonuçları Şekil l'de gösterilmiştir. 5. İncir. 5 (a) canlı hücre görüntüleme ana kullanarak deneyler sırasında toplanan görüntüleri gösterirLyzer ve Şek. 5 (b) ve (c) eklentileri ile ImageJ yazılım ile analiz dört kombinasyonları altında hücre göçü yörüngeleri ve ortalama hareketleri çizer. Sonuçlar kontrol ortalama hücre göçü mesafesi deneyde hücre rastgele hareketini ileri süren sıfıra yaklaşırken göstermektedir. Buna karşılık, sadece kemokin gradyanı ile, hücrelerin ortalama hareketi SDF-1α konsantrasyonu yüksektir soldan, doğrudur. sonuçlar, daha önce rapor edilmiştir A549 hücreleri, SDF-1α kemotaksis davranışını göstermektedir. oksijen gerilimi daha az olan, sadece oksijen gradyanları ile deneyde, hücrelerin ortalama hareket yukarı doğru. Daha ilginç bir şekilde, dik olarak kemokin ve oksijen gradyanlar ile deneyde, hücrelerin ortalama hareketi yukarı doğru ve yatay yönde belirgin bir hareket (kemokin gradyanı yönü) yoktur.

Şekil 1: Fabrikasyon PDMS-PC mikroakışkan hücre kültürü aygıtı. (A) güvenilir hücre göçü çalışmaları için dik kimyasal ve oksijen degradeler üretme kapasitesine sahip fabrikasyon cihazın deneysel fotoğraf. Kimyasal gradyan kanalı hücre kültür odası içinde gradyan nesil göstermek için mavi ve sarı gıda boyaları ile doldurulur. Oksijen degrade kanal kırmızı gıda boyası ile doludur. Ölçek çubuğu 1 cm dir. (B) mikroakışkan cihazın şematik. Üst tabaka hücre kültür odasının içine verimli oksijen degrade kontrolü için bir gaz difüzyon bariyeri olarak gömülü bir bilgisayar tabakası ile PDMS kullanılarak imal edilir. (C) üst ve alt tabakaların imalatı için ana kalıp. Için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.

Şekil 2: mikroakışkan hücre kültürü cihazın içinde kimyasal degrade. (A) Nümerik simüle ve deneysel hücre kültür odası (Y yönü) genişliği boyunca hücre kültür odasının içine floresein konsantrasyon gradyanı ile karakterize edilir. simüle ve deneysel ölçülen farkları arasındaki benzerlik simülasyon kimya degrade tahmin gösterir. Şekil içerlek simülasyonu için inşa üç boyutlu (3D) modelini göstermektedir. Hücre göçü, çalışmaları için hücre kültür odası genişliği boyunca SDF-1α kemokin gradyanı (b) nümerik sonucu. Bir görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 3: mikroakışkan hücre kültürü cihazın içinde oksijen degrade. Deneysel akış yönü boyunca hücre kültür odası içinde oksijen değişimleri ölçülmüştür. gradyanlar oksijene duyarlı floresan boya ve resim analizi kullanılarak hesaplanmıştır. gradyanlar, bölmenin soldan sağa doğru, karakterize edilir ve sonuç bölmenin genişliği boyunca tutarlı bir gradyan profili göstermektedir.

Şekil 4: deney düzeneği resimleri. optimize için mikroakışkan cihazlar, şırınga pompaları ve canlı hücre görüntüleme mikroskop dahil olmak üzere tüm kurulum, geleneksel bir hücre kültürü inkübatör içine yerleştirilirDeneyler sırasında hücre kültürü koşulları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: dik SDF-1α ve oksijen gradyan altında Hücre göçü çalışma sonuçları. (A) Görüntüler öncesi ve 12 saat hücre göçü çalışmanın ardından ele geçirdi. hücre göçü yolları canlı hücre görüntüleme mikroskop kullanılarak çekilen zaman lapsed görüntülerden analiz edilebilir. (B) 4 farklı degrade kombinasyonları altında çekilen görüntülerin hücre göçü yolları ve analiz ortalama göç hareketi: hayır gradyan, sadece kemokin gradyan, sadece oksijen degrade, hem kemokin ve oksijen gradyanlar. görüntüleri her 15 dakikada yakalandı. Ölçek çubuğu 250 mikron olan. Dik (oksijen gradyanı) ortalama hücre göçü mesafeleri (c) Arsalar ve yatay (kemokin gradyanı) dört farklı degrade kombinasyonları altında tarifi. Veriler, üç bağımsız deney kümelerinden elde edilen ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir ve 10 hücre her deneyde analiz edildi. İstatistiksel anlamlı bir farklılık (Student t-testi, p <0.01) sonuçlar farklı harfler (a ve b) tarafından tayin edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

gömülü bir bilgisayar ince film PDMS mikroakışkan cihaz imal etmek en kritik adımlar şunlardır: PDMS-PC üst tabakası imalatı ve (2) emin yaparken PDMS içine pre-polimer PC filmi takarken (1) tüm kabarcıklar kovma işlemleri kürlenme PDMS iyi tesviye yatay düzlemde gerçekleştirilir. Hücre göçü, deneyler için, en kritik adımlar şunlardır: (1) mikroakışkan cihaz içinde kabarcıklar ortadan deneyler sırasında tüp, ve şırınga pompaları; (2) mikroakışkan cihaz hücre göçü gözlem için canlı hücre görüntüleme sırasında iyi tesviye yatay düzlemde yerleştirilir sağlamak; ve (3) deneyler sırasında Petri kabı O GKD ₂ eklenerek ve su kurutulmuş olmadığından emin yaparak nemli cihazı tutmak.

başarıyla delaminasyon olmadan PDMS-PC hibrid mikroakışkan cihaz imal etmek amacıyla, PC fi boyunca tüm kabarcıklarını çıkarmak için kritik öneme sahiptirlm ekleme. PC filmi yavaş PDMS pre-polimer içine PC filmin yerleştirilmesi sırasında kabarcıkların oluşumunu önlemek için (yaklaşık 15 ila 30 derece uzaklıkta PDMS pre-polimer yüzeyinden) bir açıdan sokulabilir. Gerekirse, gömülü bilgisayar filmi ile tüm PDMS pre-polimer tuzak kabarcıklar çıkarmak için 10 dakika boyunca vakum pompasına bağlı bir kurutma yerleştirilebilir. PC filmi vakum işleminden sonra yukarı yüzen Eğer bir pipet tedavi PDMS katman üzerine PC filmi bastırın için kullanılabilir. Gerekirse vakum ve pres işlemleri tekrarlayın.

Hücre deneyleri için, hava kabarcıkları olmaması mikroakışkan hücre kültürü için çok önemlidir. hava kabarcıkları bağlantı yapmadan (şırınga pompaları, boru ve Mikroakışkan cihaz dahil) tüm mikroakışkan kurulum içine emin olun. hava kabarcıkları nedeniyle deneyimlerini yükseltilmiş sıcaklık altında gaz çözünürlüğünün azalmasına mikroakışkan kurulum içinde oluşturulur iseinkübatör içinde deney * yapılan örneğin, (pirogallol, büyüme ortamına dahil olmak üzere ve NaOH) ve reaktifler (şırıngalar ve boru dahil) deney malzemeleri, sıcaklık değişikliğini en aza indirmek için (en az 20 dakika önce kullanıma) önce inkübatöre yerleştirilebilir . Şırınga sık sık pompa içinde motorlarının çalışma ısı üretir pompalar. Kuvöz içinde şırınga pompaları çalıştırmak için genellikle kabul edilebilir; Ancak, deneyler sırasında inkübatör sıcaklığını kontrol yapmak. Sıcaklık deneyler sırasında yükseltir, ek soğutma işlemleri gerçekleştirilebilir gerekir. Birçok uygun soğutma yöntemleri örneğin, inkübatör içine buz kutusunda yerleştirilmesi inkübatör içine yerleştirilir şırınga pompaları sayısını azaltarak ya da bir güç soğutma sistemi ile bir inkübatör kullanılarak, kullanılabilir.

Bu çalışmada geliştirilen PDMS-PC mikroakışkan hücre kültürü cihazı güvenilir fo dik kimyasal ve oksijen degradeler üretebilenr hücre göçü çalışmaları. geliştirilmiş cihazın kısıtlama oluşturulan oksijen gradyan profili cihaz üzerinden, çevre atmosferden kimyasal reaksiyon atma tahrik oksijen akı, ve oksijen difüzyon arasındaki dengeye bağlıdır ve ortama olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, oksijen gradyan profili keyfi cihazın içinde kontrol edilemez. Mevcut mikroakışkan hücre kültürü platformları ile karşılaştırıldığında, bu çalışmada geliştirilen cihaz, kimyasal ve oksijen geçişlerini kombinasyonları altında hücre kültürü çalışmaları yürütebilecek ilk biridir. Tüm cihaz sıkıcı uyum ve pahalı enstrümantasyon olmadan, geleneksel yumuşak litografi çoğaltma kalıplama işlemini kullanarak imal edilebilir. Gradyanlar sayısal simüle ve deneysel in vitro hücre çalışmaları için daha fizyolojik mikro-benzeri koşulları sağlamak için karakterize edilebilir. Bir gaz di olarak PC filmi ile mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi kullanılarakffusion bariyeri, oksijen gradyan basınçlı gaz silindirleri ve gelişmiş gaz akımı gözetleme birimleri kullanmadan oluşturulabilir. Buna ek olarak, ayar kimyasal sadece küçük miktarlarda (günde en az 10 mi), oksijen gradyanlar korumak için gereklidir. Oksijen gerilim kontrolü mikroakışkan kanal etrafında yerel sınırlıdır ve ortam oksijen konsantrasyonu rahatsız etmediğinden, tüm kurulum ek sıcaklık, nem olmadan geleneksel hücre kültürü kuvöz içine yerleştirilir ve CO ₂ kontrol enstrümantasyon yapılabilir. Bunun bir sonucu olarak, geliştirilmiş cihazın pratik Biological Labs kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir.

Teknik sınırlamalar nedeniyle, oksijen gerginlikler altında cep davranışları nadiren mevcut literatürde incelenmiştir. Bu makalede geliştirilmiş bir cihaz yardımı ile oksijen gradyan altında hücre kültürü büyük ölçüde oksijen gradyan altında hücre çalışmaları teşvik, kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir. furthermore benzer bir çalışma prensibi, in vitro hücre kültürü ¹⁷ çalışmalar için, karbon dioksit ve nitrik oksit gibi diğer fizyolojik olarak ilgili gaz geçişlerini üretmek için uygulanabilir. Bu yetenekler PDMS-PC mikroakışkan cihaz in vitro hücre kültürü çalışmalarında ilerlemek için, uyuşturucu testi ve hücre çoğalması ve göç deneyleri dahil olmak üzere çeşitli hücre kültürü uygulamaları için büyük potansiyel gösteren göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Smartgene	6011-000
10 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Centrifuge Tube	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm Petri dish	Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
3 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4'' Silicon Dummy Wafer	Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Acetone	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner	M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan	AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotic-Antimyotic solution	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Biopsy punch	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
Blunt needle	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Gauge 14
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	for cell counting
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	PH3101-000000-72EC
Cell Culture Incubator	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	for numerical simulation of chemical gradients in the device
D-PBS	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronectin from Human Plasma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Inverted Fluorescence Microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMIL LED
Isopropyl Alcohol (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seoul, Korea	DBJ01B
Mechanical Convention Oven	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan	1943-0150
Plasma tretment system	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	for oxygen plasma surface treatment
Polycarbonate (PC) film	Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pyrogallol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Removable Adhesive Putty	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA
Spin Coater	ELS Technology, Hsinchu, Taiwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Developer	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Surgical blade	Feather, Osaka, Japan	5005093	for PDMS cutting
Syringe Pump	Chemyx, Houston, TX	Fusion 400
T75 Cell Culture Flask	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Nunc 156367
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621