Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

Resumo

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Resumo

Este artigo relata um dispositivo microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) com um policarbonato integrado (PC) de película fina para estudar a migração de células sob combinações de gradientes químicos e oxigênio. Ambos os gradientes químicos e oxigênio pode afetar significativamente a migração de células in vivo; no entanto, devido a limitações técnicas, muito pouca pesquisa foi realizada para investigar seus efeitos in vitro. O dispositivo desenvolvido nesta pesquisa tira vantagem de uma série de canais em forma de serpentina para gerar os gradientes químicos desejados e explora um método de reacção química espacialmente confinado para a geração de gradiente de oxigénio. As direcções dos gradientes químicos e de oxigénio são perpendiculares um ao outro para permitir a interpretação simples resultado da migração. A fim de gerar de forma eficiente os gradientes de oxigénio com um consumo mínimo de produto químico, o filme fino de PC incorporado é utilizada como uma barreira de difusão de gás. O dispositivo de microfluidos desenvolvidopode ser accionado por bombas de seringa e colocada num incubador de células convencional durante as experiências de migração celular para permitir a simplificação configuração e condições de cultura de células optimizadas. Em experiências de células, foi utilizado o dispositivo para estudar migração de células alveolares humanas adenocarcinomic basais epiteliais, A549, sob combinações de quimiocina (factor derivado de células do estroma, SDF-1α) e gradientes de oxigénio. Os resultados experimentais mostram que o dispositivo pode gerar estavelmente perpendiculares de quimiocinas e de oxigénio gradientes e é compatível com as células. Os resultados do estudo indicam que os gradientes de migração de oxigénio pode desempenhar um papel essencial para orientar a migração celular, e o comportamento celular sob combinações de gradientes não pode ser previsto a partir daqueles sob gradientes individuais. O dispositivo fornece uma ferramenta poderosa e prático para pesquisadores para estudar interações entre gradientes químicos e oxigênio em cultura de células, o que pode promover melhores estudos de migração de células em mais in vivo -como microenviam-.

Introdução

A distribuição espacial de factores solúveis e da tensão de oxigénio pode regular um número de funções celulares importantes in vivo ^{1, 2, 3, 4.} Para melhor investigar o seu efeito sobre as células, in vitro plataforma de cultura de células capazes de gerar de forma estável e gradientes químicos oxigenados é altamente desejada. Vários fatores solúveis desempenham papéis fundamentais em atividades biológicas e afetar o comportamento celular. Recentemente, devido ao avanço das técnicas de microfluidos, um número de dispositivos de microfluidos capaz de gerar de forma estável gradientes químicos foram desenvolvidos para estudar a migração celular ^5. Além disso, vários estudos também revelaram a necessidade de tensão de oxigênio para culturas de células in vitro ^{6, 7, 8.} Contudo,o controle da tensão de oxigênio para cultura de células depende principalmente da adição química direta para eliminação de oxigénio ou de células incubadoras com cilindros de gás pressurizado. Além química directa altera o meio de cultura celular e afecta as respostas celulares. incubadoras de controlo de oxigénio requerem uma concepção especial incubadora, o controlo preciso do fluxo de gás, e um grande volume de gás de azoto, de modo a alcançar condições de hipoxia. Além disso, é inviável para controlar a distribuição espacial de oxigênio usando essa configuração, o que retarda o estudo do comportamento celular sob várias tensões de oxigênio e gradientes. Para superar estas limitações, um conjunto de dispositivos de microfluidos foram desenvolvidos para gerar gradientes de oxigénio para aplicações de cultura de células ^9. No entanto, a maioria deles são operados usando gases pressurizados, que podem causar problemas de evaporação e de geração de bolha. Portanto, eles muitas vezes exigem instrumentação sofisticada e pode não ser confiável para Studie de cultura de células de longo prazos.

Para superar os desafios e estudar ainda mais as interacções entre os gradientes químicos e oxigênio para a migração celular, foi desenvolvido um dispositivo de cultura de células microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) com um policarbonato integrado (PC) de película fina ^10. O dispositivo é composto por duas camadas de canais de microfluidos separados por uma membrana de PDMS. A camada superior é uma camada de PDMS-PC para geração gradiente de oxigénio; A camada inferior é feita de PDMS para geração gradiente químico e cultura de células. O dispositivo pode gerar simultaneamente gradientes químicos e sem a utilização de oxigénio perpendiculares cilindros de gás e de sistemas de controlo de fluxo sofisticados. No dispositivo, PDMS fornece uma grande transparência óptica, permeabilidade ao gás, e compatibilidade biológica para a cultura de células e de imagem. O filme PC incorporado serve como uma barreira de difusão de gás para o controle de tensão de oxigénio eficaz. No canal microfluídico, utilizou-se uma série de canais em forma de serpentinas para gerar gradientes químicos. O projeto tem sido amplamente explorada para gerar gradientes químicos em dispositivos microfluídicos para diversas aplicações devido à sua confiabilidade e configuração experimental fácil. Além disso, os perfis de gradiente químico pode ser concebido através da variação da geometria do canal de antemão com simulação numérica. Para a geração de gradiente de oxigênio, levamos vantagem do método de reação química espacialmente confinado que anteriormente foi desenvolvido em nosso laboratório ^{10, 11, 12.} O oxigênio pode ser eliminado das áreas designadas sem purga de azoto. Para uso prático em laboratórios biológicos, toda a configuração experimental é compatível com incubadoras de cultura de células convencionais. Ao integrar esses métodos, podemos gerar simultaneamente gradientes químicos e oxigênio estáveis ​​sem cilindros de gás a granel e instrumentação sofisticada, a fim de estudar a migração celular.

Protocolo

1. Fabricação do dispositivo micro

NOTA: O dispositivo microfluídico inteira é fabricado usando o processo de moldagem suave litografia réplica ^13.

1. A fabricação de moldes para as camadas de PDMS no dispositivo de microfluidos
   1. Projetar os padrões de canais microfluídicos usando comercialmente disponível ilustração ou desenho de software. Envie o arquivo para uma empresa com alta resolução photomask transparência imprimir ^14.
   2. Bolachas de silício limpas com acetona (≥99.5%), álcool isopropílico (IPA; ≥99.9%), e óxido de etch tamponada (BOE; 6: 1 _de NH ₄ F.HF). Enxágüe com água deionizada (DI) de água e desidratar o wafer com uma arma de azoto.
   3. revestimento da rotação de aproximadamente 20 g de material fotosensitivo tom negativo, SU-8 de 2050, para as pastilhas a 500 rpm durante 15 segundos e, em seguida, 2.000 rpm durante 30 seg.
      NOTA: A condição spin coating deve render SU-8 2050 photoresistir a camadas com uma espessura de aproximadamente 75 um sobre as pastilhas após a litografia óptica.
   4. coza macio as bolachas sobre uma placa de aquecimento de 65 ° C durante 3 minutos e, em seguida, a 95 ° C durante 9 min. Após a cozer macio, expor as bolachas usando um alinhador de máscara com as máscaras de transparência concebidas sob luz UV; a energia total de exposição deve ser de cerca de 300 mJ / cm ^2. coza pós-exposição (PEB) as pastilhas a 65 ° C durante 2 minutos e depois a 95 ° C durante 7 min.
   5. Depois do PEB, mergulhar os wafers em SU-8 desenvolvedor com forte agitação ou num banho de ultra-sons (37 kHz e 180 W de potência ultra-sônica efetiva) para 7 min. Lavar a bolacha com acetona e IPA para remover o residual SU-8.
   6. Coloque a bolacha e 100 ul de silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) para a 6 cm de diâmetro, uma placa de Petri em um exsicador ligado a uma bomba de vácuo de diafragma para silanização superfície da bolacha a fim de evitar ligação indesejável. Ligue a bomba durante 15 minutos, desligue-oE selar o exsicador com vácuo durante 30 min.
   7. Tome as bolachas silanizadas fora do secador e gravá-los a 15 cm de diâmetro pratos de Petri para o seguinte processo de litografia suave:
2. Fabricação e montagem de camadas de PDMS
   1. Preparação do pré-polímero de PDMS
      1. Misture PDMS monómero (base) e o agente de cura a uma proporção de 10: 1 (v / v). Desgaseificar a mistura na configuração exsicador durante 60 min.
   2. Fabrico da camada superior incorporado-PC
      1. Transferência de 2 g do PDMS de pré-polímero para o molde com a camada superior padrões de canal de fluidos para fazer uma fina camada de PDMS. Coloque o molde na configuração do secador para desgaseificar as PDMS para 60 min.
      2. Coloque o molde durante a noite numa estufa a 60 ° C durante PDMS cura. Certifique-se de que o molde está num plano horizontal.
      3. Arrefecer o molde à temperatura ambiente. Pour um adicional de 13 g de PDMS de pré-polímero para o molde e desgaseificar o PDMS no the configuração do secador durante 60 min.
      4. Lentamente incorporar um 1 milímetro de filme PC de espessura para a camada de PDMS fresco como uma barreira de difusão de gás; expulsar as bolhas de se necessário.
      5. Coloque a noite molde no forno a 60 ° C, e certifique-se de que ele está em um plano horizontal.
      6. Arrefecer os PDMS curadas à temperatura ambiente. Cortar o dispositivo com um bisturi para uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm ^2, que podem cobrir todos os padrões de canal, e descolar da laje de PDMS do molde.
      7. Faça furos para entradas e saídas usando uma biópsia 2 mm de diâmetro. Armazenar a camada de PDMS-PC superior fabricada longe da poeira ambiente para montagem posterior.
   3. Fabricação da camada de PDMS de fundo
      1. Pour 11 g do pré-polímero de PDMS para o molde para a camada inferior. Coloque o molde no exsicador para desgaseificar as PDMS para 60 min. Manter o molde durante a noite numa estufa a 60 ° C para curar o PDMS. Certifique-se de que ele está deitado sobre um plano horizontal.
      2. Arrefecer the PDMS à temperatura ambiente. Cortar o dispositivo a uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm ^2, que podem cobrir todos os padrões de canal, e retire-a do molde. Armazenar a camada de PDMS inferior fabricada longe da poeira ambiente para montagem posterior.
   4. Fabricação da membrana PDMS
      1. Rotação revestimento aproximado de 4 g de PDMS pré-polímero em uma pastilha em branco silanizada a 100 rpm durante 90 segundos e, em seguida, 3000 rpm durante 4 seg. Assar o wafer revestido-spin em um 60 ° C forno durante a noite.
   5. Montagem do dispositivo
      1. Coloque a camada superior PDMS-PC fabricado eo wafer com a membrana PDMS revestido de giro em um O máquina de tratamento de superfície ₂ de plasma com as superfícies de ligação virado para cima. Trate as superfícies de PDMS com 90 W de O ₂ de plasma para 40 seg.
      2. Ligar a camada de topo sobre a membrana PDMS logo após o tratamento da superfície no plasma de O _2. Coloque um peso (cerca de 600 g) no topo das camadas ligadas e colocá-los numa60 ° C forno durante a noite para promover a ligação.
      3. Arrefecer as camadas ligadas a temperatura ambiente e cortar a membrana ligada à camada de topo com um bisturi para uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm ^2, que podem cobrir todos os padrões de canal. Descolar a estrutura ligada a partir do wafer de silício e furos nas entradas e saída do canal gradiente químico utilizando uma biópsia mm de diâmetro 2.
      4. Coloque a camada superior ligada à membrana e a camada inferior PDMS fabricadas na máquina de tratamento de superfície S ₂ de plasma, com as superfícies de ligação virado para cima, para activar as superfícies PDMS usando o plasma a 90 W durante 40 seg.
      5. Anexar as camadas superior e inferior em conjunto para a ligação imediatamente a seguir a tratamento de superfície. Coloque um peso (cerca de 600 g) no topo de todo o dispositivo ligado e colocá-lo num forno de 60 ° C durante a noite.
      6. Tome todo o dispositivo fabricado fora do forno e esfriar à temperatura ambiente.

2. Ensaio de migração celular Microfluidic

NOTA: Neste trabalho, usamos uma linha comumente usado celular, alveolar celular epitelial basal humana adenocarcinomic (A549), e uma das quimiocinas, factor de células estromais derivadas (SDF-1α), como exemplos. Para os pesquisadores que trabalham em outras células e quimiocinas, por favor ajustar os processos experimentais em conformidade.

1. Dia 0: Preparação de Células
   1. Cultura o estoque de células A549 em meio de crescimento completo contendo DMEM F12 substituto de L-glutamina, 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS), e 1% (v / v) de solução Antimicrob-antimicótico. Sub-cultura por dissociação com 0,25% de tripsina-EDTA.
   2. Preparar suspensões de células para as experiências por centrifugação células dissociadas a 140 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Para as experiências Dispositivo de microfluidos, contar as células utilizando um hemocitómetro e sementes pelo menos 1 x 10 ⁶ células num frasco T75 com 10 ml de completameio de crescimento.
      NOTA: Todos os processos de cultura de células são realizadas numa incubadora com uma temperatura de 37 ° C e 5% de _CO2.
2. Dia 1: preparação Dispositivo
   1. Colocar o aparelho na máquina de plasma de O ₂ e tratá-lo com o O ₂ no plasma a 90 W durante 40 seg para processar o canal microfluídico superfícies hidrofílicas.
   2. Imediatamente após o tratamento da superfície, instalar duas agulhas rombas 14 G por inserção directamente as agulhas nos orifícios 2 mm de diâmetro perfurados na camada de PDMS nas entradas dos canais de gradiente químico. Certifique-se de que as agulhas não bloqueiam os canais microfluídicos. Desenhe 0,8 ml de _ddH2O utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G romba 14. Injetar o DDH ₂ O para o canal de gradiente químico da tomada até que a água flui para fora de ambas as agulhas nas entradas.
   3. Prepare 1 ml de solução de fibronectina de 50 ug / ml por diluição da fibronectina com Dulbecco & #39; s Phosphate-Buffered Saline (DPBS).
   4. Infundir a solução de fibronectina a partir da saída do canal de gradiente químico utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 14 sem corte até que a solução flui para fora a partir de ambas as agulhas nas entradas.
   5. Incubar durante a noite todo o dispositivo numa incubadora de cultura celular convencional.
3. Imaging semeadura de células e microscopia: Dia 2
   1. sementeira celular
      1. Aspirar o meio das células que foram cultivadas desde o dia 0 e lava-se as células com 5 ml de DPBS 2 vezes. Aspirar o DPBS, adicionar 2 ml de tripsina-EDTA, e incuba-se as células na incubadora durante 5 minutos para separar as células da superfície do frasco.
      2. Esperar até as células são separadas e suspensas na solução e adicionar 8 mL de meio isento de soro (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicótico solução) ao balão. Transferir todo o líquido em um tubo de 15 ml e centrifugar a 140 xg que durante 5 minutos sob temperatura ambiente.
      3. Aspirar o sobrenadante após a centrifugação e adicionar uma quantidade adequada do meio isento de soro para fazer a densidade celular final de 1 x 10 ⁶ células / ml. Retire o dispositivo micro preparados no Dia 1. Contar as células usando um hemocitômetro ou outro instrumento de contagem de células automático.
      4. Injectar meio isento de soro a partir da saída do canal de gradiente químico utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 14 sem corte, até o meio flui para fora a partir de ambas as agulhas nas entradas. Injectar 200 ul da suspensão de células a partir da saída do canal de gradiente químico.
      5. Observar a câmara de cultura celular no dispositivo sob um microscópio para confirmar que as células foram introduzidos para o canal microfluídico. Colocar o dispositivo dentro de um recipiente húmido (por exemplo, uma caixa de plástico com _ddH2O para dentro) e mantê-lo numa incubadora de cultura de células durante 5 h para promover a adesão das células na superfície do dispositivo.
   2. Preparação de Reagentos para a geração de gradiente químico
      1. Prepara-se o (SDF-1α) químico, na concentração desejada (100 ng / mL) em meio isento de soro. Desenhar a meio isento de soro com ou sem o produto químico em duas separadas 3 ml seringas ligada à tubagem de alta pureza. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 1 mL / min para uso posterior.
   3. Preparação dos reagentes de geração de gradiente de oxigénio
      1. Adicione 15 ml de solução de NaOH 1 M e 15 ml de 200 mg / ml de solução de pirogalol. Desenhe a soluções pirogalol NaOH e em duas separadas 15 ml seringas conectadas a tubos de PTFE de alta pureza e tubos de alta pureza, respectivamente. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo de 5 ul / min para uso posterior.
   4. configuração do dispositivo microfluídico
      1. Após a incubação de 5 horas, tomar o dispositivo inteiro e colocá-lo em um 15 cm de diâmetro placa de Petri. Fixar o aparelho na placa de Petri com massa adesiva. transferir oUma placa de Petri com um microscópio de imagem de células vivas em um incubador.
      2. Ligue o tubo a partir das seringas para a geração gradiente químico para as entradas do canal de gradiente químico. Ligue a saída para tubulação que conduz a um reservatório de resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente químico.
      3. Ligue a tubagem de alta pureza a partir das seringas contendo NaOH e pirogalol para as entradas do canal de gradiente de oxigénio. Ligar a tubagem à saída para recolher os resíduos. Ligue a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente de oxigênio.
      4. Adicionar cerca de 15 ml de _ddH2O para a placa de Petri para manter o dispositivo hidratada. Configure o microscópio imagens de células vivas para captura de imagem tempo decorrido, e tirar uma foto a cada 15 minutos.
4. Dia 3: recolha e análise de dados
   1. Transfira os arquivos de imagens captadas para um computador. Analisar as imagens usando um uma imagem de código abertosoftware ANÁLISE, ImageJ, com um plugin de código aberto para Rastreio Manual (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) e um software livre Quimiotaxia Tool (http://ibidi.com/xtproducts / pt / Software-e-imagem-Analysis / manual-imagem-Analysis / Quimiotaxia-and-migration-tool) ^{15, 16.}

3. Caracterização dos gradientes

NOTA: Os gradientes químicos e oxigénio pode ser caracterizada antes ou após as experiências com células.

1. Simulação numérica do gradiente químico
   1. Estimar a natureza de fluxo laminar de microfluídica usando computacionais dinâmica de fluidos de simulação (CFD).
2. Caracterização experimental do gradiente de oxigênio
   1. Preparar um corante fluorescente sensível ao oxigénio, de tris (2,2'-bipiridil) ruténio (III), cloreto de hexa-hidratado, solução em água a uma concentração de 5mg / ml.
   2. Desenhar a solução corante sensível ao oxigénio em duas separadas 3 ml seringas ligada à tubagem de alta pureza. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo de 1 mL / min (idêntico para os caudais utilizados para a geração de gradiente químico).
   3. Ligue o tubo a partir das seringas para as entradas do canal de gradiente químico. Ligue a saída para tubulação que conduz a um reservatório de resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente químico.
   4. Medir a intensidade de fluorescência utilizando um microscópio invertido de fluorescência com a luz de excitação que passa através de um filtro óptico 470 nm ± 20. Coletar a luz de emissão através de um filtro de emissão de passagem longa 515 nm usando uma câmera CCD legal.
   5. Ligue a tubagem de alta pureza a partir das seringas contendo NaOH e pirogalol para as entradas do canal de gradiente de oxigénio. Ligar a tubagem à saída para recolher os resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para oxigéniogeração de gradiente.
   6. Recolher as imagens de fluorescência do corante sensível ao oxigénio que flui na câmara de cultura de células.
   7. Parar o fluxo para a geração de gradiente de oxigênio e desligue toda a tubulação para o canal de geração de oxigênio. Ligar a tubagem de alta pureza a partir dos cilindros de gás para a saída do canal de gradiente de oxigénio.
   8. Recolher as imagens de fluorescência do corante sensível ao oxigénio que flui na câmara de cultura de células quando flui ar, azoto puro, e oxigénio puro através da tubagem ligada ao canal de gradiente de oxigénio.
   9. Estimar os gradientes de oxigênio através da análise das imagens de fluorescência usando a equação de Stern-Volmer de acordo com referências 10 e 11.

Resultados

Fabricados PDMS-PC dispositivo de cultura de células microfluídicos híbrido. FIG. 1 mostra uma fotografia e uma ilustração do dispositivo de microfluidos. A camada inferior contém quatro níveis de canais em forma de serpentina para gerar soluções de reagentes introduzidos a partir de duas entradas separadas com seis proporções de mistura diferentes. Teoricamente, as seis diferentes razões de mistura são 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, e 0: 1 (à esquerda: para a direita) entre as duas soluções introduzidas a partir das entradas. Os gradientes químicos construídos pelos seis soluções-mistura proporção diferente pode ser gerado na câmara de cultura de células, localizada a jusante. As camadas superior e inferior são separados por uma membrana de PDMS. Na camada superior, os reagentes para a reacção de eliminação de química de oxigénio são introduzidos no canal de microfluidos de duas entradas separadas. Os reagentes são misturados uns com os outros para a reacção imediatamente antes de desembocar na parte superior da câmara de cultura de células delimpam o oxigênio do canal inferior, sem contato química directa. O filme PC incorporado, com um coeficiente de difusão de gás menores em relação ao PDMS, actua como uma barreira de difusão que faz com que a eliminação de oxigénio mais eficientes. O oxigénio difunde-se gradualmente para trás para a câmara de cultura de células através do PDMS na área a jusante, para formar um gradiente de oxigénio ao longo da direcção do fluxo. Uma vez que a reacção química de eliminação de oxigénio é espacialmente confinado, apenas a tensões de oxigénio locais são afectados. Como resultado, o dispositivo pode ser utilizado num incubador celular convencional sem alterar a sua tensão global de oxigénio. Nas experiências de migração, as células são semeadas dentro da câmara de cultura de células para a observação. O meio de crescimento e de reagentes químicos são introduzidos no dispositivo utilizando bombas de seringa com velocidades de fluxo controlada com precisão.

Caracterização de gradientes químicos e oxigénio gerado no interior do dispositivo. Devido à tele Fluxo Laminar natureza da microfluídica, comportamentos de fluxo pode ser previsto usando computacionais dinâmica de fluidos de simulação (CFD). Neste trabalho, construímos um modelo 3D e realizada a simulação usando um software de modelagem multifísica disponível no mercado. FIG. 2 (a) mostra uma comparação entre os perfis de concentração de f luoresceína experimentalmente caracterizadas através da largura da câmara de cultura de células com base em medições da intensidade de fluorescência e os resultados de simulação numérica. A concordância entre os resultados experimentais e de simulação sugere que o modelo CFD pode também estimar os gradientes químicos gerados no interior do dispositivo. FIG. 2 (b) representa graficamente o gradiente SDF-1α simulado gerado na câmara de cultura de células. FIG. 3 mostra os resultados da caracterização de gradiente de oxigénio que flui por o corante fluorescente sensível ao oxigénio no interior da câmara de cultura de células antes das experiências de células. O resultado indica que um gradi oxigénioent, variando de cerca de 1 a 16%, pode ser estabelecida utilizando o protocolo acima mencionado.

Resultados da migração celular. Como demonstração, foram realizados estudos de migração de células A549 com menos de 4 combinações de quimiocinas (SDF-1a) e gradientes de oxigênio: (1) ausência de quimiocinas e não gradientes de oxigênio como um controle, (2) com um gradiente de quimiocinas e sem um gradiente de oxigênio, (3) com um gradiente de oxigénio e sem um gradiente de quimiocina, e (4) com dois gradientes de oxigénio e de quimiocina. FIG. 4 mostra a foto de toda a configuração experimental. Os ensaios foram todos realizados numa incubadora de cultura celular convencional, com a configuração inteira (incluindo os dispositivos de microfluidos, bombas de seringa, e microscópios de imagem de células vivas) colocado no seu interior. Os resultados da migração de células são mostradas na Fig. 5. FIG. 5 (a) mostra as imagens recolhidas durante as experiências utilizando a imagem de células vivas anaLyzer, e a Fig. 5 (b) e (c) traça as trajetórias de migração celular e movimentos médios no âmbito dos quatro combinações analisadas pelo software ImageJ com os plugins. Os resultados mostram que a média da distância de migração de células no controlo se aproxima de zero, o que sugere que o movimento aleatório das células no experimento. Em contraste, apenas com o gradiente de quimiocina, o movimento média das células é para a esquerda, onde a concentração de SDF-1α é maior. Os resultados sugerem o comportamento quimiotaxia SDF-1α de células A549, que foi previamente reportados. Na experiência com apenas gradientes de oxigénio, o movimento média das células é para cima, onde a tensão de oxigénio é inferior. Mais interessante, na experiência com quimiocinas e gradientes de oxigénio perpendiculares, o movimento média das células é para cima e sem qualquer movimento óbvio na direcção horizontal (gradiente de quimiocina direcção).

Figura 1: Fabricados PDMS-PC dispositivo de cultura de células microfluídicos. (A) O foto experimental do dispositivo fabricado capaz de gerar de forma fiável gradientes químicos e oxigénio perpendiculares para estudos de migração celular. O canal de gradiente químico é preenchido com azul e amarelo corantes alimentares para demonstrar a geração de gradiente no interior da câmara de cultura de células. O canal de gradiente de oxigênio é preenchido com corante alimentício vermelho. A barra de escala é de 1 cm. (B) O esquema do dispositivo de microfluidos. A camada de topo é fabricada utilizando PDMS com uma camada de PC incorporado como uma barreira de difusão de gás para o controlo eficiente gradiente de oxigénio no interior da câmara de cultura de células. (C) Os moldes mestres para a fabricação das camadas superior e inferior. Por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura.

Figura 2: gradiente químico dentro do dispositivo de cultura de células microfluídicos. (A) simulado numericamente e experimentalmente caracterizado gradiente de concentração de fluoresceína no interior da câmara de cultura de células através da largura da câmara de cultura de células (direcção de Y). A similaridade entre os gradientes simulados e medidos experimentalmente indica que a simulação pode também prever o gradiente químico. A figura inserção mostra o modelo tridimensional (3D) construída para a simulação. (B) Resultado de simulação numérica do gradiente de quimiocina SDF-1α em toda a largura da câmara de cultura de células para os estudos de migração celular. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.

Figura 3: gradiente de oxigênio no interior do dispositivo de cultura de células microfluídicos. Medida experimentalmente gradientes de oxigénio no interior da câmara de cultura de células ao longo da direcção do fluxo. Os gradientes foram estimados utilizando o corante fluorescente sensível ao oxigénio e análise de imagem. Os gradientes, da esquerda para a direita da câmara, são caracterizadas, e os resultados mostram perfis de gradiente consistentes em toda a largura da câmara.

Figura 4: Fotos da montagem experimental. Toda a configuração, incluindo dispositivos microfluídicos, bombas de seringa, e um microscópio imagens de células vivas, é colocado dentro de uma incubadora de cultura celular convencional para otimizadocondições de cultura de células durante os experimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A migração celular resultados do estudo sob perpendiculares SDF-1a e oxigênio gradientes. (A) As imagens capturadas antes e depois do estudo de migração de células de 12 h. Os caminhos de migração de células pode ser analisada a partir das imagens caducado em tempo capturados usando o microscópio de imagens de células vivas. (B) Os caminhos de migração celular e o movimento de migração média analisados a partir das imagens capturadas com menos de 4 diferentes combinações de gradiente: nenhum inclinação, única gradiente de quimiocinas, única gradiente de oxigênio, e ambos os gradientes de quimiocinas e oxigênio. As imagens foram capturadas a cada 15 min. A barra de escala é de 250 mm. (C) A parcela de as distâncias médias de migração celular no (gradiente de oxigênio) perpendicular e horizontal (gradiente de quimiocinas) instruções em quatro combinações de inclinação diferentes. Os dados são expressos como a média ± DP, obtido a partir de três conjuntos experimentais independentes, e foram analisadas 10 células em cada experiência. Os (teste-t de Student não emparelhado, p <0,01) resultados estatísticos significativamente diferentes são designados por letras diferentes (A e B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os passos mais críticos para fabricar o PDMS dispositivo de microfluidos com uma película fina de PC incorporado são: (1) expelindo todas as bolhas ao inserir a película de PC em PDMS pré-polímero, enquanto a fabricação da camada de PDMS-PC superior e (2) certificando todos os processos de cura de PDMS são realizadas num plano horizontal bem nivelado. Para as experiências de migração celular, as etapas mais críticas são as seguintes: (1) eliminar as bolhas no interior do dispositivo de microfluidos, de tubos e bombas de seringa durante as experiências; (2) assegurar que o dispositivo de microfluidos é colocado sobre um plano horizontal, bem nivelada durante a imagem de células vivas para a observação a migração celular; e (3) manter o dispositivo hidratada por adição de _ddH2O para a placa de Petri durante as experiências e certificando-se de que a água não é seco.

De modo a fabricar com sucesso no dispositivo de microfluidos híbrido PDMS-PC sem delaminação, é crítico para remover todas as bolhas durante o PC Fiinserção lm. O filme de PC pode ser lentamente introduzida a partir de um ângulo (cerca de 15 a 30 graus de distância a partir do PDMS de superfície pré-polímero) para evitar a geração de bolhas durante a inserção da película de PC em PDMS pré-polímero. Se necessário, o PDMS inteiros pré-polímero com o filme PC incorporado podem ser colocados no exsicador ligado à bomba de vácuo durante 10 minutos para expelir as bolhas de ar. Se a película de PC flutua para cima depois do processo de vácuo, uma ponta de pipeta pode ser usado para pressionar o filme PC para baixo sobre a camada de PDMS curado. Repita os processos a vácuo e de imprensa, se necessário.

Para as experiências em células, a falta de bolhas de ar é crítico para a cultura de células de microfluidos. Certifique-se que não há bolhas de ar são introduzidas em toda a configuração microfluídico (incluindo bombas de seringa, tubos, e o dispositivo microfluídico) ao fazer as conexões. Se as bolhas de ar são criados dentro da instalação de microfluidos, devido à diminuição da solubilidade do gás sob a temperatura elevada da experiments dentro da incubadora, todos os componentes experimentais (incluindo as seringas e tubos) e reagentes (incluindo o meio de crescimento, pirogalhol, e NaOH) pode ser colocado na incubadora de antemão (pelo menos 20 minutos antes do uso) para minimizar a variação de temperatura . Bombas de seringa frequentemente gerar calor a partir da operação dos motores dentro das bombas. Geralmente é aceitável para operar bombas de seringa dentro de incubadoras; No entanto, não verificar a temperatura da incubadora durante os experimentos. Se a temperatura eleva durante as experiências, os procedimentos adicionais de refrigeração precisam de ser realizadas. Vários métodos de arrefecimento viáveis ​​podem ser empregues, tais como a colocação de uma caixa de gelo na incubadora, a redução do número de bombas de seringa colocado no interior da incubadora, ou utilizando uma incubadora com um sistema de arrefecimento força.

O dispositivo de cultura de células microfluídicos PDMS-PC desenvolvido neste trabalho é capaz de gerar de forma confiável gradientes químicos e oxigênio perpendiculares foestudos de migração celular r. A limitação do dispositivo desenvolvido é que os perfis de gradiente de oxigénio gerados dependem do equilíbrio entre o fluxo de oxigénio, conduzido por eliminação de reacção química, e a difusão do oxigénio a partir da atmosfera ambiente, através do dispositivo, e para o meio. Como resultado, os perfis de gradiente de oxigénio não pode ser controlada arbitrariamente dentro do dispositivo. Em comparação com plataformas de cultura de células microfluídicos existentes, o dispositivo desenvolvido neste trabalho é o primeiro capaz de realizar estudos de cultura celular sob combinações de gradientes químicos e oxigênio. Todo o dispositivo pode ser fabricado usando o processo convencional de moldagem por litografia macia réplica, sem alinhamento tedioso e instrumentação dispendiosa. Os gradientes podem ser simulado numericamente e experimentalmente caracterizado de proporcionar condições mais fisiológicas microambiente-like para estudos in vitro de células. Ao usar um método de reacção química espacialmente confinado com um filme de um PC como di gásbarreira ffusion, o gradiente de oxigênio pode ser gerada sem o uso de cilindros de gás pressurizado e unidades sofisticadas de controle de fluxo de gás. Além disso, a configuração requer apenas pequenas quantidades de produtos químicos (menos de 10 mL por dia) para manter os gradientes de oxigénio. Uma vez que o controlo da tensão de oxigénio está confinado localmente em torno do canal microfluídico, e não perturba a concentração de oxigénio ambiente, toda a instalação pode ser colocado dentro de uma incubadora de cultura de células convencional, sem adicional de temperatura, humidade, e CO ₂ a instrumentação de controlo. Como resultado, o dispositivo desenvolvido tem um grande potencial para ser praticamente utilizado em laboratórios biológicos.

Devido a limitações técnicas, comportamentos celulares sob tensões de oxigênio raramente têm sido estudados na literatura existente. Com a ajuda do dispositivo apresentado neste estudo, a cultura celular sob gradientes de oxigénio pode ser realizada de uma maneira fácil, que promove grandemente estudos celulares sob gradientes de oxigénio. Furthermore, um princípio de funcionamento semelhante pode ser aplicada para gerar gradientes de outros gases fisiologicamente relevantes, tais como o dióxido de carbono e óxido nítrico, para a cultura de células em estudos in vitro ^17. Esses recursos demonstrar que o PDMS-PC dispositivo micro mostra grande potencial para diversas aplicações de cultura de células, incluindo testes de drogas e proliferação celular e ensaios de migração, para avançar nos estudos de cultura de células in vitro.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Smartgene	6011-000
10 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Centrifuge Tube	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm Petri dish	Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
3 ml Syringe	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4'' Silicon Dummy Wafer	Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Acetone	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner	M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan	AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotic-Antimyotic solution	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Biopsy punch	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
Blunt needle	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Gauge 14
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	for cell counting
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	PH3101-000000-72EC
Cell Culture Incubator	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	for numerical simulation of chemical gradients in the device
D-PBS	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronectin from Human Plasma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Inverted Fluorescence Microscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMIL LED
Isopropyl Alcohol (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seoul, Korea	DBJ01B
Mechanical Convention Oven	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan	1943-0150
Plasma tretment system	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	for oxygen plasma surface treatment
Polycarbonate (PC) film	Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pyrogallol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Removable Adhesive Putty	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA
Spin Coater	ELS Technology, Hsinchu, Taiwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Developer	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Surgical blade	Feather, Osaka, Japan	5005093	for PDMS cutting
Syringe Pump	Chemyx, Houston, TX	Fusion 400
T75 Cell Culture Flask	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Nunc 156367
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621