Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

Riepilogo

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Abstract

Questo documento riporta un dispositivo microfluidica fatto di polidimetilsilossano (PDMS) con un policarbonato incorporato (PC) a film sottile per studiare la migrazione delle cellule in combinazioni di prodotti chimici e di ossigeno gradienti. Entrambi i gradienti chimici e ossigeno possono influenzare notevolmente la migrazione delle cellule in vivo; tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, pochissima ricerca è stata condotta per studiare gli effetti in vitro. Il dispositivo sviluppato in questa ricerca si avvale di una serie di canali a forma di serpentina per generare i gradienti chimici desiderate e sfrutta un metodo reazione chimica spazialmente confinati per la generazione del gradiente di ossigeno. Le direzioni dei gradienti chimici e ossigeno sono perpendicolari l'uno all'altro per consentire semplice interpretazione dei risultati migrazione. Al fine di generare in modo efficiente i gradienti di ossigeno con consumo di prodotti chimici minimo, il film sottile PC incorporato viene utilizzato come barriera di diffusione di gas. Il dispositivo microfluidica sviluppatopuò essere azionato da pompe siringa e collocato in un incubatore cella convenzionale durante gli esperimenti di migrazione cellulare per consentire la semplificazione di installazione e condizioni di coltura delle cellule ottimizzate. In esperimenti sulle cellule, abbiamo usato il dispositivo per studiare le migrazioni di cellule alveolari adenocarcinomic umane basali epiteliali, A549, sotto le combinazioni di chemochine (fattore derivato dalle cellule stromali, SDF-1α) e gradienti di ossigeno. I risultati sperimentali mostrano che il dispositivo può generare stabilmente perpendicolari chemochine e ossigeno gradienti ed è compatibile con le cellule. I risultati dello studio indicano che la migrazione gradienti di ossigeno possono svolgere un ruolo fondamentale nel guidare la migrazione delle cellule, e il comportamento cellulare in combinazioni di pendenze non possono essere previsti da quelli sotto singole sfumature. Il dispositivo fornisce uno strumento potente e pratico per i ricercatori per studiare le interazioni tra chimiche e ossigeno gradienti di coltura cellulare, che può promuovere un miglioramento degli studi di migrazione cellulare in più in vivo -come microenviam-.

Introduzione

La distribuzione spaziale dei fattori solubili e tensione di ossigeno può regolare una serie di importanti funzioni cellulari in vivo ^{1, 2, 3, 4.} Per studiare meglio il loro effetto sulle cellule, una piattaforma coltura in vitro di cellule in grado di generare stabilmente chimici e ossigeno gradienti è altamente desiderata. Vari fattori solubili giocano un ruolo chiave nelle attività biologiche e influenzano il comportamento cellulare. Recentemente, grazie al progresso di tecniche microfluidica, sono stati sviluppati un certo numero di dispositivi microfluidici grado di generare stabilmente gradienti chimici per studiare la migrazione cellulare ^5. Inoltre, diversi studi hanno anche rivelato la necessità di tensione di ossigeno per colture in vitro di cellule ^{6, 7, 8.} Però,il controllo della tensione di ossigeno per la coltura cellulare si basa principalmente su oltre chimica diretta per lo scavenging ossigeno o cellulari incubatori con bombole di gas sotto pressione. Inoltre chimica diretta altera il mezzo di coltura cellulare e colpisce le risposte cellulari. incubatori controllo Oxygen richiedono una progettazione speciale incubatore, controllo di flusso di gas preciso, e un grande volume di gas azoto per ottenere condizioni di ipossia. Inoltre, è praticamente impossibile controllare la distribuzione spaziale di ossigeno tramite questa impostazione, che ritarda lo studio comportamento cellulare in varie tensioni di ossigeno e gradienti. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati vari dispositivi microfluidici per generare gradienti di ossigeno per applicazioni di coltura cellulare ^9. Tuttavia, la maggior parte di essi si azionano con i gas in pressione, che possono causare problemi di evaporazione e di generazione di bolle. Pertanto, essi spesso richiedono strumentazione sofisticata e potrebbero non essere affidabile per coltura cellulare Studi a lungo termineS.

Per superare le sfide e di studiare ulteriormente le interazioni tra chimiche e ossigeno gradienti per la migrazione delle cellule, abbiamo sviluppato un dispositivo di coltura cellulare microfluidica fatto di polidimetilsilossano (PDMS) con un policarbonato incorporato (PC) a film sottile ^10. Il dispositivo è composto da due strati di canali microfluidici separati da una membrana PDMS. Lo strato superiore è uno strato PDMS-PC per la generazione di gradienti di ossigeno; lo strato inferiore è realizzato in PDMS per la generazione gradiente chimica e coltura cellulare. Il dispositivo può generare simultaneamente perpendicolari chimici e ossigeno gradienti senza usare bombole di gas e sofisticati sistemi di controllo di flusso. Nel dispositivo, PDMS offre grande trasparenza ottica, permeabilità ai gas, e la compatibilità biologica per coltura cellulare e imaging. Il film PC incorporato funge da barriera di diffusione di gas per il controllo della tensione di ossigeno efficiente. Nel canale microfluidico, abbiamo utilizzato una serie di canali a forma di serpentinas per generare gradienti chimici. Il design è stato ampiamente sfruttato per generare gradienti chimici in dispositivi microfluidici per diverse applicazioni grazie alla sua affidabilità e semplicità di setup sperimentale. Inoltre, i profili gradiente chimica possono essere progettati variando le geometrie dei canali preventivamente con simulazione numerica. Per la generazione del gradiente di ossigeno, abbiamo approfittato del metodo reazione chimica spazialmente confinate che è stato precedentemente sviluppato nel nostro laboratorio ^{10, 11, 12.} L'ossigeno può essere scavenging dalle aree designate senza spurgo di azoto. Per l'utilizzo pratico nei laboratori biologici, l'intero apparato sperimentale è compatibile con tradizionali incubatori per colture cellulari. Integrando questi metodi, possiamo allo stesso tempo di generare chimici e ossigeno gradienti stabili senza bombole di gas sfusi e strumentazione sofisticata al fine di studiare la migrazione delle cellule.

Protocollo

1. fabbricazione del dispositivo Microfluidic

NOTA: L'intero dispositivo microfluidica è fabbricato utilizzando il morbido processo di stampaggio litografia replica ^13.

1. Fabbricazione di stampi per strati PDMS nel dispositivo microfluidico
   1. Progettare i modelli di canale microfluidica utilizzando disponibili in commercio illustrazione o il software di disegno. Inviare il file a una società per alta risoluzione trasparenza stampa ¹⁴ fotomaschere.
   2. Wafer di silicio Pulire con acetone (≥99.5%), alcol isopropilico (IPA; ≥99.9%) e di incisione ossido tamponato (BOE; 6: 1 NH ₄ F.HF). Risciacquare con acqua deionizzata (DI) e disidratare il wafer con una pistola di azoto.
   3. cappotto Spin approssimativo 20 g di photoresist tono negativo, SU-8 2050 sui wafer a 500 giri al minuto per 15 secondi e poi 2.000 rpm per 30 sec.
      NOTA: La condizione di spin coating dovrebbe produrre SU-8 2050 fotoresistere strati con uno spessore di circa 75 micron su wafer dopo litografia ottica.
   4. cuocere morbido i wafer su una piastra C 65 ° per 3 minuti e poi a 95 ° C per 9 min. Dopo la cottura morbida, esporre i wafer utilizzando un assetto maschera con le maschere di trasparenza destinati ai raggi UV; l'energia totale esposizione dovrebbe essere di circa 300 mJ / cm ^2. bake post-esposizione (PEB) i wafer a 65 ° C per 2 minuti e poi a 95 ° C per 7 minuti.
   5. Dopo il PEB, immergere le cialde di SU-8 sviluppatore con forte agitazione o in un bagno a ultrasuoni (37 kHz e 180 W di potenza ultrasonica efficace) per 7 minuti. Lavare il wafer con acetone e IPA per rimuovere il residuo SU-8.
   6. Posizionare il wafer e 100 ml di silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) in un diametro di 6 cm Petri in un essiccatore collegato con una pompa a vuoto a membrana per wafer superficie silanizzazione per evitare l'incollaggio indesiderato. Accendere la pompa per 15 minuti, spegnerlo, E sigillare l'essiccatore con un vuoto per 30 min.
   7. Prendere le cialde silanizzati fuori dalla essiccatore e incollate a 15 cm di diametro piatti Petri per il seguente processo di litografia soffice:
2. Fabbricazione e montaggio di strati PDMS
   1. Preparazione del PDMS pre-polimero
      1. Mescolare PDMS monomero (base) e l'agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (v / v). Degassare la miscela nella configurazione essiccatore per 60 min.
   2. Realizzazione dello strato superiore PC-embedded
      1. Trasferimento 2 g di PDMS pre-polimero sullo stampo con i modelli di canale fluidici alto livello per renderlo un sottile strato di PDMS. Mettere lo stampo nel setup essiccatore a Degas il PDMS per 60 min.
      2. Posizionare la notte stampo 60 ° C forno per PDMS polimerizzazione. Assicurarsi che lo stampo è su un piano orizzontale.
      3. Raffreddare lo stampo a temperatura ambiente. Versare un ulteriore 13 g di PDMS pre-polimero sullo stampo e degassarla PDMS in thinstallazione di essiccatore e per 60 min.
      4. Lentamente incorporare a 1 mm film PC spessore nello strato PDMS fresco come una barriera di diffusione di gas; espellere eventuali bolle se necessario.
      5. Mettere la notte muffa in C forno a 60 °, e assicurarsi che sia su un piano orizzontale.
      6. Raffreddare il PDMS curate a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm ^2, che può coprire tutti i modelli di canale, e staccare la lastra PDMS dallo stampo.
      7. Punch fori per ingressi e le uscite con 2 mm di diametro biopsia pugno. Conservare lo strato PDMS-PC top fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito.
   3. Realizzazione dello strato inferiore PDMS
      1. Versare 11 g di PDMS pre-polimero sullo stampo per lo strato inferiore. Mettere lo stampo in un essiccatore a Degas il PDMS per 60 min. Mantenere la notte dello stampo in forno a 60 ° per curare il PDMS. Assicurarsi che è sdraiata su un piano orizzontale.
      2. Raffreddare °e PDMS a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo ad una superficie di circa 5,5 x 5 cm ^2, che può coprire tutti i modelli di canale, e sfilarlo dello stampo. Conservare lo strato PDMS fondo fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito.
   4. Realizzazione della membrana PDMS
      1. cappotto Spin circa 4 g di PDMS pre-polimero su un wafer di vuoto silanizzata a 100 rpm per 90 secondi e poi 3.000 rpm per 4 sec. Cuocere il wafer spin-rivestito in un forno a 60 ° C durante la notte.
   5. Assemblaggio del dispositivo
      1. Posizionare lo strato superiore PDMS-PC fabbricato e il wafer con la membrana PDMS spin-rivestito in una macchina di trattamento di superficie al plasma ₂ O con le superfici di incollaggio rivolto verso l'alto. Trattare le superfici PDMS con 90 W di O ₂ plasma per 40 sec.
      2. Incollare lo strato superiore sulla membrana PDMS subito dopo il trattamento superficiale al plasma O _2. Mettere un peso (circa 600 g) sulla parte superiore degli strati legati e metterli in un60 ° C overnight forno per promuovere bonding.
      3. Raffreddare i strati incollati a temperatura ambiente e tagliare la membrana legato allo strato superiore con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm ^2, che può coprire tutti i modelli di canale. Staccare la struttura legato dal wafer di silicio e perforare agli ingressi e uscita del canale sfumatura chimica utilizzando a 2 mm di diametro biopsia punch.
      4. Posizionare lo strato superiore della membrana-legato e lo strato inferiore PDMS fabbricate in O macchina di trattamento di superficie al plasma _2, con le superfici di incollaggio rivolto verso l'alto, per attivare le superfici PDMS utilizzando il plasma a 90 W per 40 sec.
      5. Attaccare gli strati superiore e inferiore insieme per incollaggio immediatamente dopo il trattamento di superficie. Mettere un peso (circa 600 g) sopra l'intero dispositivo di incollaggio e metterlo in un forno a 60 ° C durante la notte.
      6. Prendere l'intero dispositivo fabbricato dal forno e raffreddare a temperatura ambiente.

2. Assay Migrazione cellulare Microfluidic

NOTA: In questo lavoro, si usa una linea cellulare di uso comune, adenocarcinomic alveolari cellule epiteliali basali umano (A549), e una chemochina, fattore delle cellule stromali derivate (SDF-1α), come esempi. Per i ricercatori che lavorano su altre cellule e chemochine, regolare i processi sperimentali di conseguenza.

1. Giorno 0: preparazione delle cellule
   1. Cultura lo stock di cellule A549 in terreno di coltura completo contenente DMEM F12 L-glutammina sostituto, il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), e 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico. Sub-cultura per dissociazione con 0,25% tripsina-EDTA.
   2. Preparare sospensioni cellulari per gli esperimenti mediante centrifugazione cellule dissociate a 140 xg per 3 min a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di dispositivi microfluidici, contare le cellule utilizzando un emocitometro e seme di almeno 1 x 10 ⁶ cellule in un pallone T75 con 10 ml di completoterreno di coltura.
      NOTA: Tutti i processi di coltura cellulare vengono eseguite in un incubatore con 37 ° C e 5% CO ₂ nell'atmosfera.
2. Giorno 1: preparazione Dispositivo
   1. Posizionare il dispositivo nella macchina del plasma O ₂ e trattarlo con O ₂ al plasma a 90 W per 40 secondi per rendere il canale microfluidica superfici idrofile.
   2. Immediatamente dopo il trattamento superficiale, installare due 14 aghi smussati G inserendo direttamente gli aghi nei fori del diametro di 2 mm punzonate nello strato PDMS alle bocche canale gradiente chimico. Assicurarsi che gli aghi non bloccano i canali microfluidica. Disegnare 0,8 ml di DDH ₂ O utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G. Iniettare il DDH ₂ O nel canale gradiente di chimica dalla presa fino a quando l'acqua fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche.
   3. Preparare 1 ml di soluzione di fibronectina 50 mg / ml diluendo fibronectina magazzino con Dulbecco & #39; s fosfato-Buffered Saline (DPBS).
   4. Infondere la soluzione fibronectina dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché la soluzione fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche.
   5. Incubare tutta la notte in un dispositivo convenzionale incubatore di coltura cellulare.
3. Giorno 2: Cell semina e la microscopia di imaging
   1. cellulare semina
      1. Aspirare il mezzo dalle cellule che sono state coltivate dal giorno 0 e lavare le cellule con 5 ml di DPBS 2 volte. Aspirare il DPBS, aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA e incubare le cellule in incubatore per 5 minuti per staccare le cellule dalla superficie matraccio.
      2. Attendere finché le cellule vengono staccate e sospese nella soluzione e aggiungere 8 ml di mezzo privo di siero (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico soluzione) al pallone. Trasferire tutto il liquido in un tubo da 15 ml e centrifugare a 140 xg per 5 min a temperatura ambiente.
      3. Aspirare il surnatante dopo centrifugazione ed aggiungere una quantità appropriata di mezzo privo di siero per rendere la densità cellulare finale 1 x 10 ⁶ cellule / ml. Estrarre il dispositivo a microfluidi preparato il giorno 1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o di un altro strumento automatico conteggio delle cellule.
      4. Iniettare mezzo privo di siero dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché il fluido scorre da entrambi gli aghi alle bocche. Iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare dalla presa del canale sfumatura chimica.
      5. Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule sono state introdotte al canale microfluidica. Posizionare il dispositivo in un contenitore umido (ad esempio, una scatola di plastica con DDH ₂ O all'interno) e tenerlo in un incubatore di coltura cellulare per 5 ore per promuovere l'adesione delle cellule sulla superficie periferica.
   2. Preparazione di REAGEnt per la generazione di gradiente chimico
      1. Preparare la chimica (SDF-1α) alla concentrazione desiderata (100 ng / ml) in mezzo privo di siero. Disegnare il terreno privo di siero con e senza la chimica in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min per un uso successivo.
   3. Preparazione dei reagenti per la generazione di ossigeno gradiente
      1. Rendere 15 ml di soluzione 1 M di NaOH e 15 ml di 200 mg / ml soluzione pirogallolo. Disegnare il NaOH e soluzioni pirogallolo in due separati 15 ml siringhe collegate a elevata purezza tubi in PTFE e tubi di grande purezza, rispettivamente. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 5 ml / min per un uso successivo.
   4. configurazione del dispositivo microfluidica
      1. Dopo l'incubazione 5 ore, prendere l'intero dispositivo fuori e metterlo su un 15 cm di diametro Petri. Fissare il dispositivo nella scatola di Petri con stucco adesivo. trasferire ilCapsula di Petri per un live microscopio imaging cellulare in un incubatore.
      2. Collegare il tubo dalle siringhe per la generazione del gradiente chimica agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l'uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico.
      3. Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno.
      4. Aggiungere circa 15 ml di DDH ₂ O per la piastra di Petri per mantenere il dispositivo idratata. Impostare il microscopio imaging cellulare dal vivo per la cattura di immagini e ritardi, e scattare una foto ogni 15 min.
4. 3 ° giorno: la raccolta e l'analisi dei dati
   1. Trasferire i file immagine catturati a un computer. Analizzare le immagini utilizzando l'immagine di un open sourcesoftware ANALISI, ImageJ, con un plugin open source per Allineamento manuale (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) e un software gratuito Chemiotassi Tool (http://ibidi.com/xtproducts / it / software-and-Immagine-Analysis / Manual-Immagine-Analysis / chemiotassi-e-migrazione-Tool) ^{15, 16.}

3. Caratterizzazione dei gradienti

NOTA: I gradienti chimici e ossigeno possono essere caratterizzati prima o dopo gli esperimenti cellulari.

1. Simulazione numerica del gradiente chimico
   1. Stimare la natura flusso laminare di microfluidica utilizzando computazionali dinamiche fluidici simulazione (CFD).
2. Caratterizzazione sperimentale del gradiente dell'ossigeno
   1. Preparare un colorante sensibile all'ossigeno fluorescente, tris (2,2'-bipiridile) di rutenio (III) cloruro esaidrato, soluzione in acqua ad una concentrazione di 5mg / ml.
   2. Disegnare la soluzione colorante sensibile all'ossigeno in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min (identici ai flussi utilizzati per la generazione del gradiente chimica).
   3. Collegare il tubo dalle siringhe agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l'uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico.
   4. Misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con la luce di eccitazione che passa attraverso un 470 ± 20 nm filtro ottico. Raccogliere l'emissione di luce attraverso un filtro passa-emissione lunga 515 nm utilizzando una fotocamera CCD fresco.
   5. Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per l'ossigenogenerazione di gradiente.
   6. Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all'ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare.
   7. Arrestare il flusso per la generazione di gradienti di ossigeno e scollegare tutte le tubazioni al canale generazione di ossigeno. Collegare il tubo di elevata purezza dalle bombole di gas all'uscita del canale gradiente di ossigeno.
   8. Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all'ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare quando scorre l'aria, azoto puro, e ossigeno puro nel tubo collegato al canale del gradiente di ossigeno.
   9. Stimare i gradienti di ossigeno analizzando le immagini di fluorescenza utilizzando l'equazione di Stern-Volmer in base alle referenze 10 e 11.

Risultati

Fabbricato PDMS-PC ibrido microfluidica dispositivo coltura cellulare. Figura. 1 mostra una foto e un'illustrazione del dispositivo microfluidica. Lo strato inferiore contiene quattro livelli dei canali a forma di serpentina per generare soluzioni di reagenti introdotte da due ingressi separati con sei diversi rapporti di miscelazione. Teoricamente, i sei diversi rapporti di miscelazione sono 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, e 0: 1 (a sinistra: destra) tra le due soluzioni introdotte dagli ingressi. I gradienti chimici costruiti dai sei diverse soluzioni miscelatore rapporto possono essere generati nella camera di coltura cellulare, situato a valle. Gli strati superiore e inferiore sono separati da una membrana PDMS. Nello strato superiore, i reagenti per l'ossigeno reazione chimica scavenging vengono introdotti nel canale microfluidico da due entrate separate. I reagenti sono mescolati tra loro per la reazione immediatamente prima che scorre sulla parte superiore della camera di coltura cellulare perscavenging l'ossigeno dal fondo del canale, senza contatto chimica diretta. Il film PC embedded, con un coefficiente di diffusione di gas più piccolo rispetto al PDMS, agisce come una barriera di diffusione che rende ossigeno scavenging più efficiente. L'ossigeno si diffonde gradualmente nuovo nella camera di coltura cellulare attraverso il PDMS nella zona a valle per formare un gradiente di ossigeno lungo la direzione del flusso. Dal momento che la reazione chimica di ossigeno scavenging è spazialmente limitata, solo le tensioni di ossigeno locali sono interessati. Come risultato, il dispositivo può essere utilizzato in un incubatore cella convenzionale senza alterarne la tensione di ossigeno globale. Negli esperimenti di migrazione, le cellule vengono seminate all'interno della camera di coltura cellulare per l'osservazione. Il mezzo di crescita e reagenti chimici vengono introdotti al dispositivo utilizzando pompe a siringa con portate controllate.

Caratterizzazione dei gradienti chimici e ossigeno generato all'interno del dispositivo. A causa di tegli flusso laminare natura della microfluidica, comportamenti di flusso possono essere previsti con computazionali dinamiche fluidici simulazione (CFD). In questo lavoro, abbiamo costruito un modello 3D e svolta la simulazione utilizzando un software di modellazione multifisica disponibile in commercio. Figura. 2 (a) mostra un confronto tra i profili di concentrazione di fluoresceina sperimentalmente caratterizzati tutta la larghezza della camera di coltura cellulare basato su misure di intensità di fluorescenza ei risultati della simulazione numerica. L'accordo tra i risultati sperimentali e di simulazione suggerisce che il modello CFD può ben stimare i gradienti chimici generati all'interno del dispositivo. Figura. 2 (b) traccia il gradiente simulato SDF-1α generato nella camera di coltura cellulare. Figura. 3 mostra i risultati gradiente ossigeno caratterizzazione scorre il colorante fluorescente sensibile all'ossigeno all'interno della camera di coltura cellulare prima degli esperimenti cellulari. Il risultato indica che un gradi ossigenoent, che vanno da circa 1 a 16%, può essere stabilita utilizzando il protocollo suddetto.

Risultati della migrazione delle cellule. A dimostrazione, abbiamo effettuato studi di migrazione cellulare A549 in 4 combinazioni di chemochine (SDF-1α) e gradienti di ossigeno: (1) non chemochine e non gradienti di ossigeno come un controllo, (2) con un gradiente di chemochine e senza un gradiente di ossigeno, (3) con un gradiente di ossigeno e senza un gradiente chemochine, e (4) sia con chemochine e gradienti di ossigeno. Figura. 4 mostra la foto dell'intero apparato sperimentale. Gli esperimenti sono stati tutti eseguiti in un incubatore tradizionale coltura cellulare con l'intero setup (compresi i dispositivi microfluidici, pompe a siringa, e vivere microscopi imaging cellulare) posto al suo interno. I risultati della migrazione cellulare sono mostrati in Fig. 5. Figura. 5 (a) mostra le immagini raccolte durante gli esperimenti che utilizzano il imaging cellulare dal vivo analizzatore e Fig. 5 (b) e (c) trame le traiettorie di migrazione delle cellule e dei movimenti in media sotto le quattro combinazioni analizzati dal software ImageJ con i plugin. I risultati mostrano che la distanza media migrazione cellulare nel controllo avvicina a zero, il che suggerisce movimento casuale delle cellule nell'esperimento. Al contrario, con solo il gradiente chemochina, il movimento media delle celle è verso sinistra, dove la concentrazione SDF-1α è maggiore. I risultati suggeriscono il comportamento chemiotassi SDF-1α di cellule A549, che è stato segnalato in precedenza. Nell'esperimento solo con gradienti di ossigeno, il movimento media delle celle è verso l'alto, dove la tensione di ossigeno è inferiore. Più interessante, nell'esperimento con perpendicolari chemochine e ossigeno gradienti, il movimento media delle celle verso l'alto e senza alcun movimento evidente nella direzione orizzontale (chemochine direzione del gradiente).

Figura 1: Fabbricato PDMS-PC dispositivo di coltura cellulare microfluidica. (A) La foto sperimentale del dispositivo fabbricato in grado di generare in modo affidabile perpendicolari gradienti chimici e ossigeno per studi di migrazione cellulare. Il canale gradiente chimica è riempito con blu e giallo coloranti alimentari per dimostrare la generazione gradiente all'interno della camera di coltura cellulare. Il canale del gradiente di ossigeno è piena di colorante alimentare rosso. La barra della scala è di 1 cm. (B) L'schematica del dispositivo microfluidico. Lo strato superiore è fabbricato utilizzando PDMS con uno strato PC incorporato come una barriera di diffusione di gas per un efficace controllo del gradiente di ossigeno all'interno della camera di coltura cellulare. (C) Gli stampi master per la fabbricazione degli strati superiore e inferiore. Clicca qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: gradiente chimico all'interno del dispositivo di coltura cellulare microfluidica. (A) simulato numericamente e sperimentalmente caratterizzato gradiente di concentrazione di fluoresceina all'interno della camera di coltura cellulare per tutta la larghezza della camera di coltura cellulare (direzione Y). La somiglianza tra i gradienti simulati e misurati sperimentalmente indica che la simulazione può anche prevedere il gradiente chimico. La figura inserto mostra il modello tridimensionale (3D) costruito per la simulazione. (B) risultati della simulazione numerica del SDF-1α chemochina gradiente attraverso la larghezza della camera di coltura cellulare per gli studi di migrazione cellulare. Clicca qui per visualizzare ungrande versione di questa figura.

Figura 3: gradiente di ossigeno all'interno del dispositivo di coltura cellulare microfluidica. Sperimentalmente misurata gradienti di ossigeno all'interno della camera di coltura cellulare lungo la direzione del flusso. I gradienti sono stati stimati utilizzando il colorante fluorescente di ossigeno-sensibili e analisi delle immagini. I gradienti, da sinistra a destra della camera, sono caratterizzati, ei risultati mostrano profili gradiente coerenti in tutta la larghezza della camera.

Figura 4: Foto del setup sperimentale. L'intera configurazione, inclusi i dispositivi microfluidica, pompe siringa e un live microscopio imaging cellulare, è collocato all'interno di un incubatore tradizionale coltura cellulare per ottimizzarecondizioni di coltura cellulare durante gli esperimenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: la migrazione delle cellule risultati dello studio sotto perpendicolari SDF-1α e ossigeno gradienti. (A) immagini acquisite prima e dopo lo studio migrazione cellulare 12 h. I percorsi di migrazione delle cellule possono essere analizzati dalle immagini e ritardi catturati utilizzando il microscopio dal vivo imaging cellulare. (B) i percorsi di migrazione cellulare e il movimento di migrazione media analizzato dalle immagini catturate inferiore a 4 diverse combinazioni di pendenza: nessun gradiente, solo il gradiente chemochina, solo il gradiente di ossigeno, ed entrambe le chemochine e ossigeno gradienti. Le immagini sono state catturate ogni 15 min. La barra della scala è di 250 micron. (C) Piazzole delle distanze medie migrazione cellulare nel perpendicolare (gradiente di ossigeno) e orizzontale (gradiente chemochine) le istruzioni sotto quattro diverse combinazioni di gradiente. I dati sono espressi come media ± SD, ottenuti da tre gruppi sperimentali indipendenti, e 10 cellule sono state analizzate in ciascun esperimento. I (test t spaiato, p <0,01) risultati statistici significativamente differenti sono indicate con lettere diverse (A e B). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le fasi più critiche per fabbricare il PDMS dispositivo microfluidica con una pellicola sottile PC embedded sono: (1) espellendo tutte le bolle quando si inserisce il film PC nelle PDMS pre-polimero mentre fabbricare lo strato superiore PDMS-PC e (2) assicurandosi tutti i PDMS vulcanizzazione processi vengono eseguiti su un piano orizzontale ben livellato. Per gli esperimenti di migrazione delle cellule, le fasi più critiche sono: (1) l'eliminazione delle bolle all'interno del dispositivo microfluidica, tubi e pompe a siringa durante gli esperimenti; (2) portare il dispositivo microfluidico è posto su un piano orizzontale ben livellato durante l'imaging cellulare dal vivo per l'osservazione migrazione cellulare; e (3) mantenendo il dispositivo idratata con l'aggiunta di DDH ₂ O alla piastra di Petri durante gli esperimenti e fare in modo che l'acqua non è asciugata.

Al fine di realizzare con successo il dispositivo di microfluidica PDMS-PC ibrido senza delaminazione, è fondamentale per rimuovere tutte le bolle durante la fi PCinserimento lm. Il film PC può essere inserito lentamente da un angolo (circa 15 a 30 gradi dalle PDMS superficie pre-polimero) per impedire la generazione di bolle durante l'inserimento del film PC nelle PDMS pre-polimero. Se necessario, l'intero PDMS pre-polimero con la pellicola PC incorporato può essere collocato in un essiccatore collegato alla pompa a vuoto per 10 min per espellere le bolle intrappolate. Se il film PC galleggia dopo il processo di vuoto, un puntale può essere utilizzato per premere il film PC verso il basso sullo strato PDMS indurito. Ripetere i processi di vuoto e premere se necessario.

Per gli esperimenti di cella, una mancanza di bolle d'aria è critico per la coltura cellulare microfluidica. Assicurarsi che bolle d'aria vengono introdotti l'intera impostazione microfluidica (comprese le pompe siringa, tubi, e il dispositivo di microfluidica) quando si effettuano i collegamenti. Se le bolle d'aria vengono create all'interno della configurazione microfluidica causa della diminuzione della solubilità gas sotto la temperatura elevata del experiments all'interno dell'incubatrice, tutti i componenti sperimentali (incluse le siringhe e tubi) e reagenti (incluso il mezzo di crescita, pirogallolo, e NaOH) possono essere posizionati in incubatore anticipo (almeno 20 minuti prima dell'uso) per minimizzare la variazione di temperatura . Siringa pompe spesso generano calore dal funzionamento dei motori all'interno delle pompe. Di solito è accettabile utilizzare pompe a siringa all'interno incubatori; tuttavia, fare controllare la temperatura dell'incubatrice durante gli esperimenti. Se la temperatura eleva durante gli esperimenti, procedure di raffreddamento addizionali devono essere effettuate. Diversi metodi di raffreddamento fattibili possono essere impiegati, ad esempio in un riquadro di ghiaccio nell'incubatrice, riducendo il numero di pompe a siringa posta all'interno dell'incubatore, o utilizzando un incubatore con un sistema di raffreddamento forza.

Il dispositivo di coltura cellulare microfluidica PDMS-PC sviluppato in questo documento è in grado di generare in modo affidabile perpendicolari chimici e ossigeno gradienti fostudi di migrazione cellulare r. La limitazione del dispositivo realizzato è che i profili gradiente ossigeno generati dipendono dall'equilibrio tra flusso di ossigeno, azionata da scavenging reazione chimica, e la diffusione di ossigeno dall'atmosfera ambiente, attraverso il dispositivo, e nel mezzo. Come risultato, i profili gradiente di ossigeno non può essere arbitrariamente controllati all'interno del dispositivo. Rispetto alle piattaforme di coltura cellulare microfluidici esistenti, il dispositivo sviluppato in questo lavoro è il primo grado di svolgere studi di coltura cellulare in combinazioni di gradienti chimici e ossigeno. L'intero dispositivo può essere fabbricato mediante il processo di stampaggio di litografia replica morbido convenzionale, senza allineamento noioso e strumentazione costosa. I gradienti possono essere numericamente simulati e sperimentalmente caratterizzati per fornire condizioni microambiente come più fisiologico per studi sulle cellule in vitro. Utilizzando un metodo reazione chimica spazialmente confinati con una pellicola PC come gas dibarriera la La fusione, il gradiente di ossigeno può essere generato senza usare bombole di gas in pressione e sofisticate unità di controllo del flusso di gas. Inoltre, la configurazione richiede solo piccole quantità di sostanze chimiche (meno di 10 ml al giorno) per mantenere i gradienti di ossigeno. Dal momento che il controllo della tensione di ossigeno è limitata localmente intorno al canale microfluidica, e non disturba la concentrazione di ossigeno ambiente, l'intero setup può essere inserito all'interno di una convenzionale incubatore di coltura cellulare senza temperatura supplementare, l'umidità, e strumentazione di controllo di CO _2. Come risultato, il dispositivo sviluppato ha un grande potenziale per essere utilizzato praticamente in laboratori biologici.

A causa di limitazioni tecniche, comportamenti cellulare in tensioni di ossigeno sono raramente stati studiati nella letteratura esistente. Con l'aiuto del dispositivo realizzato in questo documento, coltura cellulare in gradienti di ossigeno può essere eseguita in maniera facile che promuove notevolmente studi cellulari in gradienti di ossigeno. Furthermore, un principio di funzionamento simile può essere applicata per generare altri gradienti gassosi fisiologicamente rilevanti, come l'anidride carbonica e l'ossido nitrico, per coltura cellulare in vitro ^17. Queste funzionalità dimostrano che il PDMS-PC dispositivo di microfluidica mostra un grande potenziale per varie applicazioni di coltura cellulare, tra cui test di droga e la proliferazione cellulare e saggi di migrazione, per avanzare in studi su colture cellulari in vitro.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Smartgene	6011-000
10 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Centrifuge Tube	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm Petri dish	Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
3 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4'' Silicon Dummy Wafer	Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Acetone	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner	M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan	AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotic-Antimyotic solution	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Biopsy punch	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
Blunt needle	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Gauge 14
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	for cell counting
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	PH3101-000000-72EC
Cell Culture Incubator	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	for numerical simulation of chemical gradients in the device
D-PBS	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronectin from Human Plasma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Inverted Fluorescence Microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMIL LED
Isopropyl Alcohol (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seoul, Korea	DBJ01B
Mechanical Convention Oven	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan	1943-0150
Plasma tretment system	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	for oxygen plasma surface treatment
Polycarbonate (PC) film	Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pyrogallol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Removable Adhesive Putty	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA
Spin Coater	ELS Technology, Hsinchu, Taiwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Developer	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Surgical blade	Feather, Osaka, Japan	5005093	for PDMS cutting
Syringe Pump	Chemyx, Houston, TX	Fusion 400
T75 Cell Culture Flask	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Nunc 156367
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621